電針對大鼠心肌缺血相關長鏈非編碼RNA及mRNA表達譜的影響※

薩喆燕 潘曉華 黃倩茹 萬隆 朱小香 董亞琴 許金森*

（福建省中醫(yī)藥研究院·福建省經絡感傳重點實驗室，福建福州350003）

電針對大鼠心肌缺血相關長鏈非編碼RNA及mRNA表達譜的影響※

薩喆燕 潘曉華 黃倩茹 萬隆 朱小香 董亞琴 許金森*

（福建省中醫(yī)藥研究院·福建省經絡感傳重點實驗室，福建福州350003）

目的探討電針對心肌缺血大鼠心肌組織長鏈非編碼RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）表達的影響。方法18只SD大鼠隨機分為模型組、電針組、生理鹽水對照組，每組6只。模型組、電針組大鼠經皮下多點位注射鹽酸異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）制備心肌缺血模型，電針組電針內關穴5 d，比較各組心電圖ECG偏移幅度；采用lncRNA芯片檢測電針組和模型組大鼠心肌組織lncRNA和mRNA的表達差異，篩選出電針治療心肌缺血相關的lncRNA；實時熒光定量PCR驗證3個隨機挑選的lncRNA。結果相較于模型組，電針組ECG偏移較小，差異表達的lncRNA共547個，mRNA738個，PCR驗證結果與芯片結果基本一致。結論與模型組比較，電針組大鼠lncRNA表達譜變化顯著，lncRNA可能在電針治療心肌缺血過程中發(fā)揮一定作用。

長鏈非編碼RNA；心肌缺血；電針；心肌缺血

冠狀動脈性心臟病，又稱缺血性心臟病，占我國城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，并呈逐年增加趨勢[1]。盡管人們對缺血性心臟病的認識不斷提高，醫(yī)療手段也在不斷進步，但該病仍嚴重影響人們的健康。國內外大量臨床證實，針刺治療心肌缺血的效應主要體現在緩解臨床疼痛癥狀、抗心率失常、提高患者生活質量以及改善預后等方面[2-4]，但機制仍未完全闡明。

長鏈非編碼核糖核酸(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸單位，不編碼蛋白質，但往往具有mRNA結構特征的小分子RNA。本研究采用鹽酸異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）造成心肌缺血大鼠模型，通過電針治療，對大鼠缺血心肌組織標本進行l(wèi)ncRNA/mRNA芯片分析，以期了解電針對缺血心肌組織中l(wèi)ncRNA表達的影響，為針刺治療心肌缺血的機制研究提供新的思路和線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組雄性SD大鼠18只，體質量230～250 g，清潔級，由福建省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(閩)2012-0001。飼養(yǎng)條件：溫度25℃，12 h明暗交替，自由攝食飲水。按隨機數字表法分為生理鹽水對照組、模型組、電針組，每組6只。

1.2 藥品與試劑ISO（美國Sigma公司）；RNA酶抑制劑（美國Epicentre公司）；RT緩沖液（美國Invitrogen公司）；PrimeScript逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；引物由上海康成生物工程有限公司設計并合成。

1.3 儀器Powerlab多導數據采集分析系統(tǒng)（澳大利亞埃德公司）；小動物麻醉呼吸系統(tǒng)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；7500 Fast Real-Time PCR System（美國Applied Biosystems公司）；梯度熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；NanoDrop 2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）。SDZ-II型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。lncRNA及mRNA基因芯片服務由上?？党缮锕咎峁?/p>

1.4 研究方法

1.4.1 動物造模大鼠連接小動物麻醉呼吸機，吸入異氟烷麻醉，通過多導生理記錄儀記錄正常狀態(tài)下大鼠心電圖ECG。按每日85 mg/kg劑量在大鼠四肢內側根部和背部注射ISO，連續(xù)注射2日。根據ECG出現T波由正向變?yōu)樨撓蚧虺孰p相，S-T段抬高確認造模成功。

1.4.2 干預措施電針組以0.25 mm×13 mm華佗牌無菌毫針直刺左側內關穴，連接SDZ-II電針儀，電壓5～10 V，以針體輕微抖動為度，疏密波，頻率2/10 Hz，每次20 min，每日1次。第2次注射ISO后24 h開始治療，連續(xù)5 d。生理鹽水對照組和模型組給予同等條件抓取，不做任何治療。

1.4.3 樣本采集干預結束后，大鼠腹腔注射過量10%水合氯醛處死，立即取新鮮左心室心肌組織-80℃保存用于lncRNA檢測。

1.4.4 ECG分析干預結束后分別記錄對照組、模型組、電針組大鼠的ECG，各取5個心動周期，以TP連線為基線，測量J點電位偏移和T波振幅變化，作為評價心肌缺血程度的指標。

1.4.5 芯片選擇采用美國Arraystar公司大鼠lncRNA微陣列芯片v2.0，能夠檢測13，611個lncRNAs和24，626個蛋白質編碼轉錄本。lncRNAs是從權威數據庫（包括NCBI RefSeq、Ensembl、LncRNAdb等）和高影響因子論文中收集的。

1.4.6 RNA提取取出新鮮凍存的心肌組織，剪成所需大小組織塊，Trizol一步法提取細胞中的總RNA。用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性；NanoDrop 2000分光光度計測定RNA在260 nm和280 nm波長的吸光度值，評估RNA量和質量。

1.4.7 微陣列分析從總RNA中移除rRNA后，得到mRNA。使用隨機引物法將每個樣品放大并轉錄成帶熒光的cRNA，標記好的cRNA在芯片上進行芯片雜交。清洗載片后，用AgilentDNAMicroarryScanner（G2505C）進行掃描。采用Agilent Feature Extraction軟件采集芯片探針信號值，在Agilent GeneSpring GX軟件中進行數據標準化處理和分析，得出電針組與模型組標記的信號比值（fold change），即為該基因組在電針組與模型組中的變化情況。最后經過t檢驗，按照fold change≥1.5，P＜0.05的標準進行篩選，得到差異表達的lncRNA和mRNA列表。對差異表達的mRNA進行基因本體GO分析，尋找表達異常的mRNA相關的生物學過程、細胞分子和疾病通路。隨機選取3個lncRNA進行實時熒光定量PCR驗證，以管家基因大鼠GAPDH基因為內參照，基因名稱和上、下游引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計學處理數據用（x±s）表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，進行正態(tài)檢驗，組間比較符合正態(tài)分布進行方差分析、LSD檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結果

2.1 ECG變化注射ISO后Ⅱ導聯ECG上可以觀察到ST段抬高，有時可見M波，并時常伴有一定程度的心律失常。干預處理后，模型組大鼠J點位移和T波振幅變化均顯著高于對照組（P＜0.01），而電針組J點位移和T波振幅變化則明顯低于模型組（P＜0.01），可見電針可以減輕大鼠心肌缺血程度，見表2。

表2 各組大鼠ECG比較（x±s）

2.2 lncRNA和mRNA的表達譜分析經過標準化處理，電針組與模型組比較，差異表達的lncRNA共547個，其中1.5倍以上上調的有203個，下調的有344個；差異表達的mRNA共738個，其中1.5倍以上上調的有288個，下調的有450個，見表3。部分表達異常的lncRNA和mRNA基因代碼及差異倍數見表4。

表3 電針組和模型組心肌組織中差異表達lncRNA和mRNA數（個）

表4 心肌組織中部分差異表達的lncRNA和mRNA

2.3 GO分析GO分析顯示差異表達的mRNA參與的生物過程，經過篩選，與心肌組織相關的生物過程主要有心肌組織發(fā)育調控、心肌細胞增值調控、心室肌細胞發(fā)育、心肌組織生長、心肌細胞增值等，富集分數最高的前10條見圖1。

圖1 心肌相關生物過程GO條目

2.4 實時熒光定量PCR驗證與模型組比較，電針組心肌組織lncRNAs差異表達與芯片結果一致。其中，lncRNA XR_596822表達水平升高，但差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；lncRNAXR_591485、lncRNA XR_597102表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 實時熒光定量PCR驗證結果

3 討論

缺血性心臟病的主要癥狀為胸悶、心悸、心絞痛等，均包涵在中醫(yī)的“胸痹”“心痛”“真心痛”等病證范疇中，因此古代中醫(yī)多按“胸痹心痛”辨證施治。《針灸大成·卷之九治癥總要》早有記載：“心胸疼痛，大陵、內關、曲澤?！?002年，世界衛(wèi)生組織在《針灸臨床研究報告的回顧與分析》中也肯定了冠心病是推薦針灸治療病種之一。目前，針刺治療心肌缺血的療效在臨床與動物實驗中得到不斷驗證，其相關機制研究也成為中醫(yī)現代化研究的一個熱點。研究表明針刺治療心肌缺血的機制可能與調節(jié)自主神經活動[5-6]、調節(jié)心肌細胞離子通道蛋白[7-8]、激活凋亡信號途徑[9]等相關。近年來，基因組學技術的快速發(fā)展為針刺治療心肌缺血的機制研究開辟了一條新思路，如通過基因芯片篩選發(fā)現，針刺內關穴對缺血心肌差異表達mRNA有良性調節(jié)趨勢，且主要參與氧化磷酸化、線粒體電子傳遞、能量代謝等過程[10]；MicroRNA(miRNA)也可能參與了電針防治心肌缺血的過程[11]。隨著新技術的發(fā)展和研究的不斷深入，非編碼RNA逐漸進入了人們的研究視野。

人類基因組中，非編碼RNA在轉錄組中的含量高達98%以上，而能編碼蛋白質的基因僅占1.2%，提示非編碼RNA在生物體內可能具備豐富的生物學功能[12]。lncRNA就是一類細胞內源性的非編碼RNA小分子，其長度超過200個核苷酸單位。lncRNA沒有完整開放閱讀框，不編碼蛋白質，但其本身具有mRNA的特點，可被剪切和多聚腺苷酸化，從而參與表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平調控基因的表達等過程[13-14]，在生理病理過程中發(fā)揮重要的調控作用[15-17]。

作為一種新的生物調控模式，lncRNA在缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展過程扮演了重要的角色，也越來越受到研究者的關注。尋找血清相關標志物是冠心病臨床研究的一大焦點。Cai等[18-19]通過臨床試驗比較分析了冠心病患者和正常人血漿，并采用Fisher標準建立診斷模型，發(fā)現外周血中l(wèi)ncRNA NONHSAT112178(LncPPARδ)和CoroMarker 2種lncRNAs，均可作為診斷冠心病的新型的血漿生物標志物。動物實驗中，Zou等[20]在心肌缺血大鼠模型中發(fā)現星狀神經節(jié)中l(wèi)ncRNA NONRATT021972明顯升高，應用小干擾RNA抑制lncRNA后，血清心肌酶水平顯著降低，星狀神經節(jié)中P2X7蛋白表達降低，從而改善心肌缺血程度。Wang等發(fā)現一種lncRNA——自噬促成因子（autophagy-promoting factor，APF），能夠與miR-188-3P和自噬相關基因7（ATG7）相互作用，影響心肌梗死程度[21]。由研究現狀可見，lncRNA參與了心肌缺血的調控過程，然而有關電針對心肌缺血大鼠心肌組織lncRNA表達的影響，則鮮有報道。

本研究應用lncRNA微陣列芯片同時檢測心肌缺血模型組和電針組大鼠心肌組織lncRNA和mRNA的表達水平，篩選電針治療心肌缺血相關lncRNA。結果發(fā)現表達差異的lncRNA共547個，其中203個上調，344個下調；表達差異的mRNA共738個，其中288個上調，450個下調。提示，lncRNA的差異表達可能與電針干預有著重要聯系。對差異表達mRNA進行GO分析，可以更好了解其功能。與心肌相關的生物過程，主要集中在心肌細胞發(fā)育、心肌細胞增殖等條目，提示電針干預可能通過調控心肌細胞增殖、分化調控心肌缺血過程。此外，對隨機挑選出的差異表達的3個lncRNA進行實時熒光定量PCR驗證，結果與芯片數據基本保持一致，提示了芯片檢測的可靠性。由此，結合國內外研究，提示lncRNA在電針治療心肌缺血過程中發(fā)揮了重要作用。

本研究從篩選差異表達lncRNA的視角對電針治療心肌缺血相關機制進行了探究，為電針治療心肌缺血的機制研究提供一條新線索。但要深入了解lncRNA的參與機制還需進一步結合生物信息學分析，挑選特異性lncRNA，并應用RNA干擾和基因過表達等技術進行l(wèi)ncRNA功能研究，以揭示電針治療心肌缺血的分子機制。

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Effects of Electroacupuncture on the Expression Profiles of Long Noncoding RNA and mRNA in Myocardial Tissue of Myocardial Ischemia in Rats

SA Zheyan,PAN Xiaohua,HUANG Qianru,WAN Long,ZHU Xiaoxiang,DONG Yaqin,XU Jinsen
(Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine·Key Laboratory of Propagated Sensation along Meridian of Fujian Province,Fujian Province, Fuzhou 350003,China)

Objective To explore the effect of electroacupuncture(EA)on expression profiles of long noncoding RNA of myocardial ischemia in rats.Methods 18 SD rats were randomly divided into myocardial ischemia model group,EA group and control group, with 6 rats in each group.Myocardial infarction was produced in rats with isoproterenol administered subcutaneously(sc)twice. Rats of EA group were treated with EA for 5 days.ECG in all rats were recorded.The expression profiles of lncRNA and mRNA of EA group compared with model group were analyzed through the rat lncRNA microarray.Quantitative real-time PCR was used to validate 3 selected lncRNAs.Results Voltage changes of the EA group were much lower than that of the model group.547 lncRNAs and 738 mRNA were identified to be different expression(fold change≥1.5).The results of real-time PCR were shown to be consistent with the microarray data.Conclusion Comparing with the model group,there are evidently differentially expressed profiles of lncRNA in EA group.LncRNA may play a role in the treatment of myocardial ischemia by EA.

long noncoding RNA;myocardial ischemia;electroacupuncture;Myocardial ischemia

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.16.061

1672-2779（2017）-16-0140-04

：李海燕本文校對：陳銘

2017-06-20）

國家自然科學基金資助課題【No.81001505】；國家自然科學基金資助課題【No.81403490】；福建省屬公益類科研院所基本科研專項資助課題【No.2015R1035-14】

*通訊作者：xujinsenjls@163.com