唐緋緋 趙玉琳 王培龍 馮德明 宋 怡 高彩球

(東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150040)

剛毛檉柳ThP5CR基因的克隆及抗逆功能分析*

唐緋緋 趙玉琳 王培龍 馮德明 宋 怡 高彩球

(東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150040)

吡咯啉-5-羧酸還原酶； 剛毛檉柳； 基因表達(dá)； 耐鹽； 抗旱

植物的抗逆性是數(shù)量性狀，涉及大量抗性基因的表達(dá)與調(diào)控作用，有著復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。因此，研究植物逆境表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)揭示植物抗逆機(jī)制至關(guān)重要。脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抗?jié)B透脅迫過程中起重要作用，主要通過穩(wěn)定生物膜的完整性、維持蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)、參與蛋白質(zhì)的折疊等生理生化過程發(fā)揮作用(Verbruggenetal., 2008)。研究表明脯氨酸具有清除活性氧的作用，提高了過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性； 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在鹽脅迫下植物脯氨酸的合成增加，可以使NADPH/NADP+保持低比值，進(jìn)而維持光反應(yīng)中心的電子流，穩(wěn)定氧化還原態(tài)，降低光合機(jī)構(gòu)的光抑制(陳吉寶等， 2010； Chavesetal., 2009)。

脯氨酸生物合成途徑首先在大腸桿菌(Escherichiacoli)上被闡明，目前植物體中存在2種脯氨酸合成途徑： 1)Glu途徑： 谷氨酸首先在γ-谷氨酰激酶(glutamylkinase)的催化下合成谷氨酰磷酸，其被還原成谷氨酸-半醛(GSA)，GSA再自發(fā)地環(huán)化形成吡咯啉-5-羧酸(P5C)，P5C最后在P5C還原酶(P5CR)催化下還原為脯氨酸(Székelyetal., 2008)。2)Orn途徑(氮素充足途徑)： 精氨酸由精氨酸酶(ARG)轉(zhuǎn)化為鳥氨酸。鳥氨酸通過δ-轉(zhuǎn)氨酶(δ-OAT)直接誘導(dǎo)發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)失去氨基后形成GSA，GSA再通過谷氨酸途徑最終在P5CR的催化作用下合成脯氨酸(Da Rochaetal., 2012)。表明P5CR在脯氨酸合成途徑中具有重要作用。目前已報(bào)道的P5CR有400多種，其中3個(gè)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)已被成功解析(Mengetal., 2006)。但目前對(duì)脯氨酸參與植物抗逆性的研究，多集中于△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(P5CS)，而對(duì)P5CR基因的抗逆功能研究非常少。

剛毛檉柳(Tamarixhispida)是生長在干旱沙漠中的樹種，它能吸收到深層的地下水，還有很強(qiáng)的抗鹽堿能力，能在含鹽0.5%～1%的鹽堿地上生長。因此鑒定和分離剛毛檉柳耐鹽抗旱基因并研究這些基因的抗逆功能具有重要意義(張道遠(yuǎn)等, 2003)。本研究從剛毛檉柳中克隆獲得ThP5CR基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析了ThP5CR基因響應(yīng)不同非生物脅迫(高鹽、干旱)和激素處理(ABA、GA3、JA)下的相對(duì)表達(dá)模式，進(jìn)一步構(gòu)建了ThP5CR基因過表達(dá)載體(pROKⅡ-ThP5CR)，將其在剛毛檉柳中瞬時(shí)表達(dá)，分析比較轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳和對(duì)照剛毛檉柳(轉(zhuǎn)pROKⅡ空載體)抗逆性差異，以初步鑒定ThP5CR基因功能。該研究為進(jìn)一步分析檉柳抗逆機(jī)制和P5CR基因的抗逆功能以及進(jìn)一步利用基因工程手段提高植物抗逆性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及脅迫處理

將剛毛檉柳種子播種于塑料筐中，栽培基質(zhì)為2∶1(V/V)的泥炭土和砂子混合基質(zhì)。溫室中培養(yǎng)，溫室平均溫度控制在24 ℃，光暗周期14 h/10 h，相對(duì)濕度在70%～75%。2個(gè)月生剛毛檉柳幼苗分別用0.4 mol·L-1NaCl、20%(W/V)PEG6000、100 μmol·L-1ABA、50 μmol·L-1GA3和100 μmol·L-1JA溶液進(jìn)行澆灌處理，處理時(shí)間為6，12，24，48，72 h。同時(shí)以正常澆水剛毛檉柳材料作為對(duì)照。脅迫處理后分別取剛毛檉柳根部和葉部組織。經(jīng)液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱用于RNA的提取。

1.2 檉柳ThP5CR基因的克隆和序列分析

以“Pyrroline 5 Carboxylate Reductase”作為關(guān)鍵詞，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的剛毛檉柳7個(gè)轉(zhuǎn)錄組的Unigenes BLAST比對(duì)結(jié)果進(jìn)行查找，獲得ThP5CR基因cDNA序列，通過ORF founder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.htmL)程序，綜合BLASTX比對(duì)結(jié)果確定其開放讀碼框，選擇具有完整ORF的ThP5CR基因，設(shè)計(jì)引物，引物序列為：ThP5CR-F:GAAGACAGCGATGTGGTTGTAT；ThP5CR-R:CTTC CCAATCGCTCCAAACAAT。以剛毛檉柳cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，進(jìn)一步測序確定所獲得的ThP5CR基因序列。對(duì)克隆獲得的ThP5CR基因進(jìn)行序列分析。用ProtParam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)軟件計(jì)算推導(dǎo)ThP5CR基因編碼蛋白質(zhì)的分子量及理論等電點(diǎn)。在NCBI上對(duì)剛毛檉柳ThP5CR基因進(jìn)行氨基酸序列同源比較，選取與剛毛檉柳ThP5CR基因同源性較高的9種植物的P5CR基因蛋白序列，利用BioEdit軟件進(jìn)行多序列比較，并利用MEGA軟件鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)預(yù)測系統(tǒng)發(fā)生樹。這9種植物分別是林煙草(Nicotianasylvestris)、煙草(Nicotianatabacum)、商陸(Phytolaccaacinosa)、番薯(Ipomoeabatatas)、菠菜(Spinaciaoleracea)、胡蘿卜(Daucuscarotasubsp.sativus)、甜菜(Betavulgarissubsp.vulgaris)、陽芋(Solanumtuberosum)和蕪菁(Brassicarapa)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

利用CTAB法提取剛毛檉柳不同組織總RNA，經(jīng)DNaseⅠ(Promega) 消化處理，去除DNA污染。分別取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和操作參照Primer ScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)(Takara)說明。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作Real time RT-PCR反應(yīng)模板。選擇剛毛檉柳β-tubulin、α-tubulin和β-Actin基因作為內(nèi)參基因。內(nèi)參和ThP5CR基因的定量PCR引物見表1。Real time RT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL，其中包括模板2 μL、基因特異性上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)和2×Power SYBR Green PCR master mix 10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，80 ℃讀板1 s，45個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸7 min。3次重復(fù)。反應(yīng)在MJ OpticonTM2儀器(BioRad Hercules.CA. USA.)上完成。實(shí)時(shí)定量RT-PCR數(shù)據(jù)利用2-△△CT法 (Livaketal., 2001)進(jìn)行分析。

表1 qRT-PCR和載體構(gòu)建的引物序列

1.4ThP5CR基因植物過表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)植物過表達(dá)載體pROKⅡ的多克隆位點(diǎn)及ThP5CR基因特征，設(shè)計(jì)引物時(shí)在ThP5CR基因5′端和3′端分別引入XbaⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以剛毛檉柳cDNA為模板，進(jìn)行ThP5CR基因RT-PCR克隆，RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括模板2 μL，基因特異性上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，dNTP Mix (10 mmol·L-1) 0.40 μL，10 ×LATaqPCR buffer 2.00 μL，LATaq(5 U·μL-1)0.25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸7 min。使用膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增目的片段進(jìn)行回收。用KpnⅠ和XbaⅠ酶分別對(duì)膠回收ThP5CR基因產(chǎn)物和pROKⅡ質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，分別回收后用T4連接酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆分別用基因引物(pROKⅡ-ThP5CR-F和pROKⅡ-ThP5CR-R)和載體引物(pROKⅡ-F和pROKⅡ-R)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。獲得ThP5CR基因過表達(dá)載體，命名為pROKⅡ-ThP5CR，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105。

1.5ThP5CR基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化剛毛檉柳及抗逆功能分析

根據(jù)Ji 等(2014)方法將構(gòu)建好的EHA105(pROKⅡ-ThP5CR)和EHA105(pROKⅡ)(空載體，作為對(duì)照)分別瞬時(shí)侵染剛毛檉柳，分別標(biāo)記為Con、OX。比較NaCl和甘露醇處理后2種瞬時(shí)表達(dá)剛毛檉柳的生理染色和生理指標(biāo)以綜合評(píng)定ThP5CR基因的抗逆功能。具體的步驟為： 將生長20～30天剛毛檉柳組培苗放入1.2 mol·L-1甘露醇中浸泡5～10 min(高滲透處理)，再分別迅速轉(zhuǎn)移至已加有菌種EHA105(pROKⅡ-ThP5CR)和EHA105(pROKⅡ)(空載體，作為對(duì)照)的侵染液中，放入恒溫振蕩器24 ℃，120 r·min-1侵染4 h。取出苗后，用無菌水洗滌3～4次，無菌濾紙吸干水分，將剛毛檉柳無菌苗接種于MS培養(yǎng)基上，放置于室溫為(22±2)℃、相對(duì)濕度為65%～75%、光強(qiáng)為400 μmol·m-2s-1的組織培養(yǎng)室共培養(yǎng)36 h。36 h后將瞬時(shí)侵染剛毛檉柳轉(zhuǎn)移至含200 mmol·L-1甘露醇、150 mol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行脅迫處理。分別收集脅迫處理12 h、24 h后的剛毛檉柳苗，用于組織化學(xué)染色、RNA提取和生理指標(biāo)分析。同時(shí)以正常MS培養(yǎng)基培養(yǎng)侵染后的植株作為對(duì)照。生理指標(biāo)分析包括脯氨酸、H2O2、MDA含量測定，生理染色包括氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、伊文思藍(lán)(Evans blue)染色(Zangetal., 2015; Silviaetal., 2012)。采用SPSS16.0軟件(SPSS,Chicago,Ⅱ,USA)分析差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1ThP5CR基因的克隆及序列分析

經(jīng)轉(zhuǎn)錄組序列查找和進(jìn)一步的RT-PCR克隆驗(yàn)證，證實(shí)克隆獲得了檉柳ThP5CR基因，其cDNA長度為1 432 bp，其中開放閱讀框長度為822 bp，編碼273個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量(molecular weight)為28.29 kDa； 理論等電點(diǎn)(theoretical pI)為9.22。Pfam分析結(jié)果表明，檉柳P5CR基因具有典型P5CR結(jié)構(gòu)域； N端是具有催化功能的NADP結(jié)構(gòu)域，C端是具有二聚體功能的P5CR結(jié)構(gòu)域。此外還有典型的PDH脯氨酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域、谷氨酸激酶結(jié)構(gòu)域等。

選擇9種與剛毛檉柳ThP5CR蛋白同源性較高的已知P5CR蛋白序列，利用BioEdit軟件和MEGA軟件分別進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示10種植物的P5CR蛋白序列在圖中標(biāo)記的N端的NADP結(jié)構(gòu)域和C端的P5CR二聚體結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守，PDH脯氨酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域和谷氨酸激酶結(jié)構(gòu)域也相對(duì)保守，而在225到230之間部分氨基酸序列不一致，但總體來說10種植物P5CR蛋白的氨基酸序列均較保守且序列長度也較相近(圖1A)，氨基酸序列一致性在75%～ 84%。其中剛毛檉柳ThP5CR蛋白與商陸、菠菜和甜菜的P5CR蛋白的同源性較高，氨基酸序列一致性分別可達(dá)84%、81%和80%。進(jìn)化樹分析結(jié)果也顯示，剛毛檉柳與商陸、菠菜和甜菜親緣關(guān)系較近，歸為一組(圖1B)。

2.2 不同處理下剛毛檉柳ThP5CR基因的表達(dá)

2.2.1 不同脅迫下ThP5CR基因的表達(dá) 為了初步分析ThP5CR基因的功能，利用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR分析了PEG和NaCl脅迫處理后剛毛檉柳ThP5CR基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，PEG脅迫下，葉組織中ThP5CR基因表達(dá)在脅迫早期變化不明顯，脅迫24 h后表達(dá)量才明顯下調(diào)，隨后又逐漸增高，脅迫72 h后表達(dá)量是對(duì)照的2.73倍； 根組織中，ThP5CR基因的表達(dá)受PEG脅迫的快速誘導(dǎo)，脅迫6 h時(shí)，表達(dá)量即為對(duì)照的12.7倍， 隨后表達(dá)量逐漸被抑制，至72 h表達(dá)量最低，僅為對(duì)照的4.6%。NaCl脅迫下，檉柳葉組織中ThP5CR基因的表達(dá)變化主要表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，24 h表達(dá)量最低，僅為對(duì)照的14.5%； 根中則相反，主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)表達(dá)，6 h表達(dá)量最高，是對(duì)照的24.25倍(圖2)。

圖1 檉柳P5CR蛋白與其他植物P5CR蛋白的多序列比對(duì)(A)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(B)Fig.1 Multiple alignment(A) and clustering analysis(B) of P5CR proteins in Tamarix hispida and other 9 plant speciesNsP5CR： 林煙草Nicotiana sylvestris(XP_009773755); NtP5CR： 煙草Nicotiana tabacum(XP_016465541); PaP5CR： 商陸Phytolacca acinosa(ACT37661); IbP5CR： 番薯Ipomoea batatas(ADY77003); SoP5CR： 菠菜 Spinacia oleracea(KNA12919); DcP5CR： 胡蘿卜Daucus carota subsp. sativus(XP_017255032); BvP5CR： 甜菜Beta vulgaris subsp. vulgaris(XP_010672976); StP5CR： 陽芋 Solanum tuberosum(XP_006365049); BrP5CR： 蕪菁Brassica rapa(XP_009121629).

圖2 非生物脅迫處理下檉柳ThP5CR基因表達(dá)分析Fig.2 Expression analysis of ThP5CR in Tamarix hispida under abiotic stresses

2.2.2 不同激素處理下ThP5CR基因的表達(dá) ABA處理后，與NaCl脅迫相似，葉中ThP5CR基因表達(dá)主要為下調(diào)表達(dá)，其中6 h表達(dá)量最低，為對(duì)照的0.11%； 根組織中，在大部分脅迫時(shí)間點(diǎn)都明顯被上調(diào)表達(dá)，同樣能對(duì)ABA處理作出快速應(yīng)答，在脅迫6 h表達(dá)量即最高，為對(duì)照的49.66倍。JA處理下，葉中ThP5CR基因在脅迫早期(12 h之前)受明顯抑制，脅迫24 h以后表達(dá)上調(diào)，但和對(duì)照相比，差異不明顯； 根中也主要表現(xiàn)為受抑制(48 h前)，但脅迫72 h表達(dá)明顯受誘導(dǎo)，為對(duì)照的8.88倍。與其他幾種脅迫相比，GA3處理下，ThP5CR基因表達(dá)量變化小一些，但無論根還是葉中，在所研究的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，都至少有2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，表達(dá)量發(fā)生了明顯改變： 葉中脅迫24 h表達(dá)被明顯誘導(dǎo)(為對(duì)照的3.10倍)，48 h表達(dá)明顯被抑制(為對(duì)照的18.9%)； 根中6 h和48 h都被明顯誘導(dǎo)，而脅迫72 h，表達(dá)量則明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明，ThP5CR基因能對(duì)上述5種處理作出應(yīng)答，但表達(dá)模式不完全相同(圖3)。

2.3ThP5CR基因抗逆功能研究

2.3.1 瞬時(shí)表達(dá)剛毛檉柳的獲得 為了初步探究ThP5CR基因抗逆功能，將構(gòu)建成功的重組載體pROKⅡ-ThP5CR進(jìn)行剛毛檉柳瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，同時(shí)以pROKⅡ瞬時(shí)侵染剛毛檉柳作為對(duì)照。提取2種瞬時(shí)侵染剛毛檉柳總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qRT-PCR分析瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因株系中ThP5CR基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，非脅迫條件下，瞬時(shí)過表達(dá)ThP5CR檉柳中該基因的表達(dá)量是對(duì)照的1.97倍。而150 mmol·L-1NaCl和200 mmol·L-1甘露醇脅迫12 h后過表達(dá)株系中ThP5CR基因的表達(dá)量分別是對(duì)照的41.2倍和35.5倍。表明成功獲得了瞬時(shí)過表達(dá)ThP5CR基因剛毛檉柳(圖4)。

圖3 不同激素處理下檉柳ThP5CR基因表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of ThP5CR in Tamarix hispida under different hormone treatments

圖4 非生物脅迫下檉柳ThP5CR基因的表達(dá)Fig.4 Expression analysis of ThP5CR in Tamarix hispida after abiotic stressCon: pROKⅡ空載對(duì)照; OX:pROKⅡ-ThP5CR過表達(dá)植株。下同。Con: Plants transformed with empty pROKⅡ; OX: Plants transformed with overexpression of pROKⅡ-ThP5CR. The same below.

圖5 非生物脅迫下剛毛檉柳轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照NBT、DAB和Evans blue染色比較Fig.5 NBT, DAB and Evans blue staining comparisons between transgenic and control Tamarix hispida under abiotic stress1: DAB, NBT和 Evans blue沒有進(jìn)行脅迫處理的Con, OX的染色結(jié)果; 2∶150 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1 甘露醇12 h脅迫處理后Con, OX的染色結(jié)果。1: NBT, DAB and Evans blue staining of Con, OX plants without treatment; 2: The staining of Con, OX plants treated with 150 mmol·L-1 NaCl and 200 mmol·L-1mannitol for 12 h.

圖6 非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳和對(duì)照剛毛檉柳的生理指標(biāo)比較Fig.6 The comparison of physiological indicators between transgenic Tamarix hispida and control under abiotic stresses

2.3.3 生理指標(biāo)的測定 為了探究ThP5CR的抗逆功能，進(jìn)一步分析比較了NaCl和甘露醇脅迫后過表達(dá)ThP5CR基因剛毛檉柳和對(duì)照的脯氨酸含量、H2O2含量和MDA含量。結(jié)果(圖6)顯示，非脅迫處理?xiàng)l件下，OX株系的脯氨酸含量略高于對(duì)照，H2O2含量和MDA含量略低于對(duì)照，但差異不顯著。而在150 mmol·L-1NaCl和200 mmol·L-1甘露醇脅迫后，瞬時(shí)過表達(dá)ThP5CR植株的脯氨酸含量明顯高于對(duì)照植株，H2O2含量和MDA含量明顯低于對(duì)照植株，表明脅迫條件下，瞬時(shí)過表達(dá)株系的膜脂氧化程度降低，抗逆能力提高。提示ThP5CR基因可能是一個(gè)抗旱耐鹽能力優(yōu)良的候選基因。

3 討論

3.1P5CR基因的結(jié)構(gòu)與逆境脅迫下的表達(dá)

P5CR(吡咯啉-5-羧酸還原酶)是植物乃至生物體內(nèi)的一種保守蛋白，其作用是催化脯氨酸生物合成的最后一步，即在NAD(P)H的作用下，將吡咯啉-5-羧酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸。本研究從剛毛檉柳中克隆得到ThP5CR基因，該基因C端含有典型的P5CR二聚體結(jié)構(gòu)域，N端含有NADP結(jié)構(gòu)域，此外還有典型的PDH脯氨酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域、谷氨酸激酶結(jié)構(gòu)域等。選取胡蘿卜等10種植物的P5CR氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)與進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，P5CR蛋白氨基酸序列保守性較高，NADP結(jié)構(gòu)域和P5CR二聚體結(jié)構(gòu)域都是高度保守的結(jié)構(gòu)域，這與Nocek等(2005)報(bào)道的結(jié)果一致。Ruszkowski等(2015)對(duì)蒺藜苜蓿 (Medicagotruncatula) MtP5CR蛋白的十倍體晶體結(jié)構(gòu)和其產(chǎn)物NAD+、NADP+和L-Proline進(jìn)行X射線研究表明，NADPH被認(rèn)為是MtP5CR在體外的唯一輔酶。

實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析ThP5CR基因在不同的脅迫處理后剛毛檉柳葉和根中的表達(dá)情況，結(jié)果表明5種不同處理均能產(chǎn)生不同程度的影響，尤其是PEG、NaCl和ABA處理后，根和葉中ThP5CR基因表達(dá)在大部分脅迫時(shí)間點(diǎn)都發(fā)生了明顯改變。此外，ABA激素處理下的基因表達(dá)趨勢與NaCl脅迫下表達(dá)趨勢相似，且ABA激素處理下的基因表達(dá)變化更為明顯，表明剛毛檉柳ThP5CR基因可能參與ABA信號(hào)途徑相關(guān)的NaCl脅迫應(yīng)答。以往研究也表明P5CR基因的表達(dá)受PEG、NaCl和ABA等處理的影響，如Cao等(2015)對(duì)多年生黑麥草(Loliumperenne)進(jìn)行PEG、NaCl和ABA處理，發(fā)現(xiàn)黑麥草LpP5CR基因的表達(dá)明顯受3種處理影響，且影響最為明顯的時(shí)間點(diǎn)均為上調(diào)表達(dá)。在日中花(Mesembryanthemumnodiflorum)中，在400 mmol·L-1NaCl處理后P5CR的活性是未處理的4倍(Lalibertéetal., 1989)。

3.2P5CR基因的抗逆功能

脯氨酸不僅是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還是一種非常有效的抗氧化劑，并且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)(Rodriguezetal., 2005)。P5CS和P5CR是合成脯氨酸途徑的重要基因，但在P5CR基因方面研究的甚少，但目前發(fā)現(xiàn)P5CR是合成脯氨酸過程中重要的中間酶，催化P5C(吡咯啉-5-羧酸)轉(zhuǎn)化為脯氨酸，且可以通過Glu、Orn 2種途徑轉(zhuǎn)化為脯氨酸； 最近發(fā)現(xiàn)植物P5CR基因是通過輔酶的實(shí)用性、抑制產(chǎn)物和離子效應(yīng)等復(fù)雜機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，這些機(jī)制可以使植物酶廣泛響應(yīng)由任一P5CS同工酶或OAT合成的P5C，而無需一個(gè)轉(zhuǎn)錄控制，大大提高了合成脯氨酸的轉(zhuǎn)化效率(Gibertietal., 2014)。因此P5CR基因具有非常高的研究價(jià)值和廣闊的研究前景。

對(duì)剛毛檉柳ThP5CR基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，0.4 mol·L-1NaCl處理下，葉中ThP5CR基因的表達(dá)明顯低于對(duì)照。對(duì)2種瞬時(shí)侵染剛毛檉柳的ThP5CR基因表達(dá)分析也顯示150 mmol·L-1NaCl處理下，對(duì)照剛毛檉柳中ThP5CR基因的表達(dá)也低于非脅迫處理，而脅迫后脯氨酸含量無明顯差異。但甘露醇脅迫后ThP5CR基因的表達(dá)趨勢與NaCl脅迫類似，而脯氨酸的含量明顯低于對(duì)照。這可能由于剛毛檉柳對(duì)NaCl和甘露醇脅迫的響應(yīng)機(jī)制不同，ThP5CR基因可能在蛋白水平應(yīng)對(duì)2種脅迫的調(diào)控機(jī)制不同。NaCl脅迫不僅是滲透脅迫而且還會(huì)產(chǎn)生離子毒害，以往研究表明，P5CR基因受輔酶的實(shí)用性、抑制產(chǎn)物和離子效應(yīng)等復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控，這些機(jī)制可能對(duì)2種脅迫產(chǎn)生的作用也會(huì)有所不同(Gibertietal., 2014)。

此外，脯氨酸作為20種蛋白氨基酸之一，如果能抑制其合成，則能從一定程度上抑制植物的生長甚至致死。在抑制方面的研究，如Forlani等(2013)報(bào)道了26個(gè)氨基甲叉基雙膦酸類衍生物對(duì)P5CR具有抑制作用。還有研究表明，由于在MtP5CR結(jié)構(gòu)的活性中心發(fā)現(xiàn)了一些丙磺酸分子，提出了4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)也可作為P5CR的抑制劑。在后期研究中會(huì)進(jìn)一步構(gòu)建抑制表達(dá)載體，進(jìn)而全面研究P5CR基因功能。

4 結(jié)論

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

Cloning and Stress Tolerance Analysis ofThP5CRfromTamarixhispida

Tang Feifei Zhao Yulin Wang Peilong Feng Deming Song Yi Gao Caiqiu

(StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreedingNortheastForestryUniversityHarbin150040)

pyrroline 5-carboxylate reductase；Tamarixhispida； gene expression； salt tolerance； drought resistance

10.11707/j.1001-7488.20170701

2016-08-15；

2016-12-27。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA102701)。

S718.46

A

1001-7488(2017)07-0001-09

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