過表達(dá)TIPE2上調(diào)BID分子促進(jìn)H446細(xì)胞凋亡

王方南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部

過表達(dá)TIPE2上調(diào)BID分子促進(jìn)H446細(xì)胞凋亡

王方
南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部

目的觀察TIPE2過表達(dá)對(duì)小細(xì)胞肺癌H 446細(xì)胞凋亡相關(guān)分子BID的影響。方法建立TIPE2過表達(dá)的H 446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，利用熒光顯微成像技術(shù)和W estern Blot技術(shù)分別檢測(cè)TIPE2過表達(dá)情況和細(xì)胞凋亡相關(guān)分子BID的變化。結(jié)果TIPE2質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)H 446細(xì)胞高表達(dá)TIPE2基因和綠色熒光蛋白。TIPE2過表達(dá)的H 446細(xì)胞促凋亡分子BID表達(dá)增多，顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡明顯。結(jié)論過表達(dá)TIPE2基因引起B(yǎng)ID上調(diào)，并促進(jìn)小細(xì)胞肺癌H 446凋亡。

TIPE2；細(xì)胞凋亡；BID

肺癌的發(fā)病率和死亡率是惡性腫瘤之首[1]。肺癌的發(fā)生發(fā)展是由一系列腫瘤相關(guān)分子反饋性作用于下游靶分子調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移過程。其中細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等過程的改變普遍認(rèn)為是影響以上過程的的關(guān)鍵機(jī)制。BID是Bcl-2家族重要成員，促進(jìn)細(xì)胞程序性凋亡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。

TIPE2基因是維持機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境平衡的重要基因之一[3]，在細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用。TIPE2抑制肝癌遷移和胃癌增殖在腫瘤生長(zhǎng)方面主要發(fā)揮抑癌效應(yīng)[4-5]，但其在肺癌發(fā)展中的作用研究較少。因此，本研究以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)建立TIPE2過表達(dá)H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，探討TIPE2過表達(dá)對(duì)細(xì)胞促凋亡分子BID的影響以及細(xì)胞凋亡情況，以期探討TIPE2在小細(xì)胞肺癌中的負(fù)調(diào)控促凋亡作用。

1.材料與方法

1.1 主要試劑與細(xì)胞細(xì)胞：人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H446。購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院。試劑：Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。G418 sulfate、預(yù)染蛋白Marker和化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自上海生工公司。鼠抗TIPE2購(gòu)自美國(guó)Abnova公司，鼠抗tubulin抗體、兔抗BID抗體、HRP-羊抗兔抗體和HRP-驢抗鼠抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 建立TIPE2過表達(dá)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)分組完全培養(yǎng)基接種H446細(xì)胞，待培養(yǎng)80-90%匯合度時(shí)換無血清培養(yǎng)基。將新鮮Lipofectamine 2000-GFP-TIPE2混合物培養(yǎng)8小時(shí)，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后，G418篩選細(xì)胞一周左右，繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單克隆H446-TIPE2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)分為H446組、H446-Vector組和H446-TIPE2組。

1.3 蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)BID蛋白表達(dá)按標(biāo)準(zhǔn)流程收集細(xì)胞冰上裂解，離心收集蛋白上清，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%封閉液室溫封閉2小時(shí)，特異性單克隆一抗4℃孵育過夜，含吐溫20的TBST洗3次后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2小時(shí)，ECL顯影液反應(yīng)、曝光，掃描膠片觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 TIPE2引物序列及RT-PCR技術(shù)

TIPE2：sense5`-GGAACATCCAAGGCAAGACTG-3`

antisense5`-AGCACCTCACTGCTTGTCTCATC-3`

按照Tarkara試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)流程提取總RNA，合成cDNA，配制PCR反應(yīng)液，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

2.結(jié)果

2.1 H446過表達(dá)TIPE2表達(dá)鑒定RT-PCR結(jié)果顯示三組細(xì)胞僅H446-TIPE2細(xì)胞檢測(cè)到TIPE2mRNA高表達(dá)，其他兩組細(xì)胞基本無表達(dá)（見圖1）。提示H446過表達(dá)TIPE2細(xì)胞株構(gòu)建成功，TIPE2高表達(dá)。

圖1 H446過表達(dá)TIPE2細(xì)胞株的鑒定

2.2 過表達(dá)TIPE2對(duì)促凋亡分子BID表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響Western blot結(jié)果顯示H446-Vector和H446-TIPE2細(xì)胞在內(nèi)參Actin的參照下，均表達(dá)促凋亡分子BID。且H446-TIPE2細(xì)胞BID水平高于H446-Vector細(xì)胞（見圖2-A）。顯微鏡結(jié)果顯示過表達(dá)H446-TIPE2細(xì)胞凋亡萎縮壞死部分懸浮，而H446-Vector細(xì)胞輪廓清晰呈梭形貼壁生長(zhǎng)（見圖2-B）。以上結(jié)果表明過表達(dá)TIPE2上調(diào)BID并引起細(xì)胞凋亡壞死。

圖2 過表達(dá)TIPE2對(duì)BID表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響（A.蛋白免疫印跡檢測(cè)BID蛋白表達(dá)B.顯微成像觀察細(xì)胞凋亡作用）

3.討論

TIPE2是新型免疫負(fù)調(diào)控分子，研究發(fā)現(xiàn)TIPE2通過抑制TNF-α所致的NF-κB、Erk信號(hào)激活，抑制MMP-3和MMP-13表達(dá)發(fā)揮負(fù)調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移的作用[4]。也有研究證實(shí)小鼠肺癌LLC細(xì)胞中TIPE2表達(dá)水平明顯低于正常肺組織[6]。本研究通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染系統(tǒng)建立H446-TIPE2過表達(dá)細(xì)胞株可為探討TIPE2在肺癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)作用研究奠定細(xì)胞基礎(chǔ)。

線粒體凋亡是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡壞死的重要途徑。BID是Bcl-2家族促凋亡蛋白，活化的BID蛋白可與促凋亡蛋白Bax、Bak等結(jié)合誘導(dǎo)線粒體蛋白釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7-8]?；罨腂id蛋白也可通過與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl等結(jié)合，減弱其抗凋亡作用[9]。本課題研究發(fā)現(xiàn)TIPE2通過上調(diào)BID表達(dá)的線粒體凋亡途徑引起H446肺癌細(xì)胞凋亡，但TIPE2上調(diào)BID表達(dá)的分子機(jī)制有待下一步研究發(fā)現(xiàn)。

[1]陳萬青,鄭榮壽,張思維,等.2013年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國(guó)腫瘤,2017；26（1）：1-7.

[2]梁博,王新軍,周少龍.膠質(zhì)瘤組織中CPEB4和Bcl-xl的表達(dá)及預(yù)后影響因素分析[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2013；48（5）：605.

[3]Sun H,Gong S,Carmody RJ,etal.TIPE2,a negative regulator of innate and adaptive immunity thatmaintains immune homeostasis [J].Cell,2008；133（3）：415-26.

[4]Zhang YH,Yan HQ,Wang F,etal.TIPE2 inhibits TNF-α-induced hepatocellular carcinoma cellmetastasis via Erk1/2 downregulation and NF-κB activation[J].International Journal of Oncology, 2015；46：254-264.

[5]Zhao Q,Zhao M,Dong T,et al.Tumor necrosis factor-α-induced protein-8 like-2（TIPE2）upregulates p27 to decrease gastric cancer cellproliferation[J].JCell Biochem,2015；116（6）：1121-1129.

[6]Liu QQ,Zhang FF,Wang F,etal.TIPE2 Inhibits Lung Cancer Growth Attributing to Promotion of Apoptosis by Regulating Some Apoptotic Molecules Expression[J].PLoS ONE,2015；10（5）：e0126176.doi：10.1371/journal.pone.0126176

[7]WEIMC,LINDSTEN T,MOOTHA VK,et al.tBID,a membrane-targeted death ligand,oligomerizes BAK to release cytochrome [J].DenesDev,2000；14（16）：2060-2071.

[8]LIHL,ZHU H,XU CJ,et al.Cleavage of BID by caspase-8 mediates themitochondrial damage in the Fas pathway ofapoptosis[J]. Cell,1998；94（4）：491-501.

[9]LOU X,BUDIHARDJO I,ZOU H,etal.Bid,a Bcl-2 interacting protein,mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors[J].Cell,1998；94（4）：481-490.

TIPE2 cou ld up-regu late BID to p rom o te cell apop tosis on H446

W ang Fang
Departmentof Basic M edicine Science,NanYang MedicalCollege

南陽市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2015KJGG18）資助。

王方，女，碩士研究生學(xué)歷，腫瘤免疫藥理學(xué)方向，南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)部。