宋剛，雷小燦，李莉，彭莉

耐力訓(xùn)練C57BL/6J小鼠工作肌ATGL的變化及信號(hào)分子cAMP和PPAR-γ的影響

宋剛1，2，雷小燦3，李莉4，彭莉1，2

目的：1）了解耐力訓(xùn)練不同時(shí)間點(diǎn)C57BL/6J小鼠ATGL基因和蛋白表達(dá)的變化；2）腹腔注射cAMP的激活劑Forskolin、PPAR-γ的抑制劑T0070907、觀察耐力訓(xùn)練后ATGL的表達(dá)，探究ATGL變化可能的信號(hào)分子機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)1， C57BL/6J小鼠跑臺(tái)耐力訓(xùn)練訓(xùn)練4周，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定腓腸肌和比目魚(yú)肌ATGL基因和蛋白表達(dá)的變化；實(shí)驗(yàn)2，采用跑臺(tái)耐力訓(xùn)練小鼠4周，分別每天腹腔注射forskolin、T0070907和DMSO，測(cè)定腓腸肌和比目魚(yú)肌ATGL基因和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：1）耐力運(yùn)動(dòng)引起比目魚(yú)肌ATGL基因和蛋白表達(dá)量出現(xiàn)上升（P＜0.05），并且在第4周運(yùn)動(dòng)組的ATGL基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（ P＜0.05）；第3、第4周ATGL蛋白表達(dá)都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；2）耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)腓腸肌ATGL基因和蛋白表達(dá)出現(xiàn)上升（P＜0.05），耐力訓(xùn)練第3周和4周ATGL基因和蛋白表達(dá)量運(yùn)動(dòng)組顯著高于對(duì)照組（ P＜0.05）；3）4周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，forskolin組的ATGL基因和蛋白表達(dá)無(wú)論是比目魚(yú)肌還是腓腸肌都出現(xiàn)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），T0070907組的腓腸肌中ATGL基因和蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；4）在4周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，forskolin組的ATGL基因表達(dá)腓腸肌顯著高于比目魚(yú)?。≒＜0.05）。結(jié)論：耐力訓(xùn)練會(huì)引起C57BL/6J小鼠比目魚(yú)肌和腓腸肌中的ATGL基因和蛋白表達(dá)上升，信號(hào)分子cAMP和PPAR-γ參與了這一過(guò)程。

小鼠；脂肪甘油三酯脂肪酶；信號(hào)分子；耐力訓(xùn)練

甘油三酯（脂肪）通過(guò)氧化作用為機(jī)體活動(dòng)供能，其途徑是水解為游離脂肪酸（free fatty acid ，F(xiàn)FA），F(xiàn)FA在肉毒堿的幫助下進(jìn)入線粒體，再通過(guò)β-氧化途徑為機(jī)體活動(dòng)提供能量，甘油三酯是耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練過(guò)程中重要的能源物質(zhì)［15］。運(yùn)動(dòng)中骨骼?。üぷ骷。┲痉纸饧爸狙趸{(diào)控的機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多個(gè)蛋白質(zhì)和酶（系）的參與。近年來(lái)，對(duì)脂肪代謝上游即脂肪水解調(diào)控機(jī)制的研究，尤其是通過(guò)基因敲除小鼠的研究證實(shí)，脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase， ATGL）亦是一種關(guān)鍵的脂肪水解酶，工作肌內(nèi)甘油三酯水解的研究逐漸受到運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)科研人員的關(guān)注［6，18］。ATGL在生物體內(nèi)廣泛存在，其作用主要是降解細(xì)胞內(nèi)的脂肪，使其成為自由脂肪酸，也是調(diào)節(jié)脂肪水解的一種關(guān)鍵酶。ATGL和激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL）都是脂肪組織和骨骼肌進(jìn)行高效的脂肪分解必不可少的酶，其活性和表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)受到轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平的調(diào)控。ATGL介導(dǎo)的脂解過(guò)程可能與肥胖、糖尿病、脂肪肝等代謝疾病存在關(guān)聯(lián)［2，17］。

不同運(yùn)動(dòng)（訓(xùn)練）方式會(huì)引發(fā)機(jī)體對(duì)能量代謝方式的選擇及底物消耗速率出現(xiàn)差異，耐力運(yùn)動(dòng)需要持續(xù)能量供給，肌內(nèi)甘油三酯（Intramuscular fat，IMTG）為收縮肌的ATP產(chǎn)生提供了底物，為運(yùn)動(dòng)供能［2，17］。已有文獻(xiàn)表明，耐力運(yùn)動(dòng)后，人體實(shí)驗(yàn)工作肌ATGL出現(xiàn)基因和蛋白上升的變化趨勢(shì)。對(duì)10名健康男子進(jìn)行8周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，骨骼肌活檢液進(jìn)行蛋白印跡測(cè)定，結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起骨骼肌ATGL蛋白表達(dá)上升2倍，同時(shí)IMTG明顯下降，而HSL變化卻不顯著［4］。在轉(zhuǎn)基因小鼠中也發(fā)現(xiàn)相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ATGL（-/-）小鼠的最大跑臺(tái)速度和耐力運(yùn)動(dòng)能力分別減少42%和46%［8］。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耐力大鼠工作肌ATGL基因表達(dá)顯著性上升［3］，提示ATGL在運(yùn)動(dòng)時(shí)脂肪水解氧化供能中起了重要的作用，是運(yùn)動(dòng)時(shí)水解脂肪供能的限速因素，但其變化的機(jī)制并不為人所知，有待繼續(xù)研究。這讓人思考，是哪些因素誘發(fā)耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練ATGL基因表達(dá)上升，同時(shí)對(duì)ATGL蛋白分泌產(chǎn)生正向影響？有哪些信號(hào)分子參與耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練ATGL上升過(guò)程，也就是通過(guò)的分子信號(hào)途徑是什么？

已知的是，cAMP（激動(dòng)劑Forskolin）和PPAR-γ（抑制劑T0070907）兩個(gè)信號(hào)分子對(duì)ATGL的表達(dá)具有影響［13］。為了保持實(shí)驗(yàn)的延續(xù)性，本研究小鼠重復(fù)了（前期大鼠）耐力訓(xùn)練工作肌ATGL變化的試驗(yàn)，然后再通過(guò)信號(hào)分子的干擾劑（Forskolin和T0070907）作用于cAMP和PPAR-γ，來(lái)探究耐力訓(xùn)練ATGL的變化是否通過(guò)cAMP和PPAR-γ信號(hào)分子途徑，尋找其中的因果性關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.1.1 耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（試驗(yàn)1）

6周齡雄性健康SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，80只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)均分為運(yùn)動(dòng)組（n=40）和對(duì)照組（n=40），運(yùn)動(dòng)組（E組）和對(duì)照組（C組）再分別隨機(jī)平均為5組，體重203～229 g。常規(guī)分籠，用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料，自由飲食，動(dòng)物房室溫20～23℃，相對(duì)濕度50%～70%，每日光照時(shí)間為12 h。

訓(xùn)練模型按《科學(xué)》雜志2006年報(bào)道小鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷結(jié)合實(shí)際略加調(diào)整［6］，其運(yùn)動(dòng)方案為采用C57BL/6J小鼠，進(jìn)行耐力測(cè)定，具體負(fù)荷為以5%坡度、16 m/min的跑速運(yùn)動(dòng)，直至疲勞。本研究利用其運(yùn)動(dòng)方式即5%坡度、16 m/min跑速的耐力跑臺(tái)（跑臺(tái)型號(hào)：正華ZHPT 型）運(yùn)動(dòng)，進(jìn)行訓(xùn)練。

訓(xùn)練安排：訓(xùn)練期共達(dá)5周，第1周為適應(yīng)性訓(xùn)練（習(xí)慣動(dòng)物跑臺(tái)，5 min為宜），正式訓(xùn)練4周，每周訓(xùn)練6天，訓(xùn)練時(shí)間在早上8：00～12：00。正式訓(xùn)練為以16 m/min （5%度坡度） 進(jìn)行40 min跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

處死方式及取材：斷頭處死，處死后即刻取腓腸肌取其表層中段，比目魚(yú)肌全部，取材操作在冰上操作完成。

1.1.2 耐力訓(xùn)練信號(hào)分子干預(yù)試驗(yàn)（試驗(yàn)2）

6周齡C57BL/6J小鼠30只，隨機(jī)分為3組（Forskolin組、T0070907組和對(duì)照組），每組10只，訓(xùn)練方案按試驗(yàn)1所述方案開(kāi)展。Forskolin組適應(yīng)運(yùn)動(dòng)4周，腹腔注射Forskolin（Sigma）溶液，每只每天注射劑量為5 mg/kg； T0070907組適應(yīng)運(yùn)動(dòng)4周，每只小鼠每天注射T0070907（Sigma），劑量為1.5 mg/kg［1］；對(duì)照組進(jìn)行適應(yīng)運(yùn)動(dòng)4周，每只腹腔注射DMSO（Sigma），每只每天注射劑量為5 mg/kg。

Forskolin溶液的使用方案為5 mg/kg，DMSO作為溶劑。T0070907（1.5 mg/kg）制作溶解于DMSO并用正常的生理鹽水稀釋到DMSO的濃度達(dá)到0.5%。

1.2 RNA的提取和QRT-PCR

4周耐力訓(xùn)練結(jié)束后次日，3組小鼠用斷頭處死分別速取左下肢腓腸肌，比目魚(yú)肌，采用Trizol法提取的總RNA（OMEGA公司）。RNA提取后，通過(guò)分光光度計(jì)及電泳檢測(cè)其純度和完整性，并置于－80℃下保存?zhèn)溆?。按照一步快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)得到的cDNA通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)后將其濃度調(diào)至100 ng/uL。

qRT-PCR的反應(yīng)體系為20 μL：100 ng cDNA、10 μL 2×FastStart Universal SYBR GreenMaster（ROX）、0.6 μL Primer F/R（10 μmol/L）、8.4 μL RNase Free water。反應(yīng)條件為：95℃，10 min；95℃，15 s，60℃ （或55℃）1 min，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，運(yùn)用2-△△Ct的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。用內(nèi)參beta-actin對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 引物設(shè)計(jì)和抗體

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中上已知的小鼠ATGL基因和β -actin基因的序列，利用Oligo 6.0軟件分別設(shè)計(jì)熒光定量引物，引物序列見(jiàn)表1。引物由上海生工生物公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列及相關(guān)條件Table 1Primers for quantitative PCR

1.4 Western Blotting

WB測(cè)試方法所采集的肌肉組織，加入RIPA裂解液裂解組織，用并添加PMSF蛋白酶抑制劑，終濃度為100 μg/ mL，防止蛋白降解。在冰上裂解30 min后，12 000 r/min離心10 min，離心后取上清，按體積比加入4×緩沖液，沸水煮沸變性10 min。將變性后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE（10%分離膠）分離。經(jīng)過(guò)電泳，使用伯樂(lè)半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，等以上工作結(jié)束后， 放置于5%脫脂牛奶室溫封閉45 min。TBST沖洗3次，每次10 min，抗ATGL蛋白抗體（Proteintech公司，貨號(hào)：55190-1-AP）用一抗稀釋液（1：500）稀釋后，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。第2天，用TBST徹底洗膜3次，每次10 min，山羊抗兔Ig-HRP二抗室溫孵育1 h，然后TBST徹底洗膜3次，伯樂(lè)成像系統(tǒng)對(duì)NC膜，加ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行成像，用Imagelab軟件進(jìn)行分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示數(shù)據(jù)，試驗(yàn)1和試驗(yàn)2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用雙因素方法分析，事后比較使用LSD法。統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，顯著性水平為0.05，非顯著性水平為0.01。

2 研究結(jié)果

2.1 耐力運(yùn)動(dòng)過(guò)程中比目魚(yú)肌肉ATGL基因和蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示（表2），ATGL基因在比目魚(yú)肌中的表達(dá)量逐漸升高，且與運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)成正相關(guān)，在運(yùn)動(dòng)4周時(shí)，ATGL基因的表達(dá)量最高。ATGL基因表達(dá)存在運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組之間差異，運(yùn)動(dòng)第4周，運(yùn)動(dòng)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 耐力運(yùn)動(dòng)過(guò)程不同時(shí)刻比目魚(yú)肌肉中ATGL mRNA/β- actin mRNA的比率Table 2 The Ratio of ATGL/β- actin mRNA in Soleus Muscle at Different Times during Endurance Exercise

如圖1所示，耐力運(yùn)動(dòng)引起運(yùn)動(dòng)組比目魚(yú)肌ATGL蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著性的升高變化（P＜0.05）。第3周比目魚(yú)肌ATGL蛋白表達(dá)運(yùn)動(dòng)組低于對(duì)照組，但兩組之間不具有顯著性意義（P＞0.05）。第3周和第4周，運(yùn)動(dòng)組ATGL蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)照組比目魚(yú)肌ATGL蛋白表達(dá)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但差異不具有顯著性（P＞0.05）。

圖1 耐力運(yùn)動(dòng)過(guò)程不同時(shí)刻比目魚(yú)肌ATGL蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖Figure 1.Relative Expression of ATGL Protein in Soleus Muscle at Different Times during Endurance Exercise

2.2 耐力運(yùn)動(dòng)過(guò)程中腓腸肌ATGL基因和蛋白表達(dá)

研究結(jié)果表明，耐力運(yùn)動(dòng)引起運(yùn)動(dòng)組的腓腸肌ATGL基因表達(dá)出現(xiàn)上升，差異且具有顯著性意義（P＜0.05）。耐力運(yùn)動(dòng)第3周、第4周基因表達(dá)運(yùn)動(dòng)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

如圖2所示，在本研究中，耐力運(yùn)動(dòng)引起腓腸肌中ATGL蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)上升的變化趨勢(shì)，差異具有顯著性意義（P＜0.05）。運(yùn)動(dòng)第3周、第4周ATGL蛋白表達(dá)量運(yùn)動(dòng)組顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05）；在耐力運(yùn)動(dòng)第3周和第4周末ATGL蛋白表達(dá)量運(yùn)動(dòng)組顯著高于控制組（P＜0.05）。

圖2 耐力運(yùn)動(dòng)過(guò)程不同時(shí)刻腓腸肌ATGL蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖Figure 2.Relative Expression of ATGL Protein in Gastrocnemius Muscle at Different Times during Endurance Exercise

表3 耐力運(yùn)動(dòng)過(guò)程不同時(shí)刻腓腸肌 ATGL/β-actin mRNA的比率Table 3The Ratio of ATGL/β-actin mRNA in Gastrocnemius Muscle at Different Times during Endurance Exercise

2.3 耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后信號(hào)分子T0070907與forskolin交互作用下ATGL的變化

研究結(jié)果表明，4周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，F(xiàn)orskolin組的ATGL基因表達(dá)無(wú)論是比目魚(yú)肌還是腓腸肌都出現(xiàn)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），T0070907組的腓腸肌中ATGL基因表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。在4周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，F(xiàn)orskolin組的ATGL基因表達(dá)腓腸肌顯著高于比目魚(yú)?。≒＜0.05）。

如圖3所示，4周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，F(xiàn)orskolin組的ATGL蛋白表達(dá)無(wú)論是比目魚(yú)肌還是腓腸肌都出現(xiàn)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），比目魚(yú)肌組和腓腸肌組內(nèi)差異不具有顯著性（P＞0.05），T0070907組的腓腸肌中ATGL蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。在四周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，F(xiàn)orskolin組的ATGL蛋白表達(dá)腓腸肌組顯著高于比目魚(yú)肌組（P＜0.05）。

表4 四周耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后比目魚(yú)肌 ATGL/β-actin mRNA的比率Table 4The Ratio of ATGL/β-actin mRNA in Soleus Muscle after Endurance Exercise Training

3 討論與分析

3.1 耐力運(yùn)動(dòng)過(guò)程中工作肌ATGL表達(dá)

在認(rèn)識(shí)ATGL是一種脂肪水解酶之前，人們只知道HSL是脂肪水解的關(guān)鍵酶，2004年，Zimmermann發(fā)現(xiàn)還存在第2個(gè)水解脂肪的限速酶——ATGL。ATGL是安靜和運(yùn)動(dòng)時(shí)甘油三酯水解的關(guān)鍵酶，已有報(bào)道表明，耐力運(yùn)動(dòng)與ATGL表達(dá)影響存在正向相關(guān)性，即耐力運(yùn)動(dòng)會(huì)誘導(dǎo)工作肌ATGL的含量提高。ATGL對(duì)運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練敏感，最信服的報(bào)道來(lái)源于基因敲除小鼠的研究。在運(yùn)動(dòng)時(shí)，ATGL和HSL的變化具有顯著性；ATGL 基因敲除［ATGL（-/-）］小鼠會(huì)改變?nèi)硇阅芰看x并削弱運(yùn)動(dòng)能力。通過(guò)對(duì)ATGL（-/-）小鼠和HSL（-/-）小鼠的定量跑臺(tái)耐力運(yùn)動(dòng)發(fā)現(xiàn)，ATGL（-/-）小鼠的最大跑臺(tái)速度和耐力運(yùn)動(dòng)能力分別減少42%和46%，而其在HSL（-/-）小鼠卻不見(jiàn)減少［8］。這些結(jié)果表明，在安靜和運(yùn)動(dòng)中，ATGL和HSL都起到了維持正常能量代謝的作用，但ATGL還起到維持運(yùn)動(dòng)能力的作用。動(dòng)物試驗(yàn)表明，耐力訓(xùn)練不會(huì)改變工作肌HSL活性和蛋白含量，前期研究表明，定量運(yùn)動(dòng)具有提高大鼠HSL基因表達(dá)的作用，而蛋白含量沒(méi)有增加，猜測(cè)可能的原因是轉(zhuǎn)錄水平的因素［10］。人體實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)，ATGL蛋白出現(xiàn)相似的上升變化。Helge等［7］通過(guò)訓(xùn)練者和不訓(xùn)練者對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)運(yùn)動(dòng)前和運(yùn)動(dòng)后3 h進(jìn)行肌肉活檢，結(jié)果表明，整個(gè)運(yùn)動(dòng)中訓(xùn)練者IMTG氧化水平要高于不訓(xùn)練者。但肌肉中HSL活性在運(yùn)動(dòng)前和運(yùn)動(dòng)后不存在組間差異，通過(guò)免疫組化法測(cè)定，運(yùn)動(dòng)后I、II型肌纖維HSL活性下降，但運(yùn)動(dòng)前、后訓(xùn)練者和不訓(xùn)練者的HSL活性不存在組間差異。這提示，運(yùn)動(dòng)中HSL活性或其他酶活性在常訓(xùn)練和不訓(xùn)練組之間存在調(diào)節(jié)機(jī)制上的差異。2008年，Jocken等［9］首次在人類I型肌肉中證實(shí)存在ATGL的表達(dá)。同年，有研究者通過(guò)10名健康男子進(jìn)行8周耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，對(duì)骨骼肌活檢液進(jìn)行蛋白印跡測(cè)定，結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起骨骼肌ATGL蛋白表達(dá)上升2倍，同時(shí)IMTG水平明顯下降，而HSL變化卻不顯著［4］。

圖 3耐力運(yùn)動(dòng)過(guò)程腓腸肌 ATGL蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖Figure 3.Relative Expression of ATGL Protein in Gastrocnemius Muscle during Endurance Exercise

以上的研究結(jié)果表明，耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)ATGL會(huì)出現(xiàn)顯著性上升的變化規(guī)律。其背后的ATGL激活機(jī)制仍不為人所知，探究其變化的上游信號(hào)分子調(diào)控途徑正是本研究的目的。所涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇C57BL/6J小鼠，正是ATGL基因敲除小鼠的研制背景小鼠，目的是為了隨后的模式基因ATGL敲除（ATGL-/-）小鼠與運(yùn)動(dòng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，保持該研究的連續(xù)性和前后可對(duì)比性。

本研究所開(kāi)展的C57BL/6J小鼠耐力訓(xùn)練引發(fā)ATGL基因和蛋白表達(dá)差異的試驗(yàn)（試驗(yàn)1），為隨后開(kāi)展信號(hào)分子干預(yù)試驗(yàn)（試驗(yàn)2）提供數(shù)據(jù)支持。試驗(yàn)1對(duì)C57BL/6J小鼠開(kāi)展4周的耐力訓(xùn)練，測(cè)定工作?。ū饶眶~(yú)肌和腓腸肌）ATGL的變化。研究結(jié)果表明，耐力運(yùn)動(dòng)引起ATGL基因表達(dá)腓腸肌和比目魚(yú)肌中隨時(shí)間持續(xù)出現(xiàn)顯著上升，但ATGL基因表達(dá)在腓腸肌和比目魚(yú)肌之間的差異并沒(méi)有出現(xiàn)顯著性意義；耐力運(yùn)動(dòng)引起運(yùn)動(dòng)組腓腸肌和比目魚(yú)肌ATGL蛋白表達(dá)與基因表達(dá)變化趨勢(shì)相似，只是第3周出現(xiàn)ATGL蛋白表達(dá)運(yùn)動(dòng)組低于對(duì)照組，但兩組之間不具有顯著性意義。本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象，在比目魚(yú)肌中，ATGL基因表達(dá)顯著變化早于蛋白顯著變化，腓腸肌ATGL卻出現(xiàn)蛋白顯著變化晚于基因表達(dá)的變化，即工作肌ATGL在快肌（腓腸?。?、慢?。ū饶眶~(yú)?。┗虮磉_(dá)和蛋白變化具有不同步性。該發(fā)現(xiàn)也許可以用最近發(fā)表在《科學(xué)》雜志上的報(bào)告來(lái)解釋，該研究發(fā)現(xiàn)，個(gè)體之間大多數(shù)的RNA表達(dá)差異與對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的豐度毫無(wú)關(guān)系［5］。

耐力運(yùn)動(dòng)引起ATGL蛋白表達(dá)腓腸肌和比目魚(yú)肌中都出現(xiàn)隨時(shí)間上升的變化趨勢(shì)，并且與運(yùn)動(dòng)前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ATGL蛋白表達(dá)在腓腸肌和比目魚(yú)肌之間并不存在差異。這與以前在大鼠身上的開(kāi)展研究的ATGL基因表達(dá)結(jié)果類似，但大鼠試驗(yàn)沒(méi)有測(cè)定ATGL蛋白水平的變化，無(wú)法進(jìn)行基因與蛋白變化時(shí)間的分析［3］。在本研究中，耐力訓(xùn)練引發(fā)的比目魚(yú)肌和腓腸肌ATGL基因和蛋白表達(dá)的上升，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)差異，這與在大鼠中的研究存在差異，猜測(cè)可能是物種差異的因素。

本研究結(jié)果顯示，ATGL具有對(duì)耐力訓(xùn)練時(shí)間依賴性出現(xiàn)上升的變化規(guī)律，這可能為脂代謝研究開(kāi)辟了一條新的道路，并進(jìn)一步完善了對(duì)脂肪分解過(guò)程的認(rèn)識(shí)。而更多內(nèi)容，如ATGL mRNA 表達(dá)水平受禁食／進(jìn)食、糖皮質(zhì)激素、胰島素和腫瘤壞死因子等多種因素影響的機(jī)制，上調(diào)和下調(diào)ATGL 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，ATGL 是否能成為治療脂代謝紊亂的一個(gè)靶基因，ATGL 和CGI-58 發(fā)揮作用的具體機(jī)制，HSL 和ATGL 之間的關(guān)系，激活A(yù)TGL 水解脂肪的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，不同運(yùn)動(dòng)形式對(duì)ATGL 的影響等尚待進(jìn)一步研究［1］。

3.2 耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)信號(hào)干預(yù)實(shí)驗(yàn)

在體研究中采用信號(hào)分子干擾劑是一種常用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究手段，有助于探究影響變量之間的因果關(guān)系。

在白色脂肪組織HSL受到抑制時(shí)，機(jī)體仍舊會(huì)出現(xiàn)激素引發(fā)的脂肪水解現(xiàn)象，這表明，ATGL活性也是通過(guò)信號(hào)途徑調(diào)控的。ATGL的干擾劑有哪些？ 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道表明，在中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中混和型的骨骼肌 forskolin下游的PKA參與ATGL磷酸化，卻與AMPK無(wú)關(guān)［12］。小鼠的研究證實(shí)，禁食和中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)ATGL Ser（406）磷酸化的增加，伴隨的脂肪水解率的增加。β-腎上腺能激活會(huì)引起PKA調(diào)節(jié)的ATGL的磷酸化，并溫和地增加ATGL調(diào)節(jié)的脂肪水解［14］。本試驗(yàn)采用佛司可林（Forskolin）和T0070907作為信號(hào)分子干擾劑。

佛司可林（Forskolin）分子式為 C22H34O7，提取自毛喉鞘蕊花 （Coleus forskohlii），白色粉末，是一種強(qiáng)大的腺苷酸環(huán)化酶激活劑，通過(guò)升高cAMP的水平，參與生物學(xué)的調(diào)節(jié)作用。作為本實(shí)驗(yàn)采用的另外一種干擾劑，T0070907是一種強(qiáng)有效和選擇性的PPARγ抑制劑，比作用于PPAR-α和PPAR-δ選擇性高800倍以上，具有明顯的親和性。T0070907也可以使PPARγ磷酸化水平及DNA結(jié)合能力下降并且可能直接影響促分裂原活化蛋白激酶的信號(hào)通路［11，16］。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在四周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后， Forskolin組的ATGL基因表達(dá)腓腸肌顯著高于比目魚(yú)肌，表明，耐力訓(xùn)練后 Forskolin刺激下，ATGL基因表達(dá)存在快、慢肌的差異。4周的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后， Forskolin組的ATGL蛋白表達(dá)無(wú)論是比目魚(yú)肌還是腓腸肌都顯著高于對(duì)照組，提示，F(xiàn)orskolin與耐力訓(xùn)練的疊加作用有助于增加ATGL蛋白的表達(dá)。這表明， Forskolin激活的cAMP信號(hào)途徑可能參與了耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練ATGL上升的調(diào)控。然而，T0070907組的腓腸肌ATGL蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，這提示，T0070907通過(guò)抑制PPARγ達(dá)到降低ATGL蛋白和基因表達(dá)的作用。

在比目魚(yú)肌和腓腸肌兩種組織中，F(xiàn)orskolin通過(guò)cAMP信號(hào)途徑增強(qiáng)ATGL蛋白的表達(dá)起了的影響存在正向的調(diào)節(jié)作用，T0070907通過(guò)PPAR-γ信號(hào)途徑降低了ATGL蛋白的表達(dá)的影響。這表明，cAMP和PPAR-γ信號(hào)途徑都參與了耐力訓(xùn)練工作肌ATGL表達(dá)的調(diào)控。

4 結(jié)論

耐力訓(xùn)練會(huì)引起C57BL/6J小鼠比目魚(yú)肌和腓腸肌中的ATGL基因和蛋白表達(dá)上升，表明，耐力訓(xùn)練調(diào)節(jié)ATGL變化的一個(gè)外在的誘導(dǎo)因素。通過(guò)在體的信號(hào)分子干預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Forskolin上調(diào)工作肌ATGL基因蛋白表達(dá)，T0070907下調(diào)ATGL基因蛋白表達(dá)，證實(shí)了信號(hào)分子cAMP和PPAR-γ參與了耐力訓(xùn)練引發(fā)工作肌ATGL基因和蛋白表達(dá)的上升。

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The Effect of Signal Molecule cAMP and PPAR-γ on ATGL of Working Muscular in C57BL/6J Mouse in Exercise Training

Song Gang1，2，Lei Xiao-can3，Li li4，Peng li1

Objective：1） The purpose of this study was to observe the changes of ATGL gene and protein expression in C57BL/6J mice at different time points in endurance training；2） To explore the possible molecular mechanism of ATGL changes after intraperitoneal injection of cAMP activator Forskolin，PPAR- inhibitor T0070907. Methods：Experiment 1，Endurance training last for four weeks of training C57BL / 6J mice，the gastrocnemius and soleus muscle of ATGL gene and protein expression was determined by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting；Experiment 2，ATGL gene and protein expression in gastrocnemius and soleus muscle are determined respectively daily intraperitoneal injection of forskolin，T0070907 and DMSO after 4 weeks treadmill endurance trained mice. Results：1） ATGL gene and protein of the soleus muscle expression increased in endurance exercise（ P＜0.05），and the ATGL mRNA expression in exercise group was signi fi cantly higher than the control group in fourth week（ P＜0.05），the expression of ATGL protein was signi fi cantly higher than that of control group in the third，and in the fourth weeks（ P＜0.05）；2） ATGL mRNA and protein expression in the gastrocnemius muscle increased during endurance exercise（ P＜0.05），ATGL mRNA and protein expression in exercise group was signi fi cantly higher than those in the control group in the third week and the fourth week of endurance training（ P＜0.05）；3） ATGL gene and protein expression of soleus and gastrocnemius muscle in forskolin group for 4 weeks endurance training were signi fi cantly higher than those of the control group（ P＜0.05），ATGLmRNA and protein of T0070907 group in the gastrocnemius muscle was signi fi cantly lower than those of the control group（ P＜0.05）；ATGL gene expression in forskolin group was signi fi cantly higher than that of gastrocnemius muscle after 4 weeks endurance training （ P＜0.05）. Conclusion：Endurance training can lead to the increasement of ATGL gene and protein expression soleus and gastrocnemius muscle in the C57BL/6J mouse，which the cAMP and PPAR-γ，signal molecule are involved in.

G804.7

A

2016-07-20；

2017-07-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31360254）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（SWU1609025）。

宋剛，男，教授，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)內(nèi)分泌；Tel：（023）68252345，E-mail：songgang@aliyun.com；雷小燦，男，講師，博士，主要研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)；彭莉，女，教授，博士，主要研究方向?yàn)轶w育保健與健康；E-mail：804455169@qq.com。

1.西南大學(xué) 體育學(xué)院，重慶 400715；2.國(guó)家體育總局體質(zhì)評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)機(jī)能監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；3.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003；4.廣西大學(xué) 體育學(xué)院，廣西 南寧 530004

1. Southwest University ，Chongqing 400715，China；2. State Sports General Administration Key Laboratory of physical fitness evaluation and sports function monitoring，Chongqing 400715，China；3.Zunyi Medical College，Zunyi 563003，China；4. Guangxi University，Nanning 530004，China.

Keyword： mouse；adipose triglyceride lipase；signal molecule；endurance training