張玉勤

順德區(qū)婦幼保健院（廣東佛山 528300）

沙眼衣原體感染不育男性的精液質(zhì)量與IL-6、IL-8水平的相關(guān)性分析

張玉勤

順德區(qū)婦幼保健院（廣東佛山 528300）

目的探討沙眼衣原體感染不育男性的精液質(zhì)量與IL-6、IL-8水平的關(guān)系。方法選擇2015年2月至2016年6月我院收治的不育男性250例，收集患者的血液、首段尿（FVU）和精液標(biāo)本，分別檢測(cè)血清特異性IgA、IgM、IgG抗體、 FVU和精液沙眼衣原體DNA、精液IL-6、IL-8濃度，并進(jìn)行精液常規(guī)分析。分析沙眼衣原體感染患者的IL-6、IL-8水平變化，及與精液常規(guī)參數(shù)等指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果（1）尿液、血清衣原體陽(yáng)性患者IL-6和IL-8水平與正常生育男性比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）IL-6和IL-8水平與白細(xì)胞濃度均具有相關(guān)性，且IL-8水平與精液體積和患者年齡相關(guān)。結(jié)論FVU沙眼衣原體陽(yáng)性的男性精液體積明顯低于陰性者，IL-6和IL-8水平與白細(xì)胞濃度呈正相關(guān)。IL-8水平與精液體積呈負(fù)相關(guān)而與男性年齡呈正相關(guān)。

衣原體, 沙眼; 不育, 男性; 精液; 白細(xì)胞介素6; 白細(xì)胞介素8

沙眼衣原體感染是常見(jiàn)的男性生殖道感染疾病，主要通過(guò)性生活傳播，且對(duì)男性的生殖功能影響較大[1]。沙眼衣原體感染是發(fā)生梗阻性無(wú)精子癥的危險(xiǎn)因素，主要通過(guò)影響精子發(fā)生或損傷成熟精子來(lái)降低男性生育力[2]。沙眼衣原體感染會(huì)引起慢性炎癥反應(yīng)，其抗原刺激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞應(yīng)答并產(chǎn)生炎癥因子，這些炎性因子可能通過(guò)獨(dú)立的機(jī)制影響男性生育力。研究發(fā)現(xiàn)，慢性沙眼衣原體感染男性IL-6和IL-8水平升高，且這些細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[3]。然而，沙眼衣原體感染男性的IL-6和IL-8等炎癥因子是否與精液質(zhì)量存在相關(guān)性，目前報(bào)道存在分歧。Kokab等[4]研究發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體感染男性精液中IL-8水平顯著高于非感染患者，但I(xiàn)L-6與沙眼衣原體感染之間無(wú)相關(guān)性；IL-8水平升高與精液量增多有關(guān)，而與其他的精液質(zhì)量參數(shù)無(wú)關(guān)，但這項(xiàng)研究通過(guò)檢測(cè)精液和尿液沙眼衣原體進(jìn)行診斷，而不考慮血清學(xué)情況，難以解釋精液炎癥因子水平是否與近期或過(guò)往沙眼衣原體感染有關(guān)。因此，本研究通過(guò)精液、首段尿沙眼衣原體抗原和血液特異性IgA、IgM、IgG抗體綜合診斷衣原體感染，并探討其與精液IL-6、IL-8水平及精液質(zhì)量的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

2015年2月至2016年6月我院男科共收治男性不育患者324例，選擇其中250例入組。入選患者年齡21～52歲，婚后正常性生活2年以上不育，無(wú)外傷及遺傳性疾病家族史，無(wú)性功能障礙，同時(shí)患有沙眼衣原體感染。排除染色體核型異常、放化療史、輸精管切除史、少精液癥（＜1mL）、逆行射精、低促性腺素性功能減退的患者；研究?jī)?nèi)容及過(guò)程均通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書，并采集精液、2mL血液及20～40mL尿液樣本，進(jìn)行前瞻性研究。

二、方法

（一）精液處理及分析

患者禁欲2～7d后手淫法采集精液，參照2010年WHO五版《人類精液分析與檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[5]進(jìn)行精液分析。精液置于37℃培養(yǎng)箱孵育至完全液化，觀察并測(cè)量精液外觀、黏稠度、pH值及體積，精液體積采用稱量法測(cè)量；精液稀釋適當(dāng)倍數(shù)并充池Goldcyto精子計(jì)數(shù)板，采用西班牙CASA系統(tǒng)分析精子的濃度、活力。精子活力分為前向運(yùn)動(dòng)（PR）、非前向運(yùn)動(dòng)（NP）和不動(dòng)（IM）三級(jí)。精液白細(xì)胞檢測(cè)采用過(guò)氧化物酶染色法，染色呈棕色且圓形的細(xì)胞即為白細(xì)胞。制備精子涂片，采用改良巴氏法染色，封片，1000×油鏡觀察，精子形態(tài)分類參照WHO第五版手冊(cè)。

（二）尿液、精液DNA提取及巢式PCR

所有尿液和精液標(biāo)本中DNA均采用QIAamp DNA Mini Kit （Qiagen）試劑盒提取，參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。提取的DNA均儲(chǔ)存于-20℃冰箱內(nèi)。巢式質(zhì)粒PCR參照Claas等[6]報(bào)道的方法，兩對(duì)引物用于檢測(cè)沙眼衣原體。一對(duì)引物源于沙眼衣原體共同的內(nèi)源性質(zhì)粒，可生成所有血清型沙眼衣原體特異的517bp產(chǎn)物。第二對(duì)引物為第一對(duì)引物內(nèi)部序列，可擴(kuò)增320bp產(chǎn)物。PCR程序?yàn)?5個(gè)循環(huán)，包括變性94℃ 30s，退火42℃ 30s，延伸72℃ 30s。延伸時(shí)間增加到9min。參照Saiki等[7]的方法，精液DNA首先檢測(cè)β-globin，以確定待檢樣品中是否存在PCR酶抑制劑。當(dāng)β-globin陽(yáng)性時(shí)，針對(duì)隱蔽性質(zhì)粒進(jìn)行巢式PCR，產(chǎn)物均使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。每次PCR以血清型E、LGV作為陽(yáng)性對(duì)照。

（三）血清學(xué)檢測(cè)

血清中沙眼衣原體特異性IgA、IgM、IgG抗體檢測(cè)采用免疫熒光試劑盒（Focus），純化抗體固定于玻片上，血清樣本解凍并稀釋，根據(jù)試劑盒建議，IgG血清抗體稀釋64倍，IgA稀釋32倍，IgM稀釋20倍。稀釋的患者血清與抗原37°孵育30min，洗滌去除未結(jié)合的血清。添加抗人IgG，IgA，IgM熒光標(biāo)記抗體并37℃孵育30min，洗滌去除未結(jié)合成分，自然干燥并封片，采用leica熒光顯微鏡DMIRB進(jìn)行觀察，400倍先掃描典型熒光，再在1 000×油鏡確定存在熒光或無(wú)EB樣的非典型熒光。陽(yáng)性反應(yīng)表現(xiàn)為明亮的蘋果綠色熒光，背景為黑色，試劑盒自帶陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

（四）精液IL-6和IL-8濃度測(cè)定

精漿解凍后采用PBS稀釋，IL-6和IL-8樣品分別稀釋2倍、4倍。取100mL稀釋樣本，采用ELISA法檢測(cè)。試劑盒為（R&D Systems），參照試劑盒說(shuō)明書操作。每一個(gè)測(cè)試孔均在30min內(nèi)測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為450nm。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用描述統(tǒng)計(jì)學(xué)和獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)分析。非參數(shù)數(shù)據(jù)采用曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)。IL-6、IL-8水平與精液參數(shù)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。均以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、沙眼衣原體感染情況分析

11例患者尿液衣原體DNA為陽(yáng)性，占4.4%。血清學(xué)結(jié)果顯示，IgM+3例，占1.2%；IgG+45例，占18.0%；IgA+0例。精液標(biāo)本中均未檢測(cè)到衣原體DNA。IL-8水平分析

二、衣原體感染陽(yáng)性及陰性患者精液IL-6和

表1顯示尿液、血清學(xué)檢測(cè)衣原體感染陽(yáng)性及陰性患者精液中IL-6和IL-8濃度的平均值，中位數(shù)，第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù)及范圍。結(jié)果顯示，尿檢衣原體陽(yáng)性患者精液IL-6和IL-8水平比正常生育男性顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-6和IL-8陰性組與正常生育男性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。血清衣原體陽(yáng)性患者IL-6和IL-8水平與正常生育男性比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-6和IL-8陰性組與正常生育男性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

三、精液IL-6、IL-8水平與精液參數(shù)等指標(biāo)的相關(guān)性分析

表2顯示精液中IL-6、IL-8濃度與男性年齡、不孕年限和精子參數(shù)的相關(guān)性分析。采用Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，IL-6和IL-8濃度均與精液白細(xì)胞濃度顯著相關(guān)（P=0.027，P=0.011）。與其他參數(shù)的相關(guān)性分析，僅IL-8水平與精液體積呈負(fù)相關(guān)（P=0.004），而與男性年齡呈正相關(guān)（P=0.013），見(jiàn)表2，圖1-4。

表1 精液IL-6、IL-8水平與尿液衣原體DNA、血清特異性IgG 檢出情況的關(guān)系（pg/mL）

表2 精液IL-6、IL-8水平與年齡、不育年限及精液參數(shù)的相關(guān)性分析

四、衣原體感染情況與精液參數(shù)的相關(guān)性分析

表3比較了尿液、血清學(xué)檢測(cè)衣原體陽(yáng)性與陰性患者的精液參數(shù)，結(jié)果顯示尿液衣原體DNA陽(yáng)性患者的精液體積顯著低于未感染者（P＜0.05）。IgG陽(yáng)性組患者精液pH值高于陰性者，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且不動(dòng)精子百分比顯著低于IgG陰性組（P＜0.05）。尿檢衣原體抗原陽(yáng)性患者精液白細(xì)胞數(shù)量升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

討 論

圖1 IL-6 與白細(xì)胞濃度相關(guān)性分析

圖2 IL-8與白細(xì)胞濃度相關(guān)性分析

圖3 IL-8與男性年齡相關(guān)性分析

圖4 IL-8與精液體積相關(guān)性分析

表3 尿液衣原體DNA、血清特異性IgG陽(yáng)性患者年齡、不孕年限及精液參數(shù)與陰性患者比較（x ±s）

本研究結(jié)果顯示FVU衣原體抗原陽(yáng)性患者精液質(zhì)量與陰性者比較，僅精液體積顯著降低；其作用機(jī)制可能與衣原體感染引起的慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致生殖系統(tǒng)管道堵塞有關(guān)，與Wolf等[8]報(bào)道結(jié)果類似。而Hosseinzadeh[9]、AL-Mously[10]及Kokab[4]等研究認(rèn)為，衣原體感染可能引起生殖附屬腺體及生殖上皮細(xì)胞分泌活動(dòng)增強(qiáng)；王中興等[11]研究又顯示合并沙眼衣原體、解脲支原體及細(xì)菌感染的男性不育癥患者精液體積、精子濃度與正常生育男性精液比較無(wú)明顯差異，與本研究結(jié)果有差異。本研究結(jié)果又顯示，血清學(xué)特異性IgG+抗體陽(yáng)性患者精液IL-6濃度及pH值均升高，與Marconi[12]和Kokab[4]等報(bào)道結(jié)果類似。衣原體感染陽(yáng)性患者精液IL-8濃度升高與精液體積下降具有相關(guān)性，與Hosseinzadeh[9]、AL-Mously[10]及Kokab[4]等報(bào)道的精液體積增加相反。目前還未明確造成結(jié)果差異的原因，但預(yù)測(cè)可能與本研究中精液DNA未受影響、部分男性僅有尿道炎病史及患者的禁欲時(shí)間差異等因素有關(guān)。精液IL-8濃度也與男性年齡直接相關(guān)，可能是生殖附屬腺感染或良性前列腺增生（BPH）的標(biāo)志[10]。多篇研究報(bào)道了精液IL-8在BPH觸發(fā)、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及男性年齡增長(zhǎng)中的重要作用[13-15]。近期研究未發(fā)現(xiàn)年齡和精液體積間的相關(guān)性，而IL-8和精液體積明顯相關(guān)，且由附屬腺體炎癥反應(yīng)、衣原體感染、其他病原體感染和附睪管阻塞引起[12]。然而，精液中其他的微生物也能誘導(dǎo)炎性反應(yīng)及細(xì)胞因子水平的變化[16]，可能是本研究結(jié)果的干擾因素。

衣原體感染陽(yáng)性患者IL-6、IL-8均顯著高于正常生育男性患者，這結(jié)果支持AL-Mously[10]等關(guān)于精漿中IL-6、IL-8水平可能是上生殖道感染（例如前列腺炎）標(biāo)志的觀點(diǎn)。AL-Mously[10]、曹志彬[17]等研究顯示IL-6、IL-8水平均為前列腺炎癥的標(biāo)志，且IL-8也與尿道感染相關(guān)，IL-8水平與男性年齡具有正相關(guān)性，提示高水平IL-8患者可能患有前列腺炎。精液中IL-6、IL-8水平均與高濃度白細(xì)胞有關(guān)，提示存在炎癥反應(yīng)或感染，與Eggert[18]、Kokab[4]等研究結(jié)果類似。因此，沙眼衣原體感染導(dǎo)致的精漿白細(xì)胞介素水平升高、尤其IL-6水平顯著升高時(shí)提示前列腺感染。尿道衣原體檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)示近期感染，且精液量減少與IL-8濃度升高和前列腺炎癥反應(yīng)有關(guān)。沙眼衣原體感染和慢性前列腺炎預(yù)示發(fā)生前列腺癌的危險(xiǎn)[19]，但該觀點(diǎn)并無(wú)可接受的病因?qū)W聯(lián)系，且存在爭(zhēng)議性，需通過(guò)更多的研究證實(shí)。

許多研究認(rèn)為，慢性前列腺炎患者精液質(zhì)量下降及免疫反應(yīng)導(dǎo)致的IL-8水平升高與沙眼衣原體的感染具有相關(guān)性。然而，所有研究均基于沙眼衣原體感染陽(yáng)性或者有前列腺炎藥物史的基礎(chǔ)上進(jìn)行。本研究中男性均無(wú)癥狀，且入組并完成所有的診斷后才獲取血清學(xué)結(jié)果；招募患者時(shí)未知診斷結(jié)果及不育因素，保證了研究結(jié)果的真實(shí)性。

1 La Vignera S, Condorelli RA, Vicari E, et al. Microbiological investigation in male infertility: a practical overview. J Med Microbiol 2014; 63(1): 1-14

2 Sobinoff AP, Dando SJ, Redgrove KA, et al. Chlamydia muridarum infection-induced destruction of male germ cells and Sertoli cells is partially prevented by Chlamydia major outer membrane protein-specific immune CD4 cells. Biol Reprod 2015; 92(1): 27

3 劉燕婕, 周慧. 衣原體屬與支原體屬感染及細(xì)胞因子水平和男性不育的相關(guān)性研究. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志2013; 23(16): 3828-3829, 3882

4 Kokab A, Akhondi MM, Sadeghi MR, et al. Raised inflammatory markers in semen from men with asymptomatic chlamydial infection. J Androl 2010; 31(2): 114-120

5 Sánchez-álvarez J, Cano-Corres R, Fuentes-Arderiu X. A Complement for the WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. EJIFCC 2012; 23(3): 103-106

6 Claas HC, Melchers WJ, De Bruijn IH, et al. Detection of Chlamydia trachomatis in clinical specimens by the polymerase chain reaction. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1990; 9(12): 864-868

7 Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985; 230(4732): 1350-1354

8 Wolff H, Neubert U, Zebhauser M, et al. Chlamydia trachomatis induces an infammatory response in the male genital tract and is associated with altered semen quality. Fertil Steril 1991; 55(5): 1017-1019

9 Hosseinzadeh S, Eley A, Pacey AA. Semen quality of men with asymptomatic chlamydial infection. J Androl 2004; 25(1): 104-109

10 Al-Mously N, Eley A. Interaction of Chlamydia trachomatis serovar E with male genital tract epithelium results in secretion of proinfammatory cytokines.J Med Microbiol 2007; 56(Pt 8): 1025-1032

11 王中興, 劉浩, 吳麗娟, 等. 男性不育癥患者中常見(jiàn)病原體感染對(duì)精液參數(shù)的影響. 生殖醫(yī)學(xué)雜志 2016; 25(4): 364-367

12 Marconi M, Pilatz A, Wagenlehner F, et al. Impact of infection on the secretory capacity of the male accessory glands. Int Braz J Urol 2009; 35(3): 299-308

13 葉海云, 侯樹(shù)坤, 白文俊, 等. 慢性前列腺炎患者前列腺液 IL-6 和 IL-8 表達(dá)變化及意義. 中華泌尿外科雜志2003; 24(4): 279-281

14 Penna G, Fibbi B, Amuchastegui S, et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol 2009; 182(7): 4056-4064

15 柳良仁, 劉振華, 楊璐, 等. 前列腺液中白細(xì)胞介素8水平與良性前列腺增生患者組織炎癥及下尿路癥狀關(guān)系的研究. 中華泌尿外科雜志 2014; 35(12): 953-954

16 Cai T, Wagenlehner FM , Mondaini N, et al. Effect of human papillomavirus and Chlamydia trachomatis coinfection on sperm quality in young heterosexual men with chronic prostatitis-related symptoms. BJU Int 2014; 113(2): 281-287

17 曹志彬, 王元天, 薛蔚, 等. 慢性前列腺炎患者前列腺液中 IL-17 的表達(dá)及與 TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10 相關(guān)性分析. 中國(guó)男科學(xué)雜志 2014; 28(2): 51-54

18 Eggert-Kruse W, Rohr G, Kunt B, et al. Prevalence of Chlamydia trachomatis in subfertile couples. Fertil Steril 2003; 80(3): 660-663

19 Stasiewicz D, Staros?awska E, Brzozowska A, et al. Epidemiology and risk factors of the pr ostate cancer.Pol Merkur Lekarski 2012; 33(195): 163-167

（2017-03-06收稿）

Correlation analysis between semen quality and the levels of seminal IL-6 and IL-8 in Chlamydia trachomatis infection-caused male infertility

Zhang Yuqin
Shunde District Maternal and Child Health Hospital, Foshan 528300, Guangdong, China

ObjectiveTo study the relationship between semen quality and the level of seminal IL-6 and IL-8 in C. trachomatis infection-caused male infertility.MethodsTotal of 250 infertile men were recruited in the study, and their blood, frst void urine (FVU ) and semen samples were collected. Analysis for specifc IgA, IgM and IgG antibodies to C. trachomatis in serum, the presence of C. trachomatis in FVU and semen sample and semen analysis were carried out. IL-6, IL-8 levels and semen parameters were comparatively analyzed in C. trachomatis infection-caused infertile male.Results(1) Chlamydia trachomatis positive male seminal plasma IL-6 and IL-8 levels increased, but no signifcant difference, and with the diagnosis method. (2) IL-6 and IL-8 levels were associated with leukocyte concentrations, and IL-8 levels were associated with semen volume and patient age.ConclusionThis study showed that semen volume of C. trachomatis infection- positive infertile male was lower than that of the men without infection. Relationship among IL-6, IL-8 level, and leukocyte were observed, and IL-8 level was negatively correlated with semen volume, while positively correlated with age.

Chlamydia trachomatis; infertility, male; semen; Interleukin-6; Interleukin -8

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.010

R 698.2