何海洋 齊陸玉 侯伊玲

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）、結直腸癌、頭頸鱗狀細胞癌中經常過表達或者突變，因而是阻斷此類癌細胞增殖生存的有效靶點。藥物通過與EGFR特異結合，減少腫瘤的血管生成與癌癥的發(fā)展，阻斷細胞周期以誘導凋亡[1]。在臨床中，EGFR活性通過酪氨酸激酶抑制劑（吉非替尼、埃羅替尼、拉帕替尼）或是特異抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）阻斷。然而EGFR阻斷劑治療常伴隨劑量限制的持續(xù)性副反應——皮膚炎癥（丘狀膿包性皮疹和瘙癢）及腸道炎癥[2]，引起這一副反應的原因之一為EGFR不僅表達于腫瘤細胞表面，也在正常上皮組織表達。最近有遺傳實驗結果[3,4]表明，角質細胞衍生的趨化因子誘導巨噬細胞和肥大細胞浸潤，導致皮膚皮疹，因而提出一種可能性，即在藥物干預的情況下，功能性EGFR缺失，可以改變腫瘤免疫微環(huán)境。近段時間以來，免疫檢點（CTLA-4、PD-1/PD-L1）抑制劑用于癌癥治療試驗證實特定的免疫環(huán)境是腫瘤繼續(xù)生長或被消滅的決定因素之一[5]。為了模擬EGFR消失對鱗狀細胞肺癌腫瘤微環(huán)境的影響，我們使用基因及藥物手段在FVB/N免疫小鼠身上進行了一系列試驗。

1 材料及方法

1.1 實驗材料 HRAS（sc-520）購于Santa Cruz；EGFR（06-847）購于Millipore；ACK 緩沖液購于Thermo Fisher；綠色或藍色活體染色劑購于Life Technologies；Foxp3 Fix/Perm購于ebiosciences；TRIzol試劑購于Life Technologies；SuperScript? III反轉錄酶購于Life Technologies；流式抗體FoxP3-AF488、PD1-PE、CD25-AF700、CD45-PECF594、CD3-APC、CD4-PCPCy5.5、CD8-APCCy7購于BD；抗蛋白酶購于Roche；定制的磁珠組合購于R&D luminex；iQ SYBR Green Supermix購于Biorad；管過濾（352235）購于BD；實驗引物來自Quantitech Qiagen，流式細胞儀使用BD LSRII；實時定量PCR使用Bio-Rad iCycler iQ。

1.2 細胞修飾 通過腫瘤細胞自主（遺傳）和系統(tǒng)性（藥物干預）模型，給新生的小鼠移植以下修飾的角質細胞以成瘤：通過逆轉錄病毒連續(xù)5 d轉染HRAS至EGFRwt/wt與EGFRflx/flx角質細胞以形成具有持續(xù)HRAS活性的改造細胞[6,7]。HRAS感染的第3天，使用包含Cre重組酶的腺病毒二次感染角質細胞，EGFRflx/flx角質細胞的EGFR被切除而EGFRwt/wt型不受影響。

1.3 小鼠腫瘤模型建立 3.5×106轉化角質細胞與5×106原代成纖維細胞（支持細胞）移植到同源小鼠背部。觀察腫瘤生長1個月，每星期用卡尺測量腫瘤體積。對于藥理模型，在移植EGFRwt/wt轉化角質細胞21 d后，將荷瘤小鼠隨機分為兩組。一組接受溶解有吉非替尼的10%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）填胃法治療，吉非替尼給藥量為100 mg/kg；另一組每日10%的DMSO灌胃；連續(xù)處理1周。遺傳模型實驗包含EGFRwt/wt（n=23）和EGFRflx/flx移植小鼠（n=19），進行3組隨機平行重復實驗。藥理模型重復兩次，實驗小鼠總數(shù)為10% DMSO組（n=10），吉非替尼組（n=11）根據(jù)腫瘤的大小，至少收集300 mg樣本（部分腫瘤較小樣本合并2個/3個相同的遺傳組腫瘤，以獲得足夠的流式細胞儀分析的樣本）消化，部分進行流式細胞儀分析、部分用于總mRNA和蛋白萃取。有些實驗組樣本不夠進行上述所有分析，所以不同實驗結果中小鼠的樣本數(shù)存在差異。

1.4 流式細胞儀檢測 新鮮收集的腫瘤分割（或是根據(jù)腫瘤體積進行合并）300 mg，切碎，于玻璃燒杯中使用膠原蛋白酶I消化（5 mL/腫瘤溶于2,000 U無血清DMEM培養(yǎng)基）45 min，37oC，持續(xù)攪拌。樣本轉移至冰上，移液器自上而下添加10 mL含10%血清DMEM培養(yǎng)基。100目細胞濾器過濾，4oC 1,200 rmp離心5 min。3 mL ACK緩沖液重懸并置于冰上孵育5 min，20 mL完全DMEM培養(yǎng)基終止ACK裂解，70 μm過濾器過濾，4oC 1,200 rmp離心5 min。重懸并計數(shù)，稀釋細胞濃度至1×106/mL。取1 mL樣本，2 mL低溫PBS清洗，離心，50 μL PBS重懸并轉移至15 mL離心管，加入1 mL綠色或藍色活體染色劑（事先1:100稀釋）染色，室溫孵育15 min；同型對照組同樣室溫孵育15 min。2 mL低溫PBS清洗，離心，50 mL PBS重懸，加入混合抗體（FoxP3-AF488, PD1-PE, CD25-AF700, CD45-PECF594, CD3-APC, CD4-PCPCy5.5, CD8-APCCy7），4oC孵育30 min。2 mL低溫PBS洗滌，離心，固定（2% PFA在冰上孵育20 min）。1 mL Foxp3 Fix/Perm室溫孵育15 min，然后用2 mL FoxP3 Perm沖洗，于含細胞核抗體FoxP3 Perm 50 μL緩沖液室溫孵育30 min。2 mL FoxP3 Perm沖洗，離心并重懸于PBS溶液，于BD管過濾過濾。

對于FoxP3，遺傳模型及藥理模型均只有一組流式實驗讀數(shù)可信（細胞的最佳滲透），而PD-1染色數(shù)據(jù)各有3組有效。樣本于BD LSRII檢測，數(shù)據(jù)分析均于FlowJo 9.8軟件進行。

1.5 RNA提取與實時定量RT-PCR 總RNA提取：冰凍腫瘤切塊于低溫Mikro-Dismembrator S中2,000 rmp 2 min，溶解于TRIzol試劑，具體操作詳見說明書。cDNA合成：1 μg總RNA使用SuperScript? III反轉錄酶反轉錄，PCR為20 μL體系iQ SYBR Green Supermix，cDNA 1:100稀釋。結果以平均相對量±SD表示。

1.6 腫瘤細胞裂解物分析 總細胞裂解物：提取RNA剩余腫瘤粉末于含抗蛋白酶、1 mmol/L正釩酸鈉、1 mmol/L氟化鈉的低溫RIPA緩沖液中裂解。腫瘤裂解物置于冰上旋渦孵育20 min，然后14,000 rpm離心15 min，上清液Bradford法測定總蛋白含量定量，10 μg蛋白裂解液使用定制的磁珠組合分析19種細胞因子和趨化因子（HGF,TNFA, IL-1B, IL-1A, IFNG, GCSF, MCSF, EPO, LIX, MDC,KC, MCP-1, RANTES, IL6, Lipocalin2, MIP1A, MIP1B, IGF1,Eotaxin），定量IL-1RA使用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）測試。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Mann Whitney U檢驗比較組數(shù)據(jù)之間的差異。P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 HARS轉染角質細胞移植至免疫同源FVB/N小鼠背部成瘤情況 經過處理的角質細胞移植到同源小鼠背部以成瘤，觀察腫瘤生長狀態(tài)，基因模型組（圖1A）腫瘤生長持續(xù)受到抑制；藥理模型（圖1B）小鼠使用小分子靶向藥物吉非替尼經過1周的治療，實驗組相對于只喂食10%DMSO對照組腫瘤細胞體積較?。ㄆ骄w積 726 mm3vs 1,340 mm3），但無統(tǒng)計學差異。

2.2 基因組小鼠腫瘤酶消化懸液細胞分析 通過流式細胞儀分析酶消化基因組小鼠腫瘤獲得的細胞懸液，EGFRflx/flx相對于EGFRwt/wt組，CD4+細胞表達PD-1下降（圖2A），F(xiàn)oxP3陽性CD4+細胞比例明顯降低（圖2B）。同源小鼠EGFRwt/wt型CD4+T表達PD-1高（圖2C），EGFRflx/flx型CD4+T表達PD-1較低（圖2D）。

2.3 藥理組小鼠腫瘤酶消化懸液細胞分析 通過流式細胞儀分析酶消化藥理模型組小鼠腫瘤獲得的細胞懸液，Gefitinib相對于DMSO組，F(xiàn)oxP3陽性CD4+/CD25+細胞減少趨勢，CD4+細胞PD-1的表達未減少，同源小鼠Gefitinib組與DMSO組PD-1 陽性CD4+T細胞比例相近（圖3）。

2.4 各組mRNA和炎性介質蛋白表達情況 基因模型組實驗結果（圖4A-圖4D）和藥理模型組實驗結果（圖4E-圖4H），顯示基因模型組FoxP3 mRNA的表達量減少（圖4A）。在吉非替尼治療組，IL-1A蛋白水平和IL-1A相對IL-1RA比率明顯升高（圖4G，圖4H）。

3 討論

圖1 HARS轉染角質細胞移植至免疫同源FVB/N小鼠背部成瘤。A：基因組EGFRflx/flx腫瘤生長較野生基因型組EGFRwt/wt遲緩；B：藥理組連續(xù)1周系統(tǒng)性喂食吉非替尼小鼠體積較對照組較小。*P＜0.05。Fig1 Tumors originated from HRAS transformed FVB/N primary keratinocytes grafted on the back of immunocompetent syngeneic mice. A: EGFRflx/flx keratinocytes that formed the malignant squamous tumors are smaller formed from than the EGFRwt/wt; B: Pharmacological blockade of EGFR by systemic administration of gefitinib or 10% DMSO for 1 week, the former tumors are smaller. *P＜0.05.

圖2 基因組小鼠腫瘤酶消化懸液細胞分析。EGFRflx/flx相對于EGFRwt/wt組，PD-1陽性CD4+ T細胞比例降低（A），F(xiàn)oxP3陽性CD4+ T細胞比例也明顯下降（B）。EGFRwt/wt組樣本PD-1陽性CD4+T為77.34%（C），同源EGFRflx/flx樣本PD-1陽性CD4+ T為55.33%（D）。*P＜0.05。Fig 2 FACS analysis the tumor cell suspensions in the genetic model.EGFRflx/flx keratinocytes formed tumors vs the EGFRwt/wt, the proportion of PD-1 positive CD4+ T cells decreased (A), FoxP3 positive CD4+T cell ratio was also significantly decreased (B). A sample from EGFRwt/wt group, the PD-1 positive CD4+ T ratio was 77.34% (C),the ratio of EGFRflx/flx sample PD-1 positive CD4+ T was 55.33% (D).*P＜0.05.

圖3 藥理組小鼠腫瘤酶消化懸液細胞分析。Gefitinib相對于DMSO組，PD-1陽性CD4+ T細胞比例差異不明顯（A），F(xiàn)oxP3陽性CD4+/CD25+T細胞比例差異不具有統(tǒng)計學意義（B）。Gefitinib組樣本PD-1陽性CD4+ T為73.44%（C），同源DMSO組樣本PD-1陽性CD4+ T為73.76%（D）。*P＜0.05。Fig 3 FACS analysis the tumor cell suspensions about pharmacological blockade of EGFR. Systemic administration by gefitinib or 10%DMSO for 1 week, the proportion of PD-1 positive CD4+ T cells had no difference (A), so as the FoxP3 positive CD4+CD25+ T cell ratio (B).A sample from gefitinib group,the PD-1 positive CD4+ T ratio was 73.44% (C), the ratio of DMSO sample was 55.33% (D). *P＜0.05.

圖4 mRNA和炎性介質蛋白表達情況。A、B：基因組mRNA表達；E、F：藥理組mRNA表達；C、D：基因組模型炎性介質蛋白表達；G、H：藥理組模型炎性介質蛋白表達。其中基因或藥理阻斷EGFR用數(shù)據(jù)用紅色表示，具有活性的EGFR組數(shù)據(jù)用藍色表示。*P＜0.05。Fig 4 Analysis about mRNA and inflammatory mediators expression. A and B for the genetic model while E and F for the pharmacologic model of mRNA analysis. C and D in the genetic model while G and H in the pharmacologic model of inflammatory mediators analysis. Genetic and pharmacological blockade of EGFR is indicated in red while active EGFR is indicated in blue. *P＜0.05.

為了探究肺鱗癌的自主免疫變化，我們將角質細胞經改造后移植到同源小鼠背部以形成腫瘤。在基因模型中，腫瘤生長持續(xù)受到抑制，這是由于致癌基因RAS信號通路需要腫瘤上皮細胞表面EGFR的參與[8]。對于藥理模型，使用小分子靶向藥物吉非替尼，主要檢測系統(tǒng)性阻斷EGFR引發(fā)的直接后果對免疫微環(huán)境前期變化的影響。為了排除腫瘤細胞死亡或是壞死帶來的影響，我們只對系統(tǒng)性阻斷EGFR前期的相關變化進行研究。通過流式細胞儀分析酶消化腫瘤獲得的細胞懸液，發(fā)現(xiàn)基因模型組小鼠FoxP3陽性CD4細胞比例明顯降低，F(xiàn)oxP3 mRNA含量減少，證實EGFR對于肺鱗癌免疫微環(huán)境具有調節(jié)作用。由于腫瘤的異質性及吉非替尼治療時間短，藥理組模型很少觀察到顯著差異。經過1周吉非替尼治療，F(xiàn)oxP3陽性CD4+/CD25+細胞減少，F(xiàn)oxP3 mRNA的表達趨于減少，但PD-1的表達未減少。吉非替尼治療不僅影響表達EGFR的轉化角質細胞，也將影響表達EGFR的基質細胞。而EGFR配體雙調蛋白，增強Treg的抑制作用[9]。這表明通過腫瘤細胞自主性和系統(tǒng)性的途徑阻斷EGFR都將改變腫瘤微環(huán)境中Treg的活性，可能有助于免疫抑制腫瘤生長的作用。在這兩個模型中，TGFB1 mRNA 、CTLA4 mRNA表達降低趨勢。吉非替尼組的IL-1A蛋白水平和IL-1A相對IL-1RA比率明顯升高。有體外實驗證實[10]，IL-1A、IL-1R自分泌環(huán)是EGFR依賴的致癌基因RAS信號通路的關鍵之一。相反，免疫功能正常小鼠通過藥理阻斷EGFR活性，惡性腫瘤引起IL-1A蛋白水平的顯著提升。腫瘤細胞EGFR基因缺失未引起IL-1A的顯著提升表明IL-1A表達的升高是吉非替尼影響腫瘤微環(huán)境中其他細胞產生的。我們期望Foxp3Treg降低以抑制腫瘤的生長，但并不希望IL-1A升高，中和IL-1A成為治療慢性炎癥疾病和肺鱗癌的另一方向[11]。IL-1A的表達影響EGFR抑制劑發(fā)揮作用并與肺鱗癌患者的預后負相關提示我們可以將抗EGFR與抗IL-1A治療聯(lián)合使用。我們的研究表明，系統(tǒng)性阻斷EGFR，使得Treg快速減少，而IL-1A/IL-1RA比例迅速上升，以快速改變腫瘤微環(huán)境。腫瘤細胞EGFR阻斷還有利于Treg的差異性浸潤。

以上研究為進一步探究EGFR阻斷劑所產生的免疫影響，特別是改變Treg數(shù)量與IL-1A水平，以改變腫瘤微環(huán)境提供依據(jù)。