趙相鵬汪琳*尹羿蒲靜任彤高志強(qiáng)張偉劉鳳華史雅然

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026；2.北京農(nóng)學(xué)院）

豬繁殖與呼吸綜合征LAMP檢測(cè)方法建立

趙相鵬1汪琳1*尹羿1蒲靜1任彤1高志強(qiáng)1張偉1劉鳳華2史雅然2

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026；2.北京農(nóng)學(xué)院）

以豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）ORF6基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立PRRSV RT-LAMP檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法的靈敏度與熒光RT-PCR檢測(cè)方法相近，高于普通RT-PCR檢測(cè)方法，約2 h即可得出結(jié)果，不需要昂貴的儀器設(shè)備，適于豬場(chǎng)PRRSV的監(jiān)測(cè)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；RT-LAMP

1 前言

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），曾稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”“豬瘟疫”“豬流行性流產(chǎn)和呼吸綜合征”等，由豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起，其以妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬和肥育豬的呼吸道癥狀為特征[1，2]，我國(guó)將其列為二類(lèi)傳染病。PRRS病毒（PRRSV）是一種單股正鏈的RNA病毒，基因組長(zhǎng)約15 kb，具有9個(gè)開(kāi)放閱讀框架（ORFs）。常用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法為普通RTPCR和熒光RT-PCR，其中熒光RT-PCR是國(guó)際上公認(rèn)的快速準(zhǔn)確技術(shù)之一，但設(shè)備昂貴[3-7]，很多基層養(yǎng)豬場(chǎng)無(wú)法購(gòu)買(mǎi)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）不需要模板熱變性[8，9]，僅需普通水浴鍋就能完成[10]。本項(xiàng)目針對(duì)美洲型PRRSV建立了RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)特異性、靈敏度實(shí)驗(yàn)和臨床樣本檢測(cè)，表明RT-LAMP檢測(cè)方法的靈敏度與熒光RT-PCR方法相當(dāng)，擴(kuò)增效率高，特異性強(qiáng)，結(jié)果判定簡(jiǎn)單，適合基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

TRIZOL：購(gòu)自Invitrogen公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP：購(gòu)自Promega公司；Bst DNA 聚合酶：購(gòu)自NEB公司；Betaine：購(gòu)自Sigma公司；SYBR Green I： 購(gòu)自 Invitrogen 公司；HNB（Hydroxynaphthol blue）：分子式 C20H11N2Na3O11S3，M＝620.47 g/Mol，購(gòu)自Fluka公司；Taq DNA聚合酶和PCR相關(guān)試劑：購(gòu)自Promega公司；PRRS病毒美洲型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒：實(shí)驗(yàn)室研制；RNA酶抑制劑：購(gòu)自Promega公司；Trizol裂解液：購(gòu)自Ambion公司；氯仿、無(wú)水乙醇：均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；75%乙醇，用新開(kāi)啟的分析純無(wú)水乙醇和DEPC水（符合GB 6682-92要求）配制，-20℃預(yù)冷。

2.1.2 主要儀器

臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)：Eppendorf 5417R，離心速度可達(dá)12 000 r/min；臺(tái)式電子天平：IKA RCT basic；常規(guī)PCR儀：ABI 9700；熒光PCR檢測(cè)儀：ABI 7900HT，Roche 1.1。

2.1.3 滅活病毒及核酸

研究過(guò)程中應(yīng)用到的病毒株有滅活的美洲型PRRSV VR2332、滅活美洲型PRRSV 07-45株、滅活高致病性PRRSV 07-14株、滅活高致病性PRRSV 07-14株、滅活歐洲型PRRSV LV、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒C株核酸和豬鏈球菌2型ZY株核酸：均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2.2 方法

2.2.1 病毒RNA的提取

向加有600 μL裂解液的滅菌離心管中加入待測(cè)樣本200μL，用吸頭反復(fù)吸打混勻；再加入200 μL氯仿，混勻器上振蕩混勻5 s（不宜過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層），離心（12 000 g，15 min）；另取滅菌離心管，加入 600 μL 異丙醇（-20℃預(yù)冷），并加入上述離心后的上層液相（注意不要吸出中間層，該層富含DNA和蛋白質(zhì)），顛倒混勻，離心（12 000 g，15 min）；輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，吸干液體；加入600 μL 75%乙醇（-20℃預(yù)冷），顛倒洗滌，離心（12 000 g，10 min）；輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，盡量吸干液體；10 000 g離心5 s，將管底部少量液體用微量加樣器吸干，室溫干燥5 min；于干燥后的沉淀中加入11 μL DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA（即為所需 RNA）。

2.2.2 引物的設(shè)計(jì)

為確保探針的保守性和特異性，針對(duì)目前已知的3個(gè)不同亞群的PRRSV核酸[11]，選取ORF6基因編碼區(qū)特定序列作為靶區(qū)域，應(yīng)用DNA MAN在多重序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（見(jiàn)圖1）。引物FIP和BIP針對(duì)的2個(gè)擴(kuò)增區(qū)域之間用TTTT進(jìn)行連接，以便于擴(kuò)增時(shí)成環(huán)。

圖1 PRRSV美洲型3個(gè)不同亞群的的序列比對(duì)和引物設(shè)計(jì)

2.2.3 引物的篩選

對(duì)引物進(jìn)行篩選試驗(yàn)。RT-PCR引物為P1和P2，擴(kuò)增片段為236 bp；LAMP引物為：PRRS1-F3、PRRS1-B3、PRRS1-FIP、PRRS1-BIP、PRRS2-F3、PRRS2-B3、PRRS2-FIP、PRRS2-BIP。

2.2.4 RT-LAMP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

MgSO4、betaine、dNTP 的濃度以及反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)LAMP反應(yīng)效率有一定影響，通過(guò)逐一優(yōu)化，確定反應(yīng)體系和條件（表1），以期達(dá)到最佳擴(kuò)增效率。

PRRSV美洲型07-14提取RNA后，將RNA 1∶104稀釋后，進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為60℃/60 min，80℃/15 min。

表1 RT-LAMP反應(yīng)體系

2.2.5 靈敏度試驗(yàn)

將PRRSV 07-14核酸作10-1-10-8倍稀釋?zhuān)謩e用RT-LAMP、普通RT-PCR和熒光RT-PCR檢測(cè)，比較方法的靈敏度。

2.2.6 特異性試驗(yàn)

用所建立的RT-LAMP方法對(duì)歐洲型PRRSV LV核酸、豬偽狂犬病病毒核酸、豬瘟病毒C株核酸、豬鏈球菌2型ZY株核酸分別進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證方法的特異性。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

連續(xù)3次分別用建立的RT-LAMP方法對(duì)病毒07-14核酸的 10-5、10-6、10-7稀釋液進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，以驗(yàn)證方法的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.2.8 快速顯色研究

在建立RT-LAMP檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，分別將SYBR Green I和HNB兩種染色液加入反應(yīng)體系，比較顯色情況。SYBR Green I購(gòu)買(mǎi)后直接使用；HNB為粉末，稱(chēng)量0.946 g，用DEPC水定容于50 mL離心管中。取6支1.5 mL離心管，每管加入900 μL DEPC水，再分別加入100 μL 30 mmol/L HNB，配成3 mmol/L HNB溶液。

2.2.9 對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

某地區(qū)數(shù)個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集的病料 （各種內(nèi)臟和肌肉組織）49份，用建立的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，并與熒光RT-PCR和常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 引物篩選結(jié)果

采用上述條件，篩選出能檢出所用3株美洲型病毒核酸，且擴(kuò)增穩(wěn)定的引物對(duì)，即PRRS2-F3、PRRS2-B3、PRRS2-FIP、PRRS2-BIP（圖 2）。

圖2 引物篩選試驗(yàn)結(jié)果

3.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

用建立的RT-LAMP檢測(cè)PRRSV 07-14核酸10-1-10-8稀釋液，結(jié)果顯示該方法的靈敏度達(dá)到10-8（圖3-圖4）。用建立的方法與熒光定量RT-PCR方法和常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖3RT-LAMP對(duì)PRRSV 07-14核酸檢測(cè)靈敏度

圖4 加入SYBR Green I進(jìn)行染色的結(jié)果

圖5 RT-LAMP與熒光定量RT-PCR和常規(guī)RT-PCR的比較

圖5顯示，建立的方法靈敏度與熒光定量RTPCR方法相近，但明顯高于常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法。

3.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示特異性良好，無(wú)交叉反應(yīng)（圖6）。

圖6 RT-LAMP的特異性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)稀釋度的病毒核酸均為陽(yáng)性，重復(fù)性好。

3.5 快速顯色研究

結(jié)果顯示，SYBR Green I在反應(yīng)前加入反應(yīng)體系會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果，且顯色明顯程度不如HNB；而HNB在反應(yīng)前加入反應(yīng)體系不影響擴(kuò)增效果（圖7）。

圖7 HNB染色結(jié)果

3.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

49份病料用建立的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，并與熒光RT-PCR和常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示RT-LAMP與熒光RTPCR結(jié)果完全一致，符合率100%，陽(yáng)性檢出率高于普通RT-PCR。

表2 49份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

本項(xiàng)目建立的LAMP檢測(cè)方法特異性良好，與豬瘟病毒核酸、豬偽狂犬病毒核酸以及豬鏈球菌2型核酸無(wú)交叉反應(yīng)。臨床樣本檢測(cè)顯示RT-LAMP檢測(cè)方法的靈敏度與熒光RT-PCR一致，完全可用于養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、診斷PRRSV。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)LAMP由于產(chǎn)物量大，開(kāi)蓋檢測(cè)很容易發(fā)生氣溶膠污染，因此在反應(yīng)前加入顯色劑，反應(yīng)結(jié)束后不開(kāi)蓋就能判讀結(jié)果，有利于檢測(cè)質(zhì)量控制。

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LAMP Detection Method for PRRSV

ZHAO Xiangpeng1， WANG Lin1*， YIN Yi1， PU Jing1， REN Tong1， GAO Zhiqiang1，ZHANG Wei1， LIU Fenghua2， SHI Yaran2
（1.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Beijing， 100026；2.Beijing Agricultural College）

The porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） RT-LAMP detection method was built.ORF6 gene of PRRSV is as the target gene，and 2 pairs of primers were designed.The sensitivity is equal as fluorescent RT-PCR detection method，more sensitivity than the common RT-PCR method.The result can be get in about 2 hours，and the expensive instrument isn't necessary.The LAMP detection method is suitable for the PRRS virus in farm.

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome；LAMP

S851.34；Q789

E-mail：zhaoxp@bjciq.gov.cn；*通訊作者E-mail：wanglin@bjciq.gov.cn

北京市科技計(jì)劃課題 （D171100002117002）

2017-01-21