王佳慧，于欣悅，廖聲玲，陳思珂，趙陽，符群

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150040)

樹莓中鞣花酸提取工藝的優(yōu)化

王佳慧，于欣悅，廖聲玲，陳思珂，趙陽，符群*

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150040)

以紅樹莓為原料，無水乙醇作為提取溶劑，采用超聲波輔助提取紅樹莓中的鞣花酸，分析料液比、提取時間和提取溫度對鞣花酸得率的影響,在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化紅樹莓中鞣花酸提取工藝。結(jié)果表明，鞣花酸的最佳提取工藝條件為料液比1∶14.04 (g/m L)、提取時間 19.72 min、提取溫度80.02 ℃，此條件下鞣花酸得率為670.28 μg/g，驗證實驗得率為675.134 μg/g，相對誤差 0.72% ,模型可靠。

紅樹莓；鞣花酸；響應(yīng)面法；提??；單因素試驗

樹莓(Raspberry)是薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)多年生落葉性灌木型果樹，又名馬林、木莓、托盤等。以東北分布較多，華北、華東及華中地區(qū)也開始種植[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，覆盆子(樹莓)是世界上最好的花青素、SOD 和鞣花酸來源之一[2]。鞣花酸 ( ellagic acid，EA) 是沒食子酸的二聚衍生物，是一種多酚二內(nèi)酯，紅樹莓是天然鞣花酸含量最高的水果，其含量可達230mg/kg[3]。成熟樹莓鞣花酸對抗氧化活性的貢獻率高達60%,對化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的癌變具有明顯的抑制作用，特別是對結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、肺癌及皮膚腫瘤等有很好的抑制效果[4]。臨床實驗證明 , 紅莓的鞣化酸很容易被人體吸收，能引起腫瘤細胞的凋亡 ,食用紅樹莓將是抑制某些癌癥發(fā)生的一種簡單、有效的自然療法。所以歐美稱它為“紅寶石”“癌癥的克星”[5-6]。因此，基于紅樹莓中鞣花酸的含量豐富，以及鞣花酸具有較高的開發(fā)和利用價值，本文對紅樹莓中鞣花酸的提取工藝進行了研究，以期對于樹莓綜合利用及產(chǎn)業(yè)化推進提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓，黑龍江省尚志市米秋林漿果種植專業(yè)合作社；鞣花酸標品(96%)上海源葉生物；其他試劑，均為國產(chǎn)分析純。

KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；T6紫外可見光分光光度儀 北京普析通用儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鞣花酸標準曲線的制備。精確稱取0.0106 g鞣花酸標品，加約5 mL(0.0l mol/L)NaOH溶解，加水定容至1000 mL，分別吸取2、10、15、25、50mL于100 mL容量瓶中，加水稀釋定容至刻度線，配成質(zhì)量濃度依次為 0.212、1.060、1.590、2.650和5.300 μg / mL的對照品稀釋液，在紫外光譜掃描的最大吸收波長288.5 nm下，測定不同濃度對照品溶液的吸光度，以鞣花酸標準品溶液質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標，相應(yīng)的吸光度( A)為縱坐標，繪制標準曲線[7]。

1.2.2 鞣花酸含量的測定。樹莓果提取鞣花酸，用水定容至250 mL容量瓶，用紫外分光光度儀測其吸光值，根據(jù)標準曲線回歸方程計算鞣花酸質(zhì)量濃度，再推算出鞣花酸質(zhì)量，計算提取液中鞣花酸的提取率[8]。

式中：X為鞣花酸提取率，%；U為提取液中鞣花酸質(zhì)量濃度，μg /mL；a為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；M為原料質(zhì)量，g。

1.2.3 超聲波輔助提取鞣花酸的單因素試驗。預(yù)實驗顯示，超聲功率對于鞣花酸提取率的影響不顯著，因此選取 210 W的超聲條件，進行溫度、時間及料液比的單因素試驗。

1.2.3.1 溫度對鞣花酸含量的影響：準確稱取30g紅樹莓果漿，提取料液比1∶5(g/mL)，時間30 min，超聲波功率為240 W，采用5個提取溫度(65、70、75、80、85 ℃)采用1.2.2方法提取鞣花酸。

1.2.3.2 提取時間對鞣花酸含量的影響：準確稱30 g紅樹莓果漿，提取料液比1∶5(g/mL)，溫度為55 ℃，超聲波功率為240W，采用5個提取時間(10、20、30、40、50 min)采用1.2.2方法提取鞣花酸。

1.2.3.3 料液比對鞣花酸含量的影響：準確稱10g紅樹莓果漿，時間為40 min，溫度為40 ℃，超聲波功率為210 W，采用4個料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)采用1.2.2方法提取鞣花酸。

1.2.4 Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，每個因素選取3個對鞣花酸得率影響較大的水平，建立三因素三水平的Box-Benhnken[9]中心組合實驗，以鞣花酸得率為響應(yīng)值，各因素的三個水平采用-1、0、1進行編碼，如表1。

表1 響應(yīng)曲面設(shè)計實驗因素水平和編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 溫度對鞣花酸得率的影響。由圖1可知，鞣花酸得率隨溫度升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，溫度在80℃時，鞣花酸得率呈現(xiàn)最大值，之后隨溫度下降呈現(xiàn)減小趨勢。這是由于隨著溫度的升高，分子熱運動速度加快,滲透、擴散、溶解速度加快,使鞣花酸更容易從細胞中轉(zhuǎn)移到溶劑中，從而使鞣花酸的得率提高；當溫度上升到一定程度時，部分鞣花酸可能被氧化破壞，或者由于鞣花酸分子結(jié)構(gòu)改變，從而使其得率不再增加甚至下降。因此，選擇提取溫度80 ℃為宜。

圖1 溫度對鞣花酸得率的影響

2.1.2 料液比對鞣花酸得率的影響。由圖2可知，鞣花酸得率隨料液比增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，料液比在1∶15時，鞣花酸得率呈現(xiàn)最大值。這可能是由于在一定體積范圍內(nèi)，增加浸提液體積可增大浸提液與浸提物的接觸面積，使鞣花酸能在乙醇中較多的溶出，隨浸提液體積增加鞣花酸溶出達到飽和，增加浸提液體積無明顯變化或略有減小。所以選擇料液比以1∶15為宜。

圖2 料液比對鞣花酸得率的影響

2.1.3 時間對鞣花酸得率的影響。由圖3可知，隨著超聲時間的延長提取物中鞣花酸的得率增加, 繼續(xù)延長提取時間20 min時，鞣花酸得率呈現(xiàn)最大值，這可能是由于時間較短時，鞣花酸溶出不完全，當時間延長到20 min時，鞣花酸溶出達到最大值；之后隨溫度下降呈現(xiàn)減小趨勢，原因可能是延長提取時間的同時也延長了鞣花酸在空氣中的氧化時間, 影響得率。所以，時間在20 min時最佳。

圖3時間對鞣花酸得率的影響

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果

根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，以鞣花酸得率為響應(yīng)值，以溫度(A)，時間(B)，料液比(C)為自變量，進行三因素三水平的17組響應(yīng)面分析實驗，經(jīng)過Design-Expert 8.0.6 trial設(shè)計出的實驗方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及鞣花酸得率

2.2.2 回歸方程的擬合及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到回歸方程：鞣花酸得率=+673.65+0.040×A-1.59×B-15.25×C-4.44×A×B-2.71×A×C+0.57×B×C-79.63×A2-31.57×B2-39.85×C2對模型進行回歸分析，結(jié)果如表3所示。

回歸模型的R2=0.9727，說明該模型預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果吻合較好,97.27%數(shù)據(jù)可以次方程解釋，R2adj=-0.9376。模型F值為27.72，顯著性檢驗P=0.0001<0.05，表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。有0.01%可能性模型是因為噪聲。失擬項P=0.5171>0.05不顯著，意味著模型穩(wěn)定，能很好的預(yù)測實際過程中鞣花酸得率的變化[10-11]。變異系數(shù)(CV)為2.18%，說明置信度較高。自變量料液比(C)，溫度二次項(A2)，時間二次項(B2)，料液比二次項(C2)對響應(yīng)值影響顯著。由單因素影響來看，料液比(C)>時間(B)>溫度(A)。

表3 回歸模型及方差分析

注：**P<0.01為極顯著；*P<0.05為顯著

2.2.3 響應(yīng)面曲面分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各實驗因子A，B，C所構(gòu)成的三維空間曲面圖。從響應(yīng)面圖上可看出各因素的交互影響。

圖4為料液比一定時，溫度和時間對鞣花酸得率的影響。可以看出，時間一定時，適當升高溫度可以提高鞣花酸得率，持續(xù)升高溫度顯著影響得率變化，甚至得率有下降趨勢?？赡苡捎跍囟容^低時，鞣花酸的性質(zhì)穩(wěn)定，而溫度升高導(dǎo)致鞣花酸的分解，或是其他成分溶出導(dǎo)致有效含量的減少。最高值可達到最低值的2倍。溫度一定時，得率隨時間的增加先增后減?？赡苡捎跁r間的延長導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出，增加溶液的粘稠性，對鞣花酸有吸附作用，導(dǎo)致不能快速擴散析出[11]。由等高線圖可知，溫度與時間的交互影響作用較顯著。

圖5為時間不變時，溫度和料液比對鞣花酸得率的影響。溫度和料液比較低時，隨著溫度升高與料液比的增加，鞣花酸得率先升高，而后急劇下降?？赡苡捎跍囟壬撸涌祺坊ㄋ岬臄U散，而溫度較高對鞣花酸穩(wěn)定性有破壞作用，使鞣花酸發(fā)生氧化，以及料液比的增加導(dǎo)致樹莓中其他雜質(zhì)的溶出，乙醇體積太高導(dǎo)致滲透壓增大，鞣花酸溶解度下降。由3D圖可以看出，溫度和料液比兩因素的交互作用比較顯著。

圖6顯示，溫度不變時，時間和料液比對鞣花酸得率的影響。時間一定時，鞣花酸得率隨料液比增加先增加后減小。料液比一定時，鞣花酸得率隨時間增加稍有增加，趨勢不大。原因可能是，時間一定，鞣花酸已經(jīng)提取完全，再增加溶劑，對鞣花酸有稀釋作用，或溶出其他物質(zhì)增多。時間和料液比交互并不明顯。

圖4 溫度時間的交互影響與等高線

圖5 溫度料液比的交互影響與等高線

圖6 時間料液比的交互影響等高線

2.2.4 最佳條件的驗證

對回歸方程求解，得率達到最大時提取條件為溫度80.02℃，時間19.72 min，料液比1∶14.04,最大鞣花酸得率為675.134 μg/g。為便于實際操作，選取溫度80℃，時間20 min，料液比1∶14進行驗證實驗。經(jīng)驗證，平均得率為670.28 μg/g，理論值與實際值吻合，證明用響應(yīng)面法可以優(yōu)化鞣花酸的提取工藝。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對樹莓鞣花酸提取工藝進行優(yōu)化，建立鞣花酸得率的回歸模型，得到的最佳提取工藝條件為料液比1∶14.04(g/mL)、提取時間 19.72 min、提取溫度80.02℃，此條件下鞣花酸得率為675.134 μg/g，與模型預(yù)測結(jié)果接近，證實了模型的可靠性。

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OptimizationofExtractionProcessofEllagicAcidfromRaspberry

Wang Jiahui, Yu Xinyue, Liao Shengling, Chen Sike, Zhao Yang,Fu Qun*
( School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040)

With raspberry as raw materials and anhydrous ethanol as solvent extraction, ultrasonic assisted extraction of raspberry ellagic acid, the analysis of material liquid ratio, extraction time and extraction temperature on the effect of ellagic acid yield, on the basis of single factor experiment, red raspberry were optimized by response surface tests of ellagic acid extraction process. Results show that the best extraction technology conditions for the material liquid ratio 1∶14.04 (g/mL), extraction time 19.72 min, extraction temperature 80.02℃, under the condition of the ellagic acid yield of 670.28 (μg/g), and the validation value 675.134 μg/g.，and the relative error is 0.72%.

Red raspberry;Ellagic acid;Response surface;Extraction;Single factor experiment

2017-04-15

符群(1974-)，女，高級工程師,研究方向：天然產(chǎn)物提取與活性研究，E-mail：nefufuqun@163.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.04.004

TS201.1

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