李 錚，李 欣，杜曼婷，李 蒙，張德權(quán)*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

肌原纖維蛋白磷酸化對其被μ-鈣蛋白酶降解的影響

李 錚，李 欣，杜曼婷，李 蒙，張德權(quán)*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

目的：研究肌原纖維蛋白磷酸化對其被μ-鈣蛋白酶降解的影響。方法：以羊背最長肌肌原纖維蛋白為原料，添加蛋白激酶A和堿性磷酸酶催化磷酸化和去磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)后加入μ-鈣蛋白酶，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和熒光染色、蛋白質(zhì)免疫印跡測定肌原纖維蛋白的磷酸化水平、蛋白降解程度。結(jié)果：蛋白激酶A處理組肌原纖維蛋白磷酸化水平顯著高于對照組（P＜0.05）；堿性磷酸酶處理組肌原纖維蛋白磷酸化水平顯著低于對照組（P＜0.05）；蛋白激酶A處理抑制μ-鈣蛋白酶自溶，降低其活性，延長其發(fā)揮活性的時間；蛋白激酶A處理促進肌球蛋白重鏈及肌鈣蛋白T降解；堿性磷酸酶處理促進肌動蛋白及肌間線蛋白降解。結(jié)論：磷酸化通過作用于μ-鈣蛋白酶活性及肌原纖維蛋白進而影響μ-鈣蛋白酶降解肌原纖維蛋白。

磷酸化；肌原纖維蛋白；μ-鈣蛋白酶；降解；蛋白激酶A；堿性磷酸酶

我國是畜禽肉生產(chǎn)和消費大國，嫩度是評價肉品品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，影響肉嫩度的主要因素有肌肉結(jié)構(gòu)蛋白被降解的程度、肌節(jié)長度及結(jié)締組織含量。蛋白質(zhì)降解的主要途徑有鈣蛋白酶系統(tǒng)、溶酶體系統(tǒng)、線粒體蛋白酶系統(tǒng)、泛素-蛋白酶體途徑等，蛋白降解過程中鈣蛋白酶參加的肌原纖維蛋白降解是限速步驟，是宰后影響肌肉嫩化的重要因素[1-3]。鈣蛋白酶系統(tǒng)是肉品科學(xué)領(lǐng)域研究最廣泛的酶系統(tǒng)之一，宰后初期μ-鈣蛋白酶起主要的降解肌原纖維蛋白的作用，μ-鈣蛋白酶在宰后前3 d內(nèi)被Ca2+激活發(fā)生自溶，并發(fā)揮水解蛋白活性[4]。鈣蛋白酶可以破壞肌肉的超微結(jié)構(gòu)，尤其使Z線弱化并消失，從而促進肌原纖維小片段化和肉的嫩化[5]。肌動蛋白、肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈、原肌球蛋白、肌間線蛋白、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I等均為μ-鈣蛋白酶的降解底物[6-7]。

蛋白質(zhì)會發(fā)生多種轉(zhuǎn)錄后修飾現(xiàn)象，如磷酸化、甲基化、乙?；?、糖基化等，轉(zhuǎn)錄后修飾可以通過改變蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象影響其性質(zhì)或者調(diào)解其功能[8]。蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)是指由蛋白激酶催化的將ATP或GTP上γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過程，該反應(yīng)主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基側(cè)鏈的羥基上。Chen Lijuan等[8]研究表明嫩度高的肌肉中肌原纖維蛋白磷酸化水平低，嫩度低的肌肉中肌原纖維蛋白磷酸化水平高。D’Alessandro等[9-11]研究表明低嫩度牛肉中Z線相關(guān)蛋白（肌收縮蛋白、肌聯(lián)蛋白、肌鈣蛋白T等）磷酸化水平高，且Z線相關(guān)蛋白磷酸化水平高可能會導(dǎo)致蛋白之間作用增強以及蛋白酶對蛋白的酶解作用減弱，進而導(dǎo)致肉嫩度低。另外，Huang Honggang等[12-13]研究指出，宰后pH值下降速率影響嫩度，而pH值下降速率差異的肉中存在多種磷酸化水平差異的肌原纖維蛋白。以上研究均說明肌原纖維蛋白磷酸化影響肉的嫩度，宰后肌肉中仍發(fā)生磷酸化和去磷酸化反應(yīng)，磷酸化水平隨宰后時間動態(tài)變化，但磷酸化對各種肌原纖維蛋白的作用機制還有待進一步研究。

前人的研究將富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸及蘇氨酸的易被μ-鈣蛋白酶降解的蛋白區(qū)域命名為PEST區(qū)[14]，一些醫(yī)學(xué)相關(guān)研究指出該區(qū)域因含有絲氨酸及蘇氨酸使其易發(fā)生磷酸化修飾，進而降低μ-鈣蛋白酶對該區(qū)域的靈敏度[15-17]。但在宰后肌肉成熟過程中，磷酸化是否會影響肌原纖維蛋白的降解目前尚不明確，磷酸化是否通過作用于肌原纖維蛋白降解進而調(diào)控宰后肌肉嫩度尚不清楚。本研究以羊背最長肌為原料，提取肌原纖維蛋白，通過堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）及蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）分別催化肌原纖維蛋白的去磷酸化及磷酸化反應(yīng)，研究μ-鈣蛋白酶對不同磷酸化水平的肌原纖維蛋白降解的程度，明確肌原纖維蛋白磷酸化對其被μ-鈣蛋白酶降解的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取飼養(yǎng)條件相同的3 只10 月齡的小尾寒羊與大尾寒羊的雜交公羊，平均胴體質(zhì)量約25 kg，在北京市昌平區(qū)商業(yè)化的屠宰場屠宰。宰后30 min內(nèi)取羊背最長肌，在十三肋附近取約100 g肉，剔除可見的結(jié)締組織及筋膜，分裝于凍存管中液氮速凍后于-80 ℃保存。

μ-鈣蛋白酶（208712） 美國Calbiochem公司；蛋白激酶A（PKA、P2654）、堿性磷酸酶（AP、P0114）、鼠抗-肌球蛋白抗體（M4276） 美國Sigma公司；蛋白濃度測定試劑盒（PL212238） 美國Thermo Fisher Scientific公司；Pro-Q Diamond、SYPRO Ruby染色液 美國Invitrogen公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris Base）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、氯化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉（均為分析純） 北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra Turrax Disperser S25分散器 德國IKA公司；Himac CR 22 GII高效冷凍離心機 日本Hitachi公司；恒溫振蕩金屬浴 杭州奧盛儀器有限公司；SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；電泳設(shè)備（Mini-PROTEAN Tetra System）、半干轉(zhuǎn)膜設(shè)備（Trans-Blot TurboTM）、ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

肌原纖維蛋白提取參考Smuder等[18]的方法。取1 g肉，加入5 mL肌原纖維蛋白提取溶液（0.039 mol/L四硼酸鈉、0.025 mol/L KCl、5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸，1 片/50 mL蛋白酶抑制劑，pH 7.1），勻漿后于1 500×g離心12 min（4 ℃）。棄去上清液，向沉淀中加入5 mL 0.1 mol/L KCl（含1.0% Triton X-100），勻漿后于1 500×g離心12 min（4 ℃），此步驟重復(fù)兩次。最后將沉淀溶于0.4 mol/L KCl、0.05 mol/L三羥基氨基甲烷、0.001 mol/L二硫蘇糖醇溶液中。用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至4 mg/mL。向蛋白溶液中分別加入溶解好的ATP（0.2 μmol/10 μg pro）、PKA（1 U/10 μg pro）或AP（1 U/4 μg pro）催化磷酸化或去磷酸化反應(yīng)，對照組不含PKA及AP，在30 ℃振蕩孵育30 min。加入μ-鈣蛋白酶（1 U/10 μg pro），加入CaCl2使反應(yīng)體系Ca2+濃度為0.01 mol/L，在37 ℃反應(yīng)5、10、30 min，加入Laemmli電泳樣品緩沖液，沸水浴5 min終止反應(yīng)，冷卻后于10 000×g離心3 min取上清液備用。

1.3.2 蛋白磷酸化水平的分析

采用4 g/100 mL丙烯酰胺濃縮膠和12 g/100 mL丙烯酰胺分離膠進行電泳，濃縮膠電壓70 V，分離膠電壓110 V。電泳結(jié)束后采用Pro-Q Diamond對磷酸化蛋白染色，采用Ruby對全蛋白染色，染色流程參照Chen Lijuan等[8]的方法。采用Quantity One 4.6.2軟件對凝膠成像系統(tǒng)拍照的凝膠圖片進行光密度值分析，選取磷酸化蛋白條帶，分析各條帶光密度，再對應(yīng)分析各條帶全帶白光密度，以磷酸化蛋白的Pro-Q Diamond染色光密度（P）與全蛋白的SYPRO Ruby染色光密度（T）之比表示蛋白質(zhì)磷酸化水平（P/T）。

1.3.3 蛋白降解分析

采用免疫印跡方法分析肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、肌間線蛋白、肌鈣蛋白T及μ-鈣蛋白酶的降解程度，分別使用7.5、12.0、12.0、15.0 g/100 mL及8.0 g/100 mL丙烯酰胺的分離膠及4 g/100 mL丙烯酰胺的分離膠進行電泳，電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上，采用TBS溶液（0.01 mol/L Tris、0.15 mol/L NaCl，pH 7.5）漂洗（3次，2 min/次），用封閉液（含0.05% Tween 20、3%牛血清白蛋白的TBS溶液）室溫搖床振蕩封閉2 h?？贵w分別采用鼠抗-肌球蛋白抗體（M4276，稀釋1 000 倍）、鼠抗-肌動蛋白抗體（A4700，稀釋2 500 倍）、鼠抗肌間線蛋白抗體（D1033，稀釋1 000 倍）、鼠抗-肌鈣蛋白T抗體（ab130003，稀釋1 000 倍）及鼠抗-μ-鈣蛋白酶抗體（C0355，稀釋500 倍），與抗體在4 ℃孵育14 h。采用TBST1溶液（含0.1% Tween 20的TBS溶液）漂洗3 次，然后與羊抗鼠IgG抗體（A9044，用封閉液1∶2 500稀釋）室溫搖床振蕩孵育2 h。采用TBST2溶液（0.05 mol/L Tris、0.15 mol/L NaCl、0.1% Tween 20，pH 7.5）漂洗3 次，用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色劑顯色，使用凝膠成像儀成像。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗均3 次重復(fù)，每個樣品做3 次平行，所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，通過最小顯著差異法（least signif i cant difference，LSD）和鄧肯氏總重比較法（Duncans multiple-rang test）進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌原纖維蛋白磷酸化水平及降解程度分析

采用PKA催化肌原纖維蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)，采用AP催化肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，分析反應(yīng)后肌原纖維蛋白磷酸化水平，結(jié)果如圖1所示。對圖1a所示的磷酸化蛋白（P）及圖1b所示的全蛋白（T）進行光密度值分析，以P/T表示磷酸化水平，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，AP處理組肌原纖維蛋白的磷酸化水平顯著低于對照組（P＜0.05），而PKA處理組肌原纖維蛋白的磷酸化水平顯著高于對照組（P＜0.05），表明AP及PKA起到了催化去磷酸化及磷酸化反應(yīng)的作用。

圖1 肌原纖維蛋白SDS-PAGE磷酸化蛋白與全蛋白染色圖Fig. 1 Gel images of phosphoproteins and total myof i brillar proteins separated by SDS-PAGE

圖2 不同處理組孵育不同時間肌原纖維蛋白的磷酸化水平Fig. 2 Variation in phosphorylation level of myof i brillar proteins with different treatments as a function of incubation time

向肌原纖維蛋白中加入μ-鈣蛋白酶，隨著孵育的進行，如圖1所示，可以觀察到50 kD附近的蛋白條帶消失，此條帶推測為肌間線蛋白；40 kD附近的蛋白條帶在不同處理組之間出現(xiàn)差異，此條帶推測為肌鈣蛋白T；在30 kD附近產(chǎn)生新的降解條帶，此條帶推測為肌鈣蛋白T的降解條帶；另外，在10～15 kD出現(xiàn)新的降解條帶。肌間線蛋白及肌鈣蛋白T是宰后嫩化開始的標(biāo)志，肌球蛋白和肌動蛋白是肌原纖維蛋白中含量最高的兩種蛋白，因此選擇這4 種蛋白進行免疫印跡分析。

2.2 肌球蛋白重鏈降解分析

肌球蛋白是骨骼肌中含量最高的蛋白，是肌粗絲的主要組成部分。采用免疫印跡法對肌球蛋白重鏈降解程度進行分析，結(jié)果如圖3所示。在未處理的肌原纖維蛋白中，肌球蛋白重鏈抗體可以檢測到肌球蛋白重鏈及4 條蛋白條帶，與μ-鈣蛋白酶孵育后，可以檢測到新條帶1，推測此條帶為肌球蛋白重鏈的降解條帶。PKA處理組條帶1的光密度值明顯高于對照組及AP處理組，說明PKA處理組肌球蛋白重鏈降解程度高，磷酸化反應(yīng)促進肌球蛋白重鏈降解。

圖3 不同處理組肌球蛋白重鏈降解分析Fig. 3 Analysis of myosin heavy chain degradation with different treatments

2.3 肌動蛋白降解分析

圖4 不同處理組肌動蛋白降解分析Fig. 4 Analysis of actin degradation with different treatments

肌動蛋白是骨骼肌中含量第二的蛋白，僅次于肌球蛋白，是肌細絲的主要組成部分。采用免疫印跡法對肌動蛋白降解程度進行分析，結(jié)果如圖4所示。本研究中采用ECL顯色并采用ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng)曝光。在自動曝光條件下，當(dāng)顯色區(qū)域有條帶達到飽和則停止曝光，此時只能檢測到肌動蛋白的條帶。在手動曝光條件下，延長曝光時間，膜背景隨之加深，能檢測到肌動蛋白的降解條帶，但肌動蛋白降解條帶分子質(zhì)量和肌動蛋白條帶接近，肌動蛋白條帶信號干擾降解條帶信號，為了避免信號干擾，將肌動蛋白條帶剪掉后再對降解條帶進行曝光?？梢詸z測到3條降解條帶，AP處理組降解條帶灰度值高于對照組，PKA處理組降解條帶光密度值低于對照組，說明磷酸化抑制肌動蛋白降解，而去磷酸化促進肌動蛋白降解。條帶3分子質(zhì)量和圖1中出現(xiàn)在10～15 kD的降解條帶的分子質(zhì)量相似，推測圖1中10～15 kD的降解條帶為肌動蛋白降解條帶。

2.4 肌間線蛋白降解分析

肌間線蛋白是細胞骨架蛋白之一，分子質(zhì)量約為53 kD，連接于Z線之間，維持肌節(jié)間的橫向連接，保持肌細胞的有序性和完整性[19]。采用免疫印跡法對肌間線蛋白降解程度進行分析，結(jié)果如圖5所示。從孵育5 min起，不能檢測到肌間線蛋白，說明肌間線蛋白幾乎被完全降解。可以檢測到2條肌間線蛋白降解條帶，且PKA處理組降解條帶光密度值高于對照組，AP處理組降解條帶光密度值低于對照組，說明磷酸化抑制肌間線蛋白降解，去磷酸化促進肌間線蛋白降解。

圖5 不同處理組肌間線蛋白降解分析Fig. 5 Analysis of desmin degradation with different treatments

圖6 不同處理組肌鈣蛋白T降解分析Fig. 6 Analysis of troponin T degradation with different treatments

肌鈣蛋白T分子質(zhì)量約為35 kD，能結(jié)合原肌球蛋白，起連接作用，和肌鈣蛋白I及肌鈣蛋白C一起發(fā)揮調(diào)解橫紋肌的收縮與舒張。采用免疫印跡法對肌鈣蛋白T降解程度進行分析，結(jié)果如圖6所示。孵育過程中，PKA處理組肌鈣蛋白T被降解程度最高，且只能檢測到1條降解條帶，在AP處理組和對照組中，還可以檢測到多條肌鈣蛋白T的降解條帶，且對照組降解程度高于AP處理組。說明磷酸化促進肌鈣蛋白T降解，去磷酸化抑制肌鈣蛋白T降解。

2.6 μ-鈣蛋白酶自溶分析

μ-鈣蛋白酶是由一個80 kD的催化亞基和一個28 kD的調(diào)節(jié)亞基組成，其80 kD的亞基經(jīng)78 kD自溶至76 kD的過程是其發(fā)揮活性的過程，因此通過免疫印跡分析μ-鈣蛋白酶自溶進而反映其活性，結(jié)果如圖7所示，除μ-鈣蛋白酶條帶，還可以檢測到2 條降解條帶。3 組中μ-鈣蛋白酶條帶光密度值低于μ-鈣蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品，說明在孵育過程中，μ-鈣蛋白酶自溶并發(fā)揮水解活性。PKA處理組中μ-鈣蛋白酶條帶光密度值略高于對照組，AP處理組中μ-鈣蛋白酶光密度值略低于對照組，說明肌原纖維蛋白溶液中的PKA及AP對μ-鈣蛋白酶產(chǎn)生影響，PKA抑制μ-鈣蛋白酶自溶，AP促進μ-鈣蛋白酶自溶。PKA處理組中孵育10 min時條帶2光密度值低于對照組及AP處理組，同樣也證明PKA抑制μ-鈣蛋白酶自溶，但可以延長μ-鈣蛋白酶發(fā)揮活性的時間。

圖7 不同處理組μ-鈣蛋白酶自溶分析Fig. 7 Analysis ofμ-autolyse with different treatments

3 討 論

磷酸化是一種常見的蛋白質(zhì)修飾方式，在活體細胞中對蛋白質(zhì)功能有重要作用。近些年研究表明，在宰后肌肉中，磷酸化對肌肉品質(zhì)形成也有重要作用，特別是宰后肌肉嫩化過程，肌原纖維蛋白降解是肌肉嫩化的關(guān)鍵步驟。前人研究結(jié)果表明，肌原纖維蛋白磷酸化與宰后肌肉嫩度負相關(guān)，磷酸化可能通過影響肌原纖維蛋白降解進而影響嫩度[8-9]。在本研究中，經(jīng)過AP及PKA處理，肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化及磷酸化反應(yīng)，磷酸化水平降低或升高，在與μ-鈣蛋白酶孵育后，3 個處理組中肌原纖維蛋白降解程度不同。采用免疫印跡方法分析肌原纖維蛋白的降解程度，以肌原纖維蛋白中含量最高的肌球蛋白及肌動蛋白、以及宰后降解程度高的肌間線蛋白及肌鈣蛋白T為研究目標(biāo)。前人的研究已經(jīng)采用磷酸化蛋白質(zhì)組的方法鑒定了人肌肉中這些蛋白的磷酸化位點，證明了這些蛋白存在磷酸化修飾現(xiàn)象[20]。

由于肌球蛋白重鏈及肌動蛋白含量高，在圖1中不易觀察到這兩種蛋白發(fā)生降解，但在免疫印跡圖中，可以檢測到這兩種蛋白的降解條帶。研究表明，宰后肌肉中肌球蛋白重鏈及肌動蛋白不易發(fā)生降解，但Lametsch等[6]采用蛋白質(zhì)組方法，檢測到這兩種蛋白的降解條帶。宰后肌間線蛋白發(fā)生降解，前人研究發(fā)現(xiàn)了50、47及39 kD的肌間線蛋白降解產(chǎn)物[19]，且Baron等[21]研究表明，肌間線蛋白易被μ-鈣蛋白酶降解，在離體孵育過程中（25 ℃）肌間線蛋白在1 h內(nèi)被完全降解。肌鈣蛋白T是μ-鈣蛋白酶的降解底物，且其在宰后易發(fā)生降解，前人研究表明，肌鈣蛋白T主要降解為一個30 kD的蛋白片段[22]，另外，Anderson等[23]研究發(fā)現(xiàn)了另一個分子質(zhì)量低于30 kD的肌鈣蛋白T降解片段，這和本研究結(jié)果一致。

與μ-鈣蛋白酶孵育后，肌球蛋白重鏈及肌動蛋白發(fā)生輕微降解，肌鈣蛋白T及肌間線蛋白大部分被降解。其中，磷酸化抑制肌動蛋白及肌間線蛋白的降解，去磷酸化促進肌動蛋白及肌間線蛋白的降解；與之相反，磷酸化促進肌球蛋白重鏈及肌鈣蛋白T的降解，去磷酸化抑制肌球蛋白重鏈及肌間線蛋白的降解。并且，磷酸化抑制μ-鈣蛋白酶自溶，抑制其活性，但延長其發(fā)揮活性的時間。前人研究表明，磷酸化對蛋白降解的影響有兩個方面。第一，鈣蛋白酶降解底物含有PEST區(qū)域，該區(qū)域中絲氨酸和蘇氨酸易發(fā)生磷酸化修飾，磷酸化修飾可能會通過對PEST區(qū)域的掩蔽作用影響鈣蛋白酶對底物的識別能力。Wang Hongmei等[24]研究證明了ezrin蛋白的PEST區(qū)域發(fā)生磷酸化抑制了μ-鈣蛋白酶對其的降解，Gomes等[25]研究表明，低磷酸化水平的肌鈣蛋白I更易被鈣蛋白酶降解。第二，磷酸化修飾改變蛋白結(jié)構(gòu)，進而改變蛋白穩(wěn)定性[26-28]，Kim等[29]研究表明，C/EBPβ蛋白磷酸化后，促進其二聚體的形成，進而降低其被降解程度。Vizel等[30]研究表明，AKAP3降解受磷酸化修飾調(diào)節(jié)。在本研究中，磷酸化通過作用于μ-鈣蛋白酶活性及肌原纖維蛋白進而影響μ-鈣蛋白酶降解肌原纖維蛋白的過程。AP處理組中，μ-鈣蛋白酶發(fā)揮活性快，其活性高，同時失活快，PKA處理組中，μ-鈣蛋白酶發(fā)揮活性慢，其活性低，但維持活性時間長。因此，AP處理和PKA處理對于不同的肌原纖維蛋白影響不同，對于肌動蛋白和肌間線蛋白，磷酸化對底物的影響在酶降解底物的過程中占主要作用，因此，低磷酸化水平的肌動蛋白和肌間線蛋白更易被μ-鈣蛋白酶降解；對于肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白T，磷酸化對酶的影響在酶降解底物的過程中占主要作用，因此，PKA處理組μ-鈣蛋白酶維持活性時間長，其對肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白T的降解作用時間長，進而這兩種蛋白降解程度高。

4 結(jié) 論

AP和PKA可以有效地催化肌原纖維蛋白發(fā)生去磷酸化或磷酸化反應(yīng)，進而降低或提高肌原纖維蛋白磷酸化水平。AP處理組肌原纖維蛋白磷酸化水平顯著低于對照組（P＜0.05），PKA處理組肌原纖維蛋白磷酸化水平顯著高于對照組（P＜0.05）。磷酸化抑制μ-鈣蛋白酶自溶，降低其活性，提高其發(fā)揮活性時間。磷酸化促進肌球蛋白重鏈及肌鈣蛋白T被μ-鈣蛋白酶降解，去磷酸化促進肌動蛋白和肌間線蛋白被μ-鈣蛋白酶降解。磷酸化修飾通過作用于μ-鈣蛋白酶活性及肌原纖維蛋白進而影響μ-鈣蛋白酶降解肌原纖維蛋白的過程。

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Effect of Phosphorylation on the Degradation of Myof i brillar Proteins by μ-Calpain

LI Zheng, LI Xin, DU Manting, LI Meng, ZHANG Dequan*
(Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Objective: The objective of this study was to investigate the effect of phosphorylation on the degradation of myof i brillar proteins by μ-calpain. Methods: Protein kinase A (PKA) and alkaline phosphatase (AP) were used to catalyze the phosphorylation and dephosphorylation of myof i brillar proteins of mutton longissimus dorsi muscle, followed by hydrolysis by μ-calpain. The levels of protein phosphorylation and degradation were measured by SDS-PAGE, Pro-Q Diamond fl uorescent staining, and Western blotting, respectively. Results: The phosphorylation level of myof i brillar proteins in the PKA group was signif i cantly higher than that of the control group (P ＜ 0.05), while the phosphorylation level of myof i brillar proteins in the AP group was signif i cantly lower than that of the control group (P ＜ 0.05). The autolysis and activity of μ-calpain were suppressed by PKA treatment, thereby leading to prolonged hydrolysis of myof i brillar proteins by μ-calpain. Phosphorylation enhanced the degradation of myosin heavy chain and troponin T, while dephosphorylation enhanced the degradation of actin and desmin. Conclusion: Phosphorylation affected both myof i brillar proteins and μ-calpain activity and therefore the degradation of myof i brillar proteins by μ-calpain.

phosphorylation; myof i brillar proteins; μ-calpain; degradation; protein kinase A; alkaline phosphatase

10.7506/spkx1002-6630-201715001

TS251.1

A

1002-6630（2017）15-0001-06

李錚, 李欣, 杜曼婷, 等. 肌原纖維蛋白磷酸化對其被μ-鈣蛋白酶降解的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(15): 1-6.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715001. http://www.spkx.net.cn

LI Zheng, LI Xin, DU Manting, et al. Effect of phosphorylation on the degradation of myo fi brillar proteins by μ-calpain[J]. Food Science, 2017, 38(15): 1-6. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715001. http://www.spkx.net.cn

2016-07-25

國家自然科學(xué)基金面上項目（31471604）；中國博士后科學(xué)基金面上項目（2015M571176）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉羊）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-39）

李錚（1986—），女，博士，研究方向為肉品科學(xué)與技術(shù)。E-mail：lizheng2014w@163.com

*通信作者：張德權(quán)（1972—），男，研究員，博士，研究方向為肉品科學(xué)與技術(shù)。E-mail：dequan_zhang0118@126.com