張磊，馬海春，蘇酩，劉善新，王杰，靳光乾*

(1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014；3.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000；4.山東大學附屬省立醫(yī)院，山東 濟南 250021)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

參貝消癭顆粒的HPLC特征圖譜

張磊1,2，馬海春3，蘇酩2，劉善新2，王杰4，靳光乾2*

(1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014；3.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000；4.山東大學附屬省立醫(yī)院，山東 濟南 250021)

建立了參貝消癭顆粒的HPLC特征圖譜。采用ODS-2 Hypersil C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，以乙腈為流動相A，以0.1% 磷酸水溶液為流動相B，梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長225 nm，進樣量5 μL。建立的特征圖譜具有良好的精密度、重復性和穩(wěn)定性，9批樣品特征圖譜的相似度均大于0.95，確定了5個共有特征峰，并指認出其中2個為芍藥苷、迷迭香酸，同時通過對單味藥材的特征圖譜的對比分析確定各特征峰的來源。該方法準確可靠，專屬性強，可用于參貝消癭顆粒的質(zhì)量控制。

參貝消癭顆粒；HPLC；特征圖譜

橋本甲狀腺炎(HT)是典型的器官特異性自身免疫性疾病[1]，屬于中醫(yī)的“癭病”范疇[2-3]。其發(fā)病年齡主要集中在40～60歲，女性發(fā)病率高且近年來有明顯上升趨勢[4-5]。近年來中醫(yī)藥在本病的治療和研究領域均取得了較好的成果[6]，但臨床使用的中成藥較少見。參貝消癭顆粒的組方是山東大學附屬省立醫(yī)院長期臨床經(jīng)驗總結(jié)而成，由白芍、夏枯草、烏藥、黃芪等15味中藥組成，具有理氣舒郁、化痰清熱、散結(jié)消癭的功能，用于治療橋本甲狀腺炎氣郁痰阻、壅結(jié)化熱證，在臨床中取得了較好的療效。中藥復方是依靠其所含的多種化學成分發(fā)揮綜合的醫(yī)療作用，而中藥特征圖譜具有信息量大、特征性強、整體性和模糊性等特點，能較全面地反映中藥復雜的化學成分及其相對比例，更加全面地展示中成藥質(zhì)量[7-8]。為制訂參貝消癭顆粒的質(zhì)量標準，本文對參貝消癭顆粒進行了HPLC特征圖譜研究。

1 材料與試劑

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀，Ultimate 3000紫外檢測器，Chromeleon7工作站(美國Thermo)；BP211D 電子天平(德國Sartorius)； LC-350A超聲波中藥處理器(濟寧市中區(qū)魯超儀器廠，功率250 W，頻率40 kHz)。

1.2 藥品和試劑

芍藥苷(批號110736-201438，純度：96.4%)、迷迭香酸(批號111871-201404，純度：98.6%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；參貝消癭顆粒由本課題組提供；藥材購自山東百味堂中藥飲片有限公司、山東上藥集團有限公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院靳光乾主任藥師鑒定，均為《中國藥典》2015版一部[9]各藥材項下收載的正品；乙腈為色譜純(美國Fisher Scientific)；超純水(美國MiLLipore)；其余試劑均為分析純。

2 特征圖譜的測定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ODS-2 Hypersil C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm，美國Thermo)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～60 min，2% ～ 30% A)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長225 nm；進樣量5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取參貝消癭顆粒研細，取3 g，精密稱定，加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，放冷后稱重，用甲醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷、迷迭香酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含芍藥苷120 μg、迷迭香酸10.4 μg的混合溶液，即得。

2.2.3 各藥材溶液的制備

取處方中藥材各10 g，參照參貝消癭顆粒樣品的制備工藝及2.2.1項下方法分別制成藥材溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗

精密吸取同一供試品(批號20151204)溶液5 μL，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣5次，以芍藥苷為參照物，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰的相對保留時間相對標準偏差均小于0.2%(n=5)，相對峰面積相對標準偏差均小于3%(n=5)。

2.3.2 重復性實驗

取同一批供試品(批號20151204)5份，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定5次，以芍藥苷為參照物，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰的相對保留時間相對標準偏差均小于0.1%(n=5)，相對峰面積相對標準偏差均小于3%(n=5)。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗

精密吸取同一供試品(批號20151204)溶液5 μL，分別在0、4、8、12、24 h進樣測定，以芍藥苷為參照物，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰的相對保留時間相對標準偏差均小于1%(n=5)，相對峰面積相對標準偏差均小于3%(n=5)。

2.4 特征圖譜的建立

取9批參貝消癭顆粒研細，各取3 g，精密稱定，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。將混合對照品溶液進樣，確定對照品的位置。采用中國藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)應用中位數(shù)法，對9批樣品進行多點校正，時間窗為0.10，自動匹配，即得參貝消癭顆粒HPLC特征圖譜共有模式，見圖1～3，以芍藥苷為參照計算9批樣品圖譜的相似度，結(jié)果均大于0.95，見表1。經(jīng)分析對比，確定5個共有峰作為其特征峰，以1號峰(芍藥苷對照品相應的峰)為S峰，計算其余特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果見表2～3。

圖1 9批樣品特征圖譜Fig.1 Specific chromatograms of 9 batches of samples

1芍藥苷；2迷迭香酸。圖2 對照品HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances

1芍藥苷；4迷迭香酸。圖3 特征圖譜共有模式Fig.3 Common mode of specific chromatograms

表1 9批樣品相似度結(jié)果(n=9)

表2 9批樣品相對保留時間(n=9)

表3 9批樣品相對峰面積(n=9)

2.5 特征峰歸屬

通過與圖2對照，確定圖3中的1號峰為芍藥苷，4號峰為迷迭香酸。通過與單味藥材特征圖譜比較，發(fā)現(xiàn)1、2號峰來源于白芍，3號峰來源于烏藥，4號峰來源于夏枯草，5號峰來源于黃芪，見圖4。

S1白芍；S2黃芪；S3烏藥；S4夏枯草；S5對照圖譜。圖4 參貝消癭顆粒與單味藥材特征圖譜比較Fig.4 Comparison of specific chromatograms between Shenbei Xiaoying granules and single medicinal herb

3 討論

實驗中首先對提取溶劑進行選擇，分別用90%甲醇、95%甲醇、甲醇、無水乙醇作為提取溶劑，結(jié)果檢測發(fā)現(xiàn)無水乙醇提取液峰較少，90%甲醇、95%甲醇提取液和甲醇提取液無明顯差別，因此選擇甲醇作為提取溶劑。對提取方法進行比較，分別用超聲和加熱回流方法進行提取，結(jié)果兩種提取方法所測結(jié)果基本一致，因此選擇超聲作為提取方法。對檢測波長進行了考察，分別選取210、220、225、230、240、260、280、330 nm波長進行檢測，結(jié)果在225 nm波長下基線平穩(wěn)且各色譜峰響應適中，故選擇225 nm作為檢測波長。對流動相進行考察，水相分別用純水、0.1%冰乙酸溶液和0.1%磷酸溶液進行檢測，結(jié)果在0.1%磷酸溶液作為流動相時，基線平穩(wěn)且峰形較好，因此選擇0.1%磷酸溶液作為水相流動相。

本研究建立了參貝消癭顆粒的特征圖譜，9批樣品的相似度大于0.95，確定了5個共有特征峰，其相對保留時間相對標準偏差小于0.8%(n=9)，說明特征圖譜的色譜行為基本相同，而相對峰面積相對標準偏差較大，是由于生產(chǎn)制劑使用的藥材有差異所致。同一種藥材，產(chǎn)地、批次、采收期、儲存時間不同均可導致藥材成分含量的差異。通過與對照品比較，指認出1號峰為芍藥苷，4號峰為迷迭香酸，并通過與處方中藥材的特征圖譜單獨比較，指認出5個共有峰中1、2號峰來源于白芍，3號峰來源于烏藥，4號峰來源于夏枯草，5號峰來源于黃芪。本研究所建立的特征圖譜靈敏度高、專屬性強，結(jié)果準確，能夠較為全面地反映參貝消癭顆粒的內(nèi)在質(zhì)量并為其質(zhì)量標準的建立提供參考。

[1]張明霞，李效忠，杲海霞，等.甲寧治療橋本甲狀腺炎機制的實驗研究[J].中成藥，2009，31(2)：290-292.

[2] 沈斐婕，龔凡，羅潔，等.中藥對氣陰兩虛型橋本甲狀腺炎患者甲狀腺自身抗體水平影響的回顧性分析[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30(4)：1212-1215.

[3] 范堯夫，劉克冕，張會峰，等.中西醫(yī)結(jié)合治療橋本甲狀腺炎甲狀腺功能減退的Meta分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2016，22(3)：221-224.

[4] 高青，簡立信，許金國.橋本甲狀腺炎病因病機與臨床治療研究進展[J].中國中藥雜志，2012，37(20)：3003-3006.

[5] 馬躍，周仁義，韓萍. 橋本甲狀腺炎治療進展[J].中國實用內(nèi)科雜志，2010，30(5)：459-461.

[6]石曉靜，殷佩浩. 橋本甲狀腺炎的治療研究進展[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，9(10)：1142-1144.

[7]謝培山. 中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術與應用[J].中國中藥雜志，2001，26(10)：5-7.

[8]李強，杜思邈，張忠亮，等.中藥指紋圖譜技術進展及未來發(fā)展方向展望[J].中草藥，2013，44(22)：3095-3104.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

HPLC specific chromatogram of Shenbei Xiaoying Granules

ZHANG Lei1,2，MA Hai-chun3，SU Ming2， LIU Shan-xin2，WANG Jie4, JIN Guang-qian2*

(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China； 2.Shandong Academy of Chinese Medicine，Jinan 250014，China；3. Heze Food and Drug Inspection and Resarch Institute, Heze 274000，China；4. Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021，China)

∶The HPLC specific chromatogram of Shenbei Xiaoying Granules was established. Specific chromatogram was carried out on a ODS-2 Hypersil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), with gradient elution consisting of acetonitrile as mobile phase A and 0.1% phosphoric acid solution as mobile phase B. Column temperature was 30 ℃, flow rate was 1.0 mL·min-1，detection wavelength was 225 nm, and sample volume was 5 μL. The established HPLC specific chromatogram of Shenbei Xiaoying granules has good precision, repeatability and stability. The similarity of characteristic maps of 9 batches of Shenbei Xiaoying Granules was all greater than 0.95. Five common specific chromatogram peaks were determined, and two peaks were identified as paeoniflorin and rosemary acid．At the same time, the source of each characteristic peak in HPLC specific chromatogram was determined by comparing and analyzing the HPLC specific chromatogram of single medicinal herb. This method is accurate, reliable and specific, which can be used for the quality control of Shenbei Xiaoying Granules.

∶Shenbei Xiaoying Granules；HPLC；specific chromatograms

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.001

2016-11-10

山東省科技發(fā)展計劃(2014GGH218026)；濟南市科技計劃(201219008)；濟南市高校院所計劃(201401255)

張磊(1992—)，男，碩士研究生，研究方向為中藥新劑型及新技術。

*通信作者，靳光乾(1962—)，主任藥師。Tel：0531-82949812,E-mail：jgqjn1962@sina.com

R284.1

A

1002-4026(2017)04-0001-05