朱碧紅+張慧芳+林鐲+張磊+董培紅+潘珍珍+陳永平

[摘要] 目的 探討大鼠肝纖維化組織中骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）的表達(dá)趨勢(shì)及意義。 方法 用皮下注射四氯化碳構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，造模后4周、8周、12周分別檢測(cè)血清層粘蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）的變化，采用HE及Masson染色光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織損傷情況，采用Real-Time PCR、免疫組織化學(xué)和Western印跡檢測(cè)各組大鼠肝組織中BMP-2的表達(dá)。采用單因素方差分析進(jìn)行多組均數(shù)間的比較。 結(jié)果 肝纖維化模型組血清LN、HA明顯升高。在對(duì)照組和肝纖維化模型組中BMP-2 mRNA均有表達(dá)。模型組4周時(shí)BMP-2 mRNA表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05），模型組8周、12周較對(duì)照組顯著下降（P均<0.05）。與模型組4周相比，模型組BMP-2 mRNA的表達(dá)在8周、12周顯著下降（P均<0.05），12周達(dá)最低。免疫組織化學(xué)證實(shí)，BMP-2在肝纖維化模型組較對(duì)照組大鼠肝組織中表達(dá)減少。在對(duì)照組和肝纖維化模型組中BMP-2蛋白均有表達(dá)。模型組4周時(shí)BMP-2蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05），模型組8周、12周較對(duì)照組顯著下降（P均<0.05）。與模型組4周相比，模型組BMP-2蛋白的表達(dá)在8周、12周顯著下降（P均<0.05），12周達(dá)最低。 結(jié)論 BMP-2在正常SD大鼠肝臟有表達(dá)，隨著肝纖維化進(jìn)展，表達(dá)減少，提示BMP-2參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

[關(guān)鍵詞] 骨形成蛋白2；肝纖維化；四氯化碳；大鼠

[中圖分類(lèi)號(hào)] R575.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）20-0032-04

[Abstract] Objective To explore the expression and significance of bone morphogenetic protein-2（BMP-2） in rats models of hepatic fibrosis. Methods SD rat models with hepatic fibrosis were established by injecting carbon tetrachloride（CCl4）. Serum laminin（LN） and hyaluronic acid（HA） levels were tested from hepatic fibrosis group at the time of 4 week， 8 week， 12 week. Pathological characters of liver tissue were observed under optical microscope after hematoxylin-eosin and Masson staining. And the expressions of BMP-2 were detected by the methods of Real-Time polymerase chain reaction（Real-Time PCR）， immunohistochemistry and Western blot in rat fibrosis tissues. Comparisons between groups were analyzed by one-way ANOVA. Results LN and HA in model group were significantly higher than those in control group. All of normal control group and hepatic fibrosis groups expressed BMP-2 mRNA. Compared with control group， the expression of BMP-2 mRNA of the model group at week 4 had no significant difference， but were significantly lower at week 8 to 12. Compared with model group at week 4， the expression of BMP-2 mRNA of the model group at week 8 to 12 decreased significantly， and reached the nadir at week 12. Immunohistochemistry proved that the expressions of BMP-2 in hepatic fibrosis groups were all significantly lower than control group. All of normal control group and hepatic fibrosis groups expressed BMP-2 protein. Compared with control group， the expression of BMP-2 protein of the model group at week 4 had no significant difference， but were significantly lower at week 8 to 12. Compared with model group at week 4， the expression of BMP-2 protein of the model group at week 8 to 12 decreased significantly， and reached the nadir at week 12. Conclusion BMP-2 expressed in the liver of normal SD rats， and decreased along with the progress of hepatic fibrosis. These indicated that BMP-2 might be involed in the pathogenesis and development of hepatic fibrosis.

[Key words] Bone morphogenetic protein-2； Hepatic fibrosis； Carbon tetrachloride； Rats

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是由各種致病因子（如肝炎病毒、乙醇、自身免疫、化學(xué)毒物或藥物等）引起的肝臟損傷和炎癥，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)量沉積，是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)之階段。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）可影響多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，參與組織的再生和修復(fù)，屬于TGF-β超家族成員[1]。骨形成蛋白2（BMP-2）是其中研究最活躍的成員之一[2]，已知具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及骨質(zhì)生成等功能，與肝纖維化的關(guān)系研究甚少。本研究通過(guò)觀察BMP-2在大鼠肝纖維化模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，初步探討B(tài)MP-2在肝纖維化進(jìn)程中的可能作用，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)24只健康雄性SD大鼠，體重（200±10）g，由上海劍鈍生物科技有限公司提供。HE染色和Masson染色試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；放射免疫沉淀法（RIPA）組織細(xì)胞快速裂解液購(gòu)自基爾頓生物科技（上海）有限公司；SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Thermo公司；BMP-2免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自Abcam公司；GAPDH購(gòu)自CST公司；HRP標(biāo)記的抗兔（鼠）IgG購(gòu)自上海碧云天公司；DAB濃縮型試劑盒購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化模型的制備和取材 清潔級(jí)喂養(yǎng)SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組6只，肝纖維化模型組18只。肝纖維化模型組給予皮下注射40%的四氯化碳溶液0.3 mL/100 g，每周3次，持續(xù)注射12周。正常對(duì)照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，每周3次，持續(xù)注射12周。肝纖維化模型組大鼠分別于4、8、12周處死，正常對(duì)照組于12周處死，留取血清和肝臟組織-80℃保存；部分肝組織以10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制備組織切片。

1.2.2 肝臟組織病理學(xué)檢查 HE染色和Masson染色肝組織石蠟切片后，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變情況。按2000年《病毒性肝炎防治方案》中慢性肝炎的分期標(biāo)準(zhǔn)，判定肝纖維化程度，若出現(xiàn)正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞或消失，增生的纖維組織分隔、包繞肝細(xì)胞，纖維間隔見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等浸潤(rùn)，表明肝纖維化模型成功建立。

1.2.3 肝纖維化指標(biāo)檢測(cè) 放射免疫法測(cè)定大鼠血清LN和HA的變化。

1.2.4 Real-Time PCR檢測(cè)大鼠肝組織BMP-2 mRNA的表達(dá) 取適量-80℃冷凍肝組織標(biāo)本，按試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real-Time PCR擴(kuò)增BMP-2 mRNA。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照基因。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。BMP-2上游引物：5'-CTGTCCCTACTGATGAGTTTC-3'，下游引物：5'-CTAACCTGGTGTCCAATAGTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度174 bp。GAPDH上游引物：5'-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物：5'-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度181 bp。用2 -△△CT值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織BMP-2的表達(dá) 將經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋標(biāo)本制成5 μm厚的切片。采用過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素（SP）法。60℃烤片，脫蠟水化，3%過(guò)氧化氫溶液溫育阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高壓修復(fù)，冷卻后滴加BMP-2一抗，4℃溫育過(guò)夜。滴加二抗及SP試劑，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用IMS圖像分析系統(tǒng)測(cè)量肝組織平均吸光度值（積分吸光度/組織面積）代表蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)肝組織BMP-2的表達(dá) 采用RIPA快速裂解液抽提各組大鼠肝組織總蛋白，于-80℃保存。BMP-2一抗?jié)舛劝?：1000稀釋?zhuān)珿APDH一抗?jié)舛劝?：1500稀釋。二抗均為1：1000稀釋?zhuān)珽CL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶，顯影、定影后保存圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用（x±s）表示。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布者多組間比較采用單因素方差分析，樣本方差齊性用Levene法檢驗(yàn)，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者用Dunnett T3檢驗(yàn)。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟病理組織學(xué)變化

大鼠肝組織經(jīng)HE及Masson染色后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察：正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞形態(tài)正常，以小葉中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝小葉內(nèi)未見(jiàn)纖維組織形成，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。肝纖維化模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞或消失，增生的纖維組織分隔、包繞肝細(xì)胞，部分肝細(xì)胞核大或雙核，有壞死出血，纖維間隔見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)封三圖1、圖2。

2.2各組大鼠血清LN、HA檢測(cè)結(jié)果

肝纖維化模型組血清LN、HA逐漸升高，于12周時(shí)達(dá)高峰，與正常對(duì)照組比較，肝纖維化模型組各時(shí)間點(diǎn)LN、HA的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LN的t值分別為-9.387，-12.310，-22.710；HA的t值分別為-104.110，-177.660，-284.110，P均<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠肝組織中BMP-2 mRNA的表達(dá)

對(duì)照組和肝纖維化模型組中BMP-2 mRNA均有表達(dá)。模型組4周時(shí)BMP-2 mRNA表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（t=0.004，P>0.05），模型組8周、12周較對(duì)照組顯著下降（P均<0.05）。與模型組4周相比，模型組BMP-2 mRNA的表達(dá)在8周、12周顯著下降（P均<0.05），12周達(dá)最低。見(jiàn)表2。

2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

BMP-2在各組大鼠肝組織中均有陽(yáng)性表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黑色或棕黃色顆粒沉積。與對(duì)照組相比，BMP-2在肝纖維化模型組12周時(shí)表達(dá)細(xì)胞數(shù)最少且著色最淡。見(jiàn)封三圖3。

2.5各組大鼠肝組織BMP-2蛋白的表達(dá)

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)照組和肝纖維化模型組中BMP-2蛋白均有表達(dá)。模型組4周時(shí)BMP-2蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（t=-0.068，P>0.05），模型組8周、12周較對(duì)照組顯著下降（P均<0.05）。與模型組4周相比，模型組8周、12周顯著下降（P均<0.05），12周達(dá)最低。這與Real-Time PCR檢測(cè)BMP-2 mRNA表達(dá)結(jié)果一致。見(jiàn)表3，圖1。

3討論

肝纖維化是肝臟對(duì)慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)。任何破壞肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程如炎癥、化學(xué)毒物和毒性藥物、先天性代謝障礙、先天性異常等均可導(dǎo)致肝纖維化，引起細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、細(xì)胞群和細(xì)胞因子的復(fù)雜改變[3]，出現(xiàn)肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積[4，5]，過(guò)度的纖維化最終導(dǎo)致肝硬化、門(mén)靜脈高壓和肝衰竭[6]。CCl4是氯化烷烴類(lèi)化合物，可選擇性損害肝、腎功能，誘導(dǎo)形成的化學(xué)性肝纖維化動(dòng)物模型與人類(lèi)肝纖維化病程相似。

骨形成蛋白2（BMP-2）是天然骨形成蛋白提取物中最主要的形式，位于第20號(hào)染色體p12區(qū)，是影響免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要因子[7]。目前對(duì)BMP-2的研究大多集中在骨骼系統(tǒng)、肺、腎、眼、惡性腫瘤等方面[8，9]。體外實(shí)驗(yàn)表明，BMP-2可影響成骨細(xì)胞的增殖和分化[10-12]。Shlyonsky V等[13]報(bào)道BMP-2參與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。在人動(dòng)脈粥樣硬化的鈣化斑中已經(jīng)檢測(cè)到了BMP-2 mRNA，推測(cè)BMP-2與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[14]。Yang YL等[15]認(rèn)為BMP-2通過(guò)延緩間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）抑制腎間質(zhì)纖維化。姚海佩等[16]認(rèn)為在眼科諸多纖維化疾病如角膜潰瘍、青光眼等中，BMP-2參與了不同的功能性細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為成纖維細(xì)胞的過(guò)程，并抑制纖維化進(jìn)程。有研究報(bào)道，BMP-2參與胰腺炎的炎癥、纖維化反應(yīng)[17]，通過(guò)Smad1信號(hào)通路拮抗TGF-β的作用抑制胰腺纖維化[18]。BMP-2通過(guò)AKT和ERK信號(hào)通路在胃癌中進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)BMP-2 在正常對(duì)照組大鼠肝組織中有表達(dá)，在CCl4誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型的初期，即模型組4周時(shí)，大鼠肝組織中BMP-2 表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，隨著大鼠肝纖維化的加重，模型組8周、12周BMP-2表達(dá)逐漸減少，12周達(dá)最低。免疫組織化學(xué)證實(shí)，BMP-2在肝纖維化模型組較對(duì)照組大鼠肝組織中表達(dá)減少。綜上所述，考慮BMP-2可能參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并與肝纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。這與姚頤等[20]研究發(fā)現(xiàn)的隨著腎纖維化的進(jìn)展，BMP-2表達(dá)顯著下調(diào)的結(jié)果相似。

肝纖維化是諸多慢性肝病共同的病理過(guò)程，存在復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)路調(diào)控。肝纖維化機(jī)制的研究是為肝纖維化治療提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BMP-2在正常SD大鼠肝臟有表達(dá)，隨著肝纖維化進(jìn)展，表達(dá)減少，提示BMP-2參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，在肝纖維化中可能扮演抑制的角色。但BMP-2如何影響纖維化基因表達(dá)與組織纖維化的分子機(jī)制，尚有待進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2017-05-20）