米永華 何苗 劉北忠

微小RNA（microRNA, miRNA）是一類內(nèi)源性、長度大約為18個-25個堿基的高度保守的非編碼小分子RNA。可與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達[1]，導(dǎo)致目標(biāo)mRNA的降解或者基因沉默從而調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、調(diào)亡、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程。已有的研究[2,3]表明miRNA能行使癌基因或抑癌基因的功能，miRNA參與和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的許多重要生物學(xué)過程，包括腫瘤的凋亡、增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫反應(yīng)等。研究表明，miR-133b編碼基因位于染色體臂6p[4]，在肺癌組織及患者血清中miR-133b呈低表達，通過刺激下游信號通路（Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK、PI3K / AKT、STAT3、FAK等），促進了腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及細胞凋亡的抑制[5]。劉等[6]研究表明，miR-133b與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）輻射敏感度之間有一定的聯(lián)系，miR-133b可通過靶向PKM2基因治療抗放射性的肺癌。另有研究[7]報道m(xù)iR-133a和miR-133b可以下調(diào)PKM2表達從而抑制舌鱗狀細胞癌的增殖。本實驗通過研究miR-133b與PKM2基因的關(guān)系及其對肺癌干細胞的作用，闡明miR-133b抗癌作用的部分機制，進一步證明miR-133b可作為一個潛在的抗癌新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細胞株購自ATCC，DMEM購置于Invitrogen，miR-133b模擬物miR-133b mimics、阻遏物miR-133b inhibitor、miR-133b control購置于中國上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，CD133 MicroBead Kit（human）和CD34 MicroBead Kit（human）和購置于美國Miltenyi Biotec公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購置于Invitrogen公司，miRNA提取試劑盒mirVana RNA Isolation Kit，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Taqman miRNA Reverse Transcripation Kit購置于美國ABI公司，熒光實時定量PCR試劑盒、Annexin V、FITC凋亡檢測試劑盒購置于BD公司，SYBR Green Master購置于瑞士羅氏公司，U6內(nèi)參引物于上海生工公司設(shè)計，GAPDH一抗購置于Abcam公司，CCK-8試劑盒購置于南京凱基生物有限公司，流式細胞儀購置于BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 細胞于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中同時添加10%的胎牛血清，100 U/mL的青霉素、100 mg/mL的鏈霉素，置于37oC、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁增殖至80%-90%融合時，用胰蛋白酶進行消化、傳代。

1.3 基因結(jié)合位點報告 miR-133b與PKM2使用miRBase和miRNAMap數(shù)據(jù)庫進行序列對比（網(wǎng)站：http://microrna.sanger.ac.uk，http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw）。

1.4 CD133+/CD34+肺癌干細胞的分選 收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的A549細胞，離心后加入Buffer重懸，加入磁珠標(biāo)記的抗體（CD133和CD34），混勻后室溫反應(yīng)30 min，通過 Auto MACS儀器，分選獲得CD133+/CD34+細胞。采用流式細胞儀檢測CD133+/ CD34+細胞的純度。

1.5 轉(zhuǎn)染及驗證

1.5.1 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 miR-133b取對數(shù)生長期的A549干細胞，5×105個/孔細胞接種于6孔板中，加入2 mL完全培養(yǎng)基，待細胞結(jié)合度約70%時進行轉(zhuǎn)染。按照試劑盒說明書的操作方法，分別加入終濃度為100 nmol/L的miR 133b mimics、miR 133b inhibitor以及對照質(zhì)粒miRNA con，每組設(shè)3個復(fù)孔進行轉(zhuǎn)染，37oC放置48 h，更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，進行下一步實驗。

1.5.2 qRT-PCR檢測miR-133b的表達 按照TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miRNA cDNA采用miRNA 3'末端加Poly(A)法逆轉(zhuǎn)錄合成，具體步驟參照Taqman miRNA Reverse Transcripation Kit說明書。采用SYBR Green qPCR檢測miR-133b（U6 snRNA為內(nèi)參）的表達，利用2-△△Ct方法計算miR-133b的相對表達水平。PCR引物序列如下，U6 snRNA上游序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-133b上游序列：5'-AAACCTGGCGGCCACGCTAC-3'，下游序列：5'-GACCGTGGTCCACTGCAGGC-3'。反應(yīng)條件：95oC預(yù)變性2 s，95oC變性10 s，60oC退火20 s，70oC延伸1 s-10 s，擴增40個循環(huán)。

1.6 CCK8法檢測細胞的增殖

1.6.1 細胞增殖實驗 分別檢測轉(zhuǎn)染6 d內(nèi)A549干細胞的增殖情況。細胞以5×103個/孔的密度接種在96孔板內(nèi)，培養(yǎng)4 h后加入10 μL CCK-8，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)放置2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處檢測各孔OD值，每組重復(fù)4次。相對增殖活力=實驗組OD值/空白對照組OD值。

1.6.2 細胞耐藥性實驗 轉(zhuǎn)染48 h后，用15 μg/mL化療藥物DDP處理各組轉(zhuǎn)染的CD133+/CD34+細胞0 h、24 h、48 h、72 h，收集各組各個時間點的細胞，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

1.7 Western blot檢測蛋白表達

1.7.1 轉(zhuǎn)染對PKM2蛋白表達的影響 檢測過表達及抑制miR-133b對A549干細胞蛋白水平的影響。取轉(zhuǎn)染后的A549干細胞，裂解提取總蛋白。BCA法測定細胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)以12%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，單克隆抗體4oC孵育過夜。PBST洗去一抗，HRP連接的二抗室溫孵育2 h。洗滌，ECL試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集成像。GAPDH作為內(nèi)參。成像結(jié)果結(jié)合Image J灰度分析軟件對PKM2蛋白水平進行分析對比。

1.7.2 DDP處理對細胞PKM2蛋白表達的影響 檢測過表達及抑制miR-133b的A549干細胞對在DDP藥物處理后，PKM2蛋白水平的變化，取經(jīng)15 μg/mL化療藥物DDP處理24 h的CD133+/CD34+細胞，提取總蛋白，Western blot結(jié)合Image J灰度分析軟件分析其中PKM2蛋白水平，方法同上。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的方式表示，雙向t檢驗來確定差異的顯著性。P＞0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；P＜0.01表示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因結(jié)合位點報告以及流式結(jié)果 miRBase結(jié)果表明miR-133b有1,038個靶基因結(jié)合位點，其中包括PKM2（數(shù)據(jù)庫基因ID:ENST00000389093）。miR-133b和PKM2的基因結(jié)合位點1119-1136如圖1所示。流式結(jié)果如圖2所示，免疫磁珠分離純化后CD133+/CD34+細胞純度為（92.15+4.27）%。

2.2 qRT-PCR結(jié)果 qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-133b mimics后，細胞內(nèi)miR-133b表達明顯上調(diào)（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染miR-133b inhibtor，細胞內(nèi)miR-133b表達明顯下調(diào)（P＜0.01），見圖3。結(jié)果提示轉(zhuǎn)染成功，可有效干預(yù)miR-133b的表達。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-133b對細胞增殖及PKM2蛋白表達的影響CCK8增殖實驗結(jié)果如圖4示，與對照組相比，過表達miR-133b后，CD133+肺癌干細胞的增殖能力顯著降低（P＜0.05），在第4-6天下降最為顯著；而抑制miR-133b表達細胞增殖能力明顯增強（P＜0.05），在第3-4天增殖最為明顯。Western blot結(jié)果如圖5所示，過表達miR-133b后CD133+肺癌干細胞PKM2蛋白的表達水平明顯降低（P＜0.01）；而抑制miR-133b表達則明顯增加CD133+肺癌干細胞PKM2蛋白水平（P＜0.01）。

2.4 轉(zhuǎn)染miR-133b對細胞凋亡的影響 細胞凋亡結(jié)果如圖6示，miR-133b mimics組細胞在DDP處理12 h后，細胞凋亡率明顯高于對照組和miR-133b inhibitor組（P＜0.05），且miR-133b inhibitor組細胞凋亡率明顯低于對照組，在DDP處理72 h差異更明顯。

2.5 轉(zhuǎn)染miR-133b與藥物處理對PKM2蛋白表達的影響Western blot結(jié)果如圖7所示，miR-133b mimics+DDP組PKM2蛋白的表達明顯低于對照組及抑制miR-133b組（P＜0.05）。

3 討論

肺癌的發(fā)病率與死亡率不斷升高，已成為近年來的惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命[8]。盡管我們關(guān)于癌癥的知識越來越多，但針對肺癌的有效治療手段仍很有限。很多學(xué)者[9,10]致力于鑒定肺癌中差異表達的miRNA并尋找其靶基因，以期為尋找新的治療靶點提供重要的線索。

圖 1 PKM2基因與miR133b基因結(jié)合位點報告Fig 1 Binding sites of mature miR-133b on PKM2 transcript

圖 2 CD133+/CD34+細胞純度檢測Fig 2 The purity of CD133+ /CD34+stem cells

圖 3 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染組miR-133b mRNA表達情況。**P＜0.001 vs對照組。Fig 3 The expression of miR-133b in each group determined b real-time PCR. **P＜0.001 vs control group.

圖 4 細胞增殖曲線Fig 4 The curve of cell proliferation

圖 5 PKM2蛋白表達水平。**P＜0.001 vs 對照組。Fig 5 The expression levels of PKM2. **P＜0.001 vs control group.

圖 6 細胞凋亡率Fig 6 Cell apoptosis rate

圖 7 PKM2蛋白表達水平。**P＜0.001 vs 對照組，*P＜0.05 vs 對照組。Fig 7 The expression levels of PKM2. **P＜0.001 vs control,*P＜0.05 vs control.

腫瘤干細胞是實體腫瘤中的一小部分，有增殖、自我更新、分化為腫瘤塊的能力[11]。已有實驗報道CD133為腫瘤干細胞特異標(biāo)志分子，CD133+腫瘤干細胞由于具有干細胞的特性，其對化療或放療都具有不敏感性[12]。有研究[13]表明CD133、CD34和CD44可以作為分離人肺腺癌腫瘤干細胞的表面蛋白表標(biāo)記組合。本研究利用CD133、CD34作為A549干細胞的特異性分子標(biāo)記物，采用免疫磁珠分離出高純度CD133+/CD34+肺癌干細胞。

研究[14]發(fā)現(xiàn)PKM2在多種惡性腫瘤中表達升高，且與腫瘤耐藥性及預(yù)后相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。PKM2以高活性四聚體和低活性的二聚體兩種形式充當(dāng)糖酵解雙功能作用的傳感器和調(diào)控器，確定其是代謝成乳酸還是合成大分子。PKM2四聚體形式具有丙酮酸激酶活性，能催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，與底物PEP有高親和力，酶催化能力很強，為腫瘤細胞分化、增殖提供所需的能量。二聚體形式，則能催化合成細胞構(gòu)建模塊如核算、氨基酸、磷脂等[15]。PKM2是癌癥治療的一個重要的靶基因，PKM2在肝癌中高表達與患者的不良預(yù)后相關(guān)[16]。使PKM2高表達會促進癌細胞中間代謝產(chǎn)物的積累，對腫瘤治療有益。有研究[6]表明，miR-133b通過靶向PKM2改善肺癌細胞的放療敏感性。而本研究通過實驗闡明miR-133b作為靶向PKM2的miRNA，兩者之間的關(guān)系，及其抑癌作用。

我們使用miRBase和miRNAMap數(shù)據(jù)庫進行分析，預(yù)測miR-133b與PKM2基因有靶向關(guān)系。有研究[17,18]表明，CD133陽性細胞具有高度增殖分化潛能和體內(nèi)成瘤能力及干細胞樣特性。在肺癌組織及患者血清中miR-133b呈低表達，通過刺激下游信號通路（Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK、PI3K/AKT、STAT3、FAK等），促進了腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及細胞凋亡的抑制[5]。我們應(yīng)用免疫磁珠分選法從A549細胞株中分選出CD133+/CD34+細胞，即A549干細胞，并應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測其純度。在CD133+/CD34+細胞的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-133b模擬物和阻遏物，運用qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染結(jié)果。之后利用CCK8法及Western blot檢測miR-133b對CD133+/CD34+細胞增殖的影響，證明miR-133b可以靶向調(diào)節(jié)PKM2基因，影響肺癌干細胞增殖。為了闡明miR-133b對肺癌干細胞藥物敏感性的影響，我們檢測不同時間點的DDP對過表達及抑制miR-133b的CD133+/CD34+細胞的增殖情況的影響，發(fā)現(xiàn)miR-133b mimics+DDP組的細胞抵抗DDP的能力降低，細胞凋亡率明顯升高。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)過表達miR-133b可以有效降低CD133+/CD34+細胞的增殖能力，同時可以增強細胞對DDP的敏感性，并且這些作用均可能是通過靶向PKM2基因，影響PKM2的表達而體現(xiàn)的。為探索miR-113b對肺癌干細胞的作用機制以及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，同時為肺癌的生物學(xué)防治提供了一個新的潛在靶標(biāo)。