趙明 陳錦銣 韓秀敏 武瓊 孫英慧

姜黃素激活自噬對(duì)抗ANGⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化發(fā)生

趙明 陳錦銣 韓秀敏 武瓊 孫英慧

目的 探討姜黃素（CMN）在病理性心肌纖維化炎癥中的作用及機(jī)制。方法 以血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為刺激因子制備小鼠心肌纖維化疾病模型，以不同濃度的CMN（50、100 ng/ml）作為干預(yù)濃度進(jìn)行治療研究。應(yīng)用小動(dòng)物超聲檢測(cè)干預(yù)28 d后各組小鼠心功能指標(biāo)。應(yīng)用HE和Masson染色方法觀察干預(yù)28 d后小鼠心肌病理?yè)p傷及纖維化情況。應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)Ⅲ型膠原和自噬相關(guān)蛋白（LC3和P62）表達(dá)。結(jié)果 心功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CMN治療后，可呈劑量依賴(lài)性對(duì)抗ANGⅡ誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷。HE和Masson染色進(jìn)一步證實(shí)，CMN高濃度治療組小鼠心肌損傷受到抑制，心肌纖維化程度顯著減輕，心肌組織Ⅲ型膠原表達(dá)顯著減少。應(yīng)用Western blotting證實(shí)，CMN干預(yù)后，可明顯激活小鼠心肌的自噬水平，促進(jìn)自噬發(fā)生。進(jìn)一步應(yīng)用自噬抑制劑氯喹干預(yù)治療后，Masson染色提示，CMN對(duì)抗ANGⅡ誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化作用受到明顯抑制，同時(shí)，小鼠心肌自噬激活也明顯受到抑制。結(jié)論 CMN通過(guò)激活心肌組織自噬活化對(duì)抗ANGⅡ誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化發(fā)生。

姜黃素； 心肌纖維化； 自噬

充血性心力衰竭是各種心臟疾病發(fā)生發(fā)展的終末階段，發(fā)病率高，死亡率高，是目前威脅人類(lèi)生命健康的重要疾病之一，其主要病因包括冠心病、高血壓和結(jié)構(gòu)性心臟病。心力衰竭的發(fā)病機(jī)制除了神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過(guò)度激活以外，還涉及到心肌組織的重塑，其中腎素-血管緊張素系統(tǒng)的過(guò)度激活和心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要階段。MF是心肌間質(zhì)重構(gòu)的結(jié)果，與成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)平衡紊亂密切相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌纖維排列紊亂，是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理表現(xiàn)，最終使患者心肌順應(yīng)性下降，導(dǎo)致心力衰竭及惡性心律失常的發(fā)生，是心血管疾病患者的主要死亡原因。目前，MF的防治研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[1]。近年來(lái)大量研究顯示，神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制中的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在MF發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，其中心肌纖維化發(fā)生的主要原因可能在于血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）升高引起心肌細(xì)胞死亡和心肌成纖維細(xì)胞過(guò)度增生。姜黃素（curcumin，CMN）是一種天然的多酚類(lèi)化合物，從姜黃屬植物根莖中提取得來(lái)，是姜黃屬中藥最重要的活性成分，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)以達(dá)到防止心肌損傷的作用。近年來(lái)，大量的研究均證實(shí)，CMN可顯著誘導(dǎo)心、肝、腎和肺等器官的微粒體內(nèi)血紅素加氧酶-1的表達(dá)，從而降低相應(yīng)組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，增強(qiáng)上述器官的抗氧化損傷能力。氧化應(yīng)激損傷是心肌炎癥及纖維化發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，因此，本研究嘗試闡明CMN治療對(duì)小鼠心肌纖維化是否具有拮抗作用，并初步闡明其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 建立小鼠心肌纖維化模型 20只C57BL野生型雄性小鼠，體重15～22 g（沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供），隨機(jī)分為CMN不同濃度組、模型組和生理鹽水對(duì)照組，各5只小鼠。CMN組小鼠采用直接灌胃法給藥，分別給予CMN 50 mg·kg-1·d-1和100 mg·kg-1·d-1兩種劑量，每日1次，其余各組小鼠給予生理鹽水灌胃，喂養(yǎng)1周。除空白對(duì)照組外，其余組小鼠均經(jīng)腹腔注射濃度為3.5%的水合氯醛（10 ml/kg）麻醉，然后皮下埋入置入式膠囊滲透壓泵（USA/Alzet生產(chǎn)），內(nèi)容藥物為AngⅡ1.3 mg/kg，泵持續(xù)時(shí)間為28 d。

1.2 小鼠體重、血壓監(jiān)測(cè)，小鼠心臟超聲測(cè)定及標(biāo)本采集 給藥期間，每周定期監(jiān)測(cè)各組小鼠的血壓及體重。血壓測(cè)試采用小動(dòng)物血壓計(jì)，數(shù)據(jù)收集完畢后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。給藥期滿后，采用vivo小動(dòng)物超聲觀察小鼠的心臟情況，記錄其各心腔大小及左心室射血分?jǐn)?shù)，衡量小鼠的心臟功能情況，然后開(kāi)胸經(jīng)小鼠左心室采血2 ml，離心取血清用于血脂等相關(guān)檢測(cè)。取用4%多聚甲醛固定的小鼠心臟組織，進(jìn)行相關(guān)HE、Masson、免疫組化等病理組織學(xué)檢測(cè)。

1.3 HE和Masson染色分析心肌纖維化情況 第一步HE染色：Leica石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為5 μm。將石蠟切片烘烤2 h（防止脫片）后，常規(guī)脫蠟至水，然后應(yīng)用蒸餾水洗滌 2次，每次洗滌5 min，至無(wú)酒精味道。蘇木素染色5 min PBS返藍(lán)。顯微鏡下觀察核染效果，可用1%鹽酸酒精分色。伊紅染色2 min。常規(guī)應(yīng)用梯度酒精脫水二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察。

第二步Masson染色：Leica石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚5 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，應(yīng)用蒸餾水清洗2次，每次5 min。然后先用蘇木素染色5 min，再用麗春紅品紅液染5 min。染色完畢后先用0.5%冰醋酸水溶液快速?zèng)_洗，再用1%磷鉬酸水溶液快速處理，其切片由深紅色至鮮紅色至粉紅色，再用苯胺藍(lán)染色，0.5%冰醋酸水溶液快速?zèng)_洗，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察。Masson染色下心肌細(xì)胞呈紅色，膠原呈藍(lán)色。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在10×20倍顯微鏡下測(cè)定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volumefraction，CVF）。CVF=心肌膠原面積/所測(cè)視野面積。每只大鼠選取6張切片，每張切片均隨機(jī)選取3個(gè)視野測(cè)量，取平均值。

1.4 免疫組化染色檢測(cè)心肌膠原蛋白的表達(dá) 將心肌組織用4%多聚甲醛室溫固定過(guò)夜，石蠟包埋后進(jìn)行切片，切片烘烤過(guò)夜。切片脫蠟后，用pH 6.0檸檬酸緩沖液在高壓鍋內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS洗滌3次，5%山羊血清封閉20 min，棄掉血清加入小鼠Ⅲ型膠原（CollagenⅢ，ColⅢ）單克隆抗體（1∶100），4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，加入山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗（1∶100），室溫避光孵育2 h PBS增加洗滌時(shí)間洗滌3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，30%中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察、照像。

1.5 Western blot檢測(cè)心肌相關(guān)自噬蛋白的表達(dá)取1.2項(xiàng)中心臟組織，每組隨機(jī)取1例，分別置于玻璃研磨器中，加入RAPI組織細(xì)胞裂解液1 ml研磨使組織均勻地分散在裂解液中，4℃溫度下放置30 min，每過(guò)10 min振搖1次。4℃溫度下用12 000 r/min的速度離心20 min，棄除脂層，上清液即組織蛋白提取液。隨后用BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整樣本濃度一致，各樣本上樣量25μg/泳道，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜、封閉，分別與第一抗體（1∶300）雜交，4℃下孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體（1∶5000），37℃孵育50～70 min，化學(xué)發(fā)光、顯影、壓片，采用Gel pro Analyzer軟件計(jì)算目的蛋白表達(dá)的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，采用ANOVA行單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)鼠心功能指標(biāo) 小鼠皮下埋泵AngⅡ處理28 d后行vivo超聲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水對(duì)照組比較，AngⅡ埋泵組小鼠心功能明顯減弱，射血分?jǐn)?shù)較低，而CMN組小鼠心功能較AngⅡ心臟射血情況的差異與其心肌狀態(tài)相關(guān)，心肌纖維化會(huì)影響小鼠左室射血，故檢測(cè)其左室收縮期和舒張期容量，并測(cè)定左室射血分?jǐn)?shù)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 不同治療組小鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

表1 不同治療組小鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

注：LV Vol-d：左室舒張期容量；LV Vol-s：左室收縮期容量；EF：左室射血分?jǐn)?shù)

組別 例數(shù) LV Vol-d LV Vol-s EF（%）sham組 5 7.58±1.06 2.24±0.52 88.65±7.29 AngⅡ組 5 40.58±9.06 16.24±6.52 48.65±10.29 CMN-1組 5 27.52±4.81 10.28±4.27 60.44±7.71 CMN-2組 5 16.39±3.26 4.46±7.40 75.13±13.00

2.2 CMN呈劑量依賴(lài)性對(duì)抗AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化 HE染色提示：假手術(shù)組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊、連接緊密；AngⅡ泵入28 d后，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松且有斷裂，排列紊亂，炎細(xì)胞增多，有明顯出血壞死。而CMN處理組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)清楚，排列稍齊，無(wú)炎細(xì)胞增多及出血壞死，以CMN-2組改變最為顯著，見(jiàn)圖1A。Masson染色提示：Masson染色下心肌細(xì)胞呈紅色，膠原呈藍(lán)色。AngⅡ泵入28 d后，心肌纖維化明顯增加，可見(jiàn)大片藍(lán)色的心肌膠原沉積于心肌細(xì)胞及血管周?chē)?；假手術(shù)組無(wú)明顯膠原沉積；CMN組均見(jiàn)少量膠原沉積，以CMN-2組最少。見(jiàn)圖1B。

2.3 CMN呈劑量依賴(lài)性對(duì)抗AngⅡ誘導(dǎo)的Ⅲ型膠原（ColⅢ）表達(dá) 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ColⅢ是間質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，正常心肌間質(zhì)中僅見(jiàn)微量陽(yáng)性表達(dá)；AngⅡ泵入28 d后，ColⅢ陽(yáng)性表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加，而CMN組較AngⅡ模型組ColⅢ表達(dá)顯著減少。見(jiàn)圖2。

2.4 CMN呈劑量依賴(lài)性激活心肌自噬蛋白LC3和p62活化 通過(guò) Western-blot免疫印跡法檢測(cè)皮下埋泵小鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白的活化情況發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激3 d，CMN-2實(shí)驗(yàn)組較AngⅡ模型組心肌中LC3表達(dá)顯著活化，同時(shí)P62底物蛋白表達(dá)下降，提示心肌細(xì)胞出現(xiàn)自噬活化。見(jiàn)圖3。

2.5 氯喹干預(yù)對(duì)抗CMN對(duì)心肌纖維化的治療作用 進(jìn)一步應(yīng)用氯喹泵入給藥進(jìn)行自噬干預(yù)后，MASSON染色檢測(cè)CMN-2組小鼠心肌損傷情況發(fā)現(xiàn)，氯喹給藥后，CMN對(duì)小鼠心肌纖維化的治療作用被抑制（圖4A）。同時(shí)，應(yīng)用免疫組化染色檢測(cè)ColⅢ表達(dá)發(fā)現(xiàn)，氯喹干預(yù)后，CMN小鼠心肌纖維化顯著增加。提示氯喹可能具有對(duì)抗CMN的治療作用。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，提取氯喹干預(yù)3 d的心肌組織進(jìn)行Western-blot免疫印跡法檢測(cè)證實(shí)，CMN對(duì)心肌細(xì)胞LC3的表達(dá)仍呈明顯活化，但P62蛋白表達(dá)也呈顯著增加，提示氯喹干預(yù)組心肌細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的自噬抑制狀態(tài)（圖4B、C）。

3 討論

隨著患者心臟疾病的進(jìn)展、RAAS系統(tǒng)的激活，釋放的神經(jīng)激素因子通過(guò)它們?cè)谛募〖?xì)胞外的受體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入心肌細(xì)胞內(nèi)，最終進(jìn)入細(xì)胞核激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如GATA4、MEF2、SRF、TGF-β1等，引起心肌細(xì)胞肥大、凋亡，心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化等一系列病理改變，從而導(dǎo)致心室重塑，影響心臟的收縮和舒張功能，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。目前大量的研究表明，心室重塑在心力衰竭中發(fā)揮著決定性作用，其中變化最為顯著的是：①一系列復(fù)雜的分子機(jī)制和細(xì)胞機(jī)制調(diào)節(jié)異常，最終導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)、功能和表形的變化；②以心肌細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積和降解減少而導(dǎo)致的心肌纖維化[2,3]。心肌纖維化是以心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和膠原纖維過(guò)度沉積為特征的心臟間質(zhì)重構(gòu)[4,5]，其主要表現(xiàn)為膠原濃度明顯升高或膠原容積分?jǐn)?shù)顯著高于正常值，臨床上主要包括修復(fù)性心肌纖維化和反應(yīng)性心肌纖維化這兩種類(lèi)型。心肌纖維化導(dǎo)致心功能不全，是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的重要病理過(guò)程，而成纖維細(xì)胞增殖在心肌纖維化中起重要作用[6]。心肌纖維化過(guò)程不是一個(gè)簡(jiǎn)單的病理過(guò)程，其受到TGF-β1、SAM、MAPK通道等多種分子系列的調(diào)控，而且可能有TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎癥因子的參與。有研究表明，AngⅡ可以通過(guò)激活TGF-β1和MAPK通道等多種細(xì)胞信號(hào)通道誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖、膠原沉積及細(xì)胞外基質(zhì)的降解[7-9]。因此，探討心肌纖維化發(fā)生的病理機(jī)制，尋找延緩或逆轉(zhuǎn)心力衰竭心室重構(gòu)的重要調(diào)控因子，為尋找防治心臟疾病后心室重塑的新方法提供有益的思路，成為目前研究的熱點(diǎn)。

姜黃素是從姜黃屬植物根莖中提取出的一種多酚化合物，是姜黃發(fā)揮藥理作用最重要的活性成分[10]，是天然P300特異性組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑，已被證明具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗纖維化作用，從而具有治療心力衰竭的潛在功能。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）通過(guò)抑制血管緊張素Ⅱ的水平和活性在臨床上取得了良好療效。大量的證據(jù)提示姜黃素具有多個(gè)分子靶點(diǎn)，如轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子及其受體、細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)基因[11,12]。Sunagawa等[13]在心肌梗死后心衰的小鼠中進(jìn)行了不同劑量姜黃素對(duì)心臟功能影響的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中等和高劑量組小鼠的左室短軸縮短率下降，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)中等和高劑量姜黃素組的心肌細(xì)胞直徑、血管周?chē)w維化以及超聲心動(dòng)圖所測(cè)得的左室后壁厚度均下降，左室收縮功能得到改善。Wang等[14]在心肌梗死大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以降低丙二醛，抑制MMPs的活性，從而防止細(xì)胞外基質(zhì)的降解和減少膠原的沉積，通過(guò)TGF-β/Smad蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制膠原的合成。姜黃素除了減少在缺血/再灌注過(guò)程中的心肌膠原合成和纖維化，還顯著下調(diào)TGF-β1與磷酸化的Smad2/3的表達(dá)，以及上調(diào)Smad7，并且還能增加α平滑肌肌動(dòng)蛋白肌成纖維細(xì)胞在損傷心肌中的表達(dá)。超聲心動(dòng)圖顯示，姜黃素能顯著改善左室舒張末期容積、每搏輸出量和射血分?jǐn)?shù)，證明姜黃素可抑制不適應(yīng)的心臟修復(fù)和保護(hù)缺血再灌注后心功能。Kim等[15]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有預(yù)防和治療心肌梗死的作用。Sunagawa等[16]曾在研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素聯(lián)合依那普利可明顯改善心肌梗死后心衰小鼠的心功能，并明顯減少非梗死心肌細(xì)胞的肥大改變。

本次實(shí)驗(yàn)報(bào)道了姜黃素通過(guò)激活自噬抑制AngⅡ在抗心肌纖維化中發(fā)揮作用，發(fā)現(xiàn)CMN能夠呈劑量依賴(lài)性地抑制AngⅡ引起的心肌纖維化的發(fā)生，其對(duì)心肌的保護(hù)作用可能與其調(diào)控心肌細(xì)胞的自噬活化有關(guān)。同時(shí)應(yīng)用自噬的抑制劑氯喹進(jìn)行干預(yù)后，CMN對(duì)心肌纖維化的保護(hù)作用受到明顯拮抗，這一研究結(jié)果進(jìn)一步明確了CMN對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用；同時(shí)也提示其可能是通過(guò)激活心肌細(xì)胞的自噬功能對(duì)抗AngⅡ引起的心肌氧化應(yīng)激損傷，達(dá)到心肌保護(hù)作用。

綜上，我們通過(guò)對(duì)CMN心肌保護(hù)作用的研究提示自噬保護(hù)可能在心肌纖維化損傷調(diào)控中起重要作用，也可能成為心肌保護(hù)性藥物研究的重要方向。

（本文圖片見(jiàn)后插二

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Curcumin inhibits the myocardiac fibrosis via activation of autophagy

ZHAO Ming＊，CHEN Jin-ru，HAN Xiu-min，et al.＊Department of Congenital Heart Disease，General Hospital of Shenyang Military Area Command，Shenyang 110016，China

HAN Xiu-min，E-mail：xiuminhan@126.com

Objective To evaluate the effect of curcumin on myocardial fibrosis and aims to explore the protective mechanisms of curcumin on myocardium.Methods AngiotensionⅡ（ANGⅡ）treatment was used to induce the myocardial fibrosis in mice.Echo was used to observe the heart function.HE and Masson staining was used to evaluate the area of myocardiac infarction and histopathological changes.The expression of collagenⅢ was estimated by immunohistochemical study.The expression levels of LC3 and p62 were estimated by Western blotting. Results Echo analysis showed that CMN protects against reduction of ANGⅡ-induced heart function in a dosedependent manner.HE and Masson staining revealed that myocardial fibrosis was inhibited in CMN-treated mice compared with that untreated mice.Meanwhile，collagenⅢ expression also identified to decrease in CMN-treated mice heart compared with that in untreated heart.Western blotting implicated that autophagy associated genes LC3 and p62 activation in heart tissue with CMN treatment.Using chorolquine to antagonize the autophagy activation，the fibrosis exist in the heart and autophagy accumulation.Conclusion Curcumin inhibits myocardial fibrosis by activation of autophagy in mice heart.

Curcumin； Myocardial fibrosis； Autophagy

遼寧省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2011225021）

110016 遼寧省沈陽(yáng)市，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院先心病內(nèi)科（趙明、陳錦銣、韓秀敏、武瓊），醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科（孫英慧）；大連醫(yī)科大學(xué)碩士研究生（陳錦銣、武瓊）

韓秀敏，E-mail:xiuminhan@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．05．023

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）05-0470-05

2016-10-27）