神農(nóng)架四種特色藥用珍稀植物內(nèi)生真菌的多樣性研究

劉 喬 涂 璇,2 陳君芝 王洋洋 周金山 郭志勇,2 鄧張雙,2 包忻怡

(1. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院， 湖北 宜昌 443002； 2. 三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室， 湖北 宜昌 443002)

神農(nóng)架四種特色藥用珍稀植物內(nèi)生真菌的多樣性研究

劉 喬1涂 璇1,2陳君芝1王洋洋1周金山1郭志勇1,2鄧張雙1,2包忻怡1

(1. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院， 湖北 宜昌 443002； 2. 三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室， 湖北 宜昌 443002)

藥用植物內(nèi)生真菌是一類具有廣泛的應(yīng)用前景的微生物資源．本研究以神農(nóng)架的特色藥用植物紅豆杉(TaxusChinensis)、珙桐(DavidiainvolucrataBaill.)、白三七(Panaxnotoginseng)、七葉一枝花(Parispolyphylla.)為研究對象，利用rDNA-ITS序列對其健康組織的內(nèi)生真菌多樣性進行分析．結(jié)果表明，從這4種植物中共分離出97株歸屬于23個屬具有豐富的生物多樣性的內(nèi)生真菌．其中從紅豆杉中分離得到內(nèi)生真菌70株，分屬于21個屬優(yōu)勢種屬是鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)和擬莖點霉屬(Phomopsissp.)；從白三七中分離內(nèi)生真菌12株，歸屬于毛霉屬(Mucorsp.)和鐮刀菌屬(Fusariumsp.)，從七葉一枝花中分離內(nèi)生真菌6株，歸屬毛霉屬(Mucorsp.)、鐮刀菌屬(Mucorsp.)和青霉屬(Penicilliumsp.)，從珙桐中分離內(nèi)生真菌9株炭角菌屬(Xylariasp.)、炭團菌屬(Hypoxylonsp.)、擬莖點霉屬(Phomopsissp.)、鏈格孢屬(Alternariasp.)、柄孢殼屬(Podosporasp.)、間座殼屬(Diaporthesp.)．

植物內(nèi)生真菌； rDNA-ITS； 系統(tǒng)發(fā)育樹； 多樣性

植物內(nèi)生真菌是一個多樣性十分豐富的生物類群，普遍存在于各種陸生和水生植物中，其宿主涉及藻類、針葉樹、灌木、草本等多個植物類群，其多數(shù)屬于子囊菌亞門中的核菌綱(Pyrenomyetes)、盤菌綱(Discomycetes)和腔菌綱(Loculoascomycetes)及其無性態(tài)的多種真菌[1-2]．研究表明植物內(nèi)生菌與宿主植物有著密切的關(guān)系，內(nèi)生菌隨宿主植物協(xié)同進化，參與植物的代謝和免疫，往往還能產(chǎn)生與宿主植物相同或結(jié)構(gòu)類似的化合物，在天然藥物開發(fā)和生態(tài)學(xué)研究中有著極為重要的作用[3-6]．

三峽地區(qū)的神農(nóng)架原始森林擁有得天獨厚的生態(tài)環(huán)境,使南北植物薈萃于此，森林資源豐富，為藥用植物的孕育和繁衍提供了良好的生態(tài)條件．藥用植物品種眾多，門類齊全，蘊藏量極大，是舉世聞名的“天然大藥園”[7]．神農(nóng)架地區(qū)分布著許多珍貴或面臨瀕危的藥用植物，一方面人們希望開發(fā)利用藥用植物中的有效成分，另一方面這些天然的藥用珍惜瀕危植物面臨生存危機，解決這一矛盾的有效方式就是挖掘藥用植物內(nèi)生菌資源，尋找具有與宿主相同的活性化合物．紅豆杉、珙桐、白三七(又名竹節(jié)參)和七葉一枝花(又名重樓)是神農(nóng)架保護區(qū)非常有代表性的藥用和珍稀瀕危植物．由于過去長期不合理砍伐利用，野生資源日趨減少[8]，國內(nèi)外關(guān)于紅豆杉內(nèi)生菌產(chǎn)紫杉醇類物質(zhì)的研究十分火爆，但是關(guān)于珙桐、白三七和七葉一枝花內(nèi)生菌的研究相對較少．

本文從神農(nóng)架自然保護區(qū)采集這4種藥用和珍稀植物的樹皮、莖和葉，通過對其組織內(nèi)內(nèi)生真菌的多樣性進行分析，為尋找開發(fā)宿主活性化合物的結(jié)構(gòu)類似物提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 植物樣本的采集

實驗所用植物材料于2012年5～11月間采自湖北神農(nóng)架自然保護區(qū)．采集時一般選擇生長在比較陰濕的植物多樣性豐富的區(qū)域，且選擇生長性狀良好、無病蟲害癥狀的的健康植株．草本植物采集全株，木本植物采集其不同部位的枝條、葉、樹皮等．采集的樣品裝于密封塑料保鮮袋中做好標(biāo)記并放入冰盒中．回到實驗室后立即將植物樣品放入4℃冷藏箱中低溫保鮮，以確保樣品內(nèi)真菌的活性．采集回來的植物樣品立即時進行內(nèi)生真菌的分離．

1.2 內(nèi)生真菌的分離純化方法

剪取植物樣品的根、莖和葉用清水洗凈后，在75%乙醇中浸1 min，然后在3.25%的NaOCl中浸泡5 min，再次放入75%乙醇中浸30 s，最后用無菌水沖洗5次．樣品用無菌吸水紙吸干后備用．將最后一次洗滌水吸取50 μL分別涂布在PDA平板上，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察是否有菌落出現(xiàn)．將表面消毒后的樣本接種到PDA雙抗平板(滅菌的PDA倒平板前，加入青霉素鈉溶液和硫酸鏈霉素溶液，使其終濃度分別為20 μg/mL，50 μg/mL)上，倒置于24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，待各植物組織切面長出菌絲后挑取邊緣部分移至新鮮的PDA培養(yǎng)基上，純化后接種于PDA斜面培養(yǎng)好后置于4℃冰箱中保藏備用．

1.3 內(nèi)生真菌的ITS序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.3.1 內(nèi)生真菌的ITS序列測定

純化后的菌種經(jīng)馬鈴薯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24℃，150 r/min，7 d后過濾收集菌絲，取適量菌絲用液氮迅速研磨成粉末，然后采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒按操作說明進行提取，提取的DNA用滅菌的雙蒸水洗脫，用于PCR擴增．用于ITS rDNA擴增的引物為一對通用引物．正向引物ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′．反應(yīng)體系(50 μL)為：Sterilized H2O 22 μL，2×PCR Master 25 μL，DNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL；PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，然后94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)后72℃延伸10 min；采用DNA純化回收試劑盒回收．測序由上海生工完成．

1.3.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析

使用DNASTAR軟件包中的SeqMan程序?qū)y序得到的序列與相應(yīng)的測序峰圖進行人工校正，利用在線Blast工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)將測定的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，選擇同源性高的序列，對菌株進行初步的系統(tǒng)發(fā)育分析．利用 Mega5.0進行序列分析并且計算進化距離，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次Bootstrap．

2 結(jié)果分析

從三峽地區(qū)采集的紅豆杉、白三七、七葉一枝花、珙桐4種植物樣本，不同植物根據(jù)樣本情況的不同采用根、莖、葉、果分離植物內(nèi)生真菌，總共獲得97株內(nèi)生真菌．具體分別是分自紅豆杉70株菌，白三七12株菌，七葉一枝花6株菌，珙桐9株菌(見表1)．

表1 種植物內(nèi)生真菌的分離

2.1 內(nèi)生真菌多樣性分析

2.1.1 紅豆杉內(nèi)生真菌的多樣性分析

從紅豆杉的枝條中共分離出70株內(nèi)生真菌，通過紅豆杉內(nèi)生真菌與31株參考真菌的ITS序列構(gòu)建了NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示紅豆杉內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，從N-J樹上可以看出，這70株內(nèi)生菌處于5個大分支，歸入21個不同種屬，具體分類見表2．其中鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)和擬莖點霉屬(Phomopsissp.)是優(yōu)勢菌屬，占總分離株的15.7%、12.9%和10% ．此外還有木霉屬(Trichodermasp.)，肉座菌屬(Hypocreasp.)，間座殼屬，糞生糞殼菌(Sordariasp.)炭角菌Xylariasp.黑孢霉(Nigrosporasp.)耙齒菌(Irpexsp.)橘青霉(Penicilliumsp.)球毛殼菌(Chaetomiumsp.)多節(jié)孢屬(Nodulisporiumsp.)、葡萄座腔菌屬(Botryosphaeriasp.)光黑殼屬(Preussiasp.) 火絲菌屬(Pyronemasp.)深黃傘形霉(Umbelopsissp.)柄孢殼屬(Podosporasp.) ，具體菌株號與鑒定結(jié)果見表2．

表2 紅豆杉內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果

圖1 7紅豆杉內(nèi)生真菌基于ITS序列的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

2.1.2 白三七和七葉一枝花內(nèi)生真菌的多樣性分析

白三七和七葉一枝花都是草本藥用植物，由于野生的樣品量較少，兩個樣品采集地在一起，本文就歸在一起分析．從白三七的全草共分離到12株內(nèi)生真菌，七葉一枝花是珍稀保護植物，只采集了少量的枝和葉片進行分離，共得到6株內(nèi)生真菌．根據(jù)測定的rDNA-ITS序列與參比序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹來看，分離的菌株可能由于樣本量較少，多樣性并不豐富，具體結(jié)果如圖2所示．這18株菌主要集中在毛霉屬(Mucorsp.)，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)和青霉屬(Penicilliumsp.)，見表3．

圖2 白三七和七葉一枝花內(nèi)生真菌基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育

宿主種屬菌株數(shù)量所占比例/%菌株號白三七鐮刀菌屬Fusariumsp.650BS14、BS25、BS28、BS26、BS27、BS30毛霉屬Mucorsp.650BS13、BS15、BS16、BS18、BS19、BS29鐮刀菌屬Fusariumsp.233.3B22、B23七葉一枝花毛霉屬Mucorsp.233.3B11、B24青霉屬Penicilliumsp.233.3B8、B10

2.1.3 珙桐內(nèi)生真菌的多樣性分析

珙桐屬于國家一級保護珍稀瀕危植物，野外分布極為稀少，樣品獲得也十分不易．本實驗只采集了少量的珙桐枝條，共分離出9株內(nèi)生真菌．雖然數(shù)量不多，但是也歸屬在6個不同的種屬，優(yōu)勢菌屬不明顯，各菌屬分布較為均勻，具體歸屬情況見表4．從在線比對的結(jié)果和N-J樹上聚類的結(jié)果顯示，GT-1，GT-3，GT-5和GT-9聚在一個分支，親緣關(guān)系較近，但是在線比對后相近的菌屬卻不同．因此想要進一步確定其分類地位應(yīng)該還要從其他幾個看家基因的比對結(jié)果分析確定．

表4 珙桐內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果

圖3 珙桐內(nèi)生真菌基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 總結(jié)與討論

植物內(nèi)生菌作為重要的微生物資源，在藥物先導(dǎo)化合物的開發(fā)中占有重要的地位，從紅豆杉中分離的紫衫霉產(chǎn)生紫杉醇的結(jié)果后，大量的研究表明，在熱帶雨林植物和很多藥用植物中都能發(fā)現(xiàn)多種活性的藥物先導(dǎo)化合物[9-12]．此外在豐富微生物的生物多樣性方面也成績斐然，從內(nèi)生菌中也發(fā)現(xiàn)了許多新種屬的微生物[14-15]．在本研究中，分離獲得的 70株紅豆杉內(nèi)生真菌分布在21個菌屬，擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)和擬莖點霉屬(Phomopsissp.)是優(yōu)勢菌群，具有豐富的種類多樣性．從這些分離出的內(nèi)生真菌蘊藏著多種生物活性，分離來自七葉一枝花的內(nèi)生鐮刀菌Fusariumsp.B23具有非常好的降解偶氮類染料蘇丹紅的能力(文章待發(fā)表)，而其中分離的一株青霉屬的真菌能夠產(chǎn)生含雙環(huán)[4. 4. 1]環(huán)系甾體類結(jié)構(gòu)物質(zhì)，文獻中此類化合物大多來自海洋生物．

本文在植物材料的選擇上具有鮮明的地域特色，不僅有瀕危的珍稀植物紅豆杉和珙桐，也有珍貴的民間藥用材料白三七和七葉一枝花．神農(nóng)架原始森林的植物類群極為豐富，因而其蘊藏的內(nèi)生真菌資源是一個巨大的微生物寶庫，除了尋找藥物活性先導(dǎo)化合物，植物內(nèi)生真菌在生物降解和環(huán)境保護方面也值得大力開發(fā)．

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[責(zé)任編輯 周文凱]

Diversity of Endophytic Fungi in Four Endemic Medicinal Rare Plants of Shennongjia Nature Reserve

Liu Qiao1Tu Xuan1,2Chen Junzhi1Wang Yangyang1Zhou Jinshan1Guo Zhiyong1,2Deng Zhangshuang1,2Bao Xinyi1

(1. College of Biological & Pharmaceutical Science, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China； 2. Hubei Key Laboratory of Natural Product Research & Utilization, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

Endophytic fungi of medicinal plants are a kind of microbial resources with wide application prospect. In this study, four different special medicinal plantsTaxusChinensis,DavidiainvolucrataBaill.,Panaxnotoginseng, andParispolyphylla. of Shennongjia are discussed. The endophytic fungi diversity from healthy tissues are analyzed by rDNA-ITS sequences. The results show that a total of 97 endophytic fungi belonging to 23 genera were isolated from these four different plants. 70 strains of endophytic fungi belonging to 21 genera rich in biodiversity were isolated fromTaxusChinensis, and the dominant species wereFusariumsp.,Pestalotiopsissp., andPhomopsissp.. 12 strains of endophytic fungi belonging toMucorsp. andFusariumsp. were isolated fromPanaxnotoginseng. 6 strains of endophytic fungi were isolated fromParispolyphylla.., belonging toMucorsp.,Mucorsp., andPenicilliumsp.. 9 genera of endophytic fungi isolated fromDavidiainvolucrataBaill. wereXylariasp.,Hypoxylonsp., Phomopsis sp., Alternaria sp., Podospora sp., Diaporthe sp..

endophytic fungi in plants； rDNA-ITS； phylogenetic tree； diversity

2016-11-29

國家自然科學(xué)基金面上項目(31570543)；湖北省教育廳重點項目(D20141201)；三峽大學(xué)開放基金(2016KBC10)

涂 璇(1974-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生資源開發(fā)與利用研究．E-mail：tuxuan7@126.com

10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2017.04.021

Q949.32

A

1672-948X(2017)04-0101-05