董錦蕾，張閃閃，王曉琴，張波*

（石河子大學藥學院/省部共建新疆特種資源植物藥重點實驗室，新疆 石河子，832002）

霜霉菌誘導葡萄葉中白藜蘆醇積累的氧化還原調控規(guī)律研究

董錦蕾，張閃閃，王曉琴，張波*

（石河子大學藥學院/省部共建新疆特種資源植物藥重點實驗室，新疆 石河子，832002）

本文針對霜霉菌侵染葡萄葉過程中植保素積累與活性氧調控規(guī)律開展研究。選取7月齡的紅地球葡萄葉片，鑒定并分離霜霉病菌對離體的葡萄葉片在20℃黑暗條件下進行侵染處理。HPLC法分析侵染時間與白藜蘆醇的含量的時效關系，檢測侵染后細胞活性氧積累時效關系，分析茋類物質合成途徑限速酶基因的表達時效關系，最后通過助氧化劑及抗氧化劑的正反驗證來確定霜霉菌對葡萄白藜蘆醇的誘導規(guī)律。結果表明，霜霉菌侵染離體葡萄葉片活性氧與白藜蘆醇積累呈現(xiàn)時效關系的順序性，活性氧水平24 h時達到最高，白藜蘆醇葉鮮重含量72 h達到最高（59.46 μg/g）；侵染過程中白藜蘆醇合成途徑下相關酶STS基因表達明顯上調，而PAL、C4H和4CL的酶基因表達量在24 h或48 h最高；助氧化劑H2O2和FeCl3前處理組葉片白藜蘆醇含量增加，抗氧化劑NAC和GSH-EE前處理組白藜蘆醇含量減少，提示霜霉菌誘導白藜蘆醇積累與活性氧調控密切相關。

白藜蘆醇；霜霉菌；茋類合成途徑；ROS積累；美國紅地球葡萄

在植物與病原菌互作過程中，病原菌通過分泌酶或毒素類物質實現(xiàn)侵染，植物則通過表達抗病基因，進而產生抗菌物質，從而來抵抗病原菌的侵染。正常生理條件下，植物機體內ROS的產生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，其內環(huán)境氧化還原狀態(tài)是相對穩(wěn)定的，來維持機體的相對平衡。

但植物受外界刺激（如生物因素和非生物因素）時，這個平衡就會被打破，植物會應激產生大量的ROS從而導致ROS水平迅速上升，這種 ROS的大量增加稱為氧化爆發(fā)。氧爆發(fā)是植物防衛(wèi)系統(tǒng)開啟的標志之一，在逆境脅迫時其中以H2O2的含量為氧爆發(fā)最普遍特征[1]。如李欣龍等人[2]發(fā)現(xiàn)當用霜霉菌侵染葡萄葉片時，白藜蘆醇的含量明顯增加且內源性H2O2的含量也顯著升高。

白藜蘆醇（Resveratrol，簡稱 Res），主要存在于虎杖、花生、葡萄等植物中。白藜蘆醇與植物抗病性具有密切的關系，在動物體上又具有良好的抗炎、抗氧化等作用。

課題組前期研究白藜蘆醇運用的誘導因子有UV[3]、AlCl3[4]、H2O2[5]和 FeCl3[6]等，在葡萄葉片及其愈傷組織中誘導白藜蘆醇的積累具有顯著效果，但各自都具有一些局限性，不能很好的被廣泛應用。即使是作為植物中的基本元素且低毒所出現(xiàn)的FeCl3溶液，也不能夠將白藜蘆醇完全從提取液中分離出來，主要原因是由于植物體內本身含有大量的糖分。針對這一點，本文利用微生物發(fā)酵過程中需要大量的糖來維持發(fā)酵，從而誘導葡萄葉片中的茋類物質。

在植物的生長發(fā)育過程中，茋類物質不僅受到一些自然環(huán)境因素（氣候和環(huán)境）的影響，也會因為一些生物因子而受影響，如病原菌的侵染等。當植物受到病原菌侵染時，植物往往會表達其體內的抗病基因使抗菌物質積累從而抵御病原菌的侵染。

馬勉娣等[7]研究發(fā)現(xiàn)從不同品種不同地區(qū)分離大量的內生真菌，外施內生真菌也證明可以有效改變葡萄葉片的內生菌群結構和提高葡萄果實中一些次生代謝產物含量。Kretschmer等[8]通過研究葡萄果皮感染葡萄灰霉病后PAL和STS基因表達變化再次證實了葡萄果實Res合成能力與感染葡萄灰霉病的相關關系。Pezet R等[9]比較研究了不同葡萄品種對霜霉菌（Plasmopara viticola）的抗性，發(fā)現(xiàn)敏感品種感染病菌后產生的大量Res迅速糖基化為較小毒性的白藜蘆醇苷（piceid，PD），而抗性品種感染病菌后產生的大量Res則迅速氧化為更高毒性的白藜蘆醇聚合體（viniferins）。

作為葡萄的第一產區(qū)，找到一種合理有效的方法誘導葡萄中白藜蘆醇的積累，并提取出來在實際應用中具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 同齡孢子囊的獲取

實驗前1 d的20:00-21:00在石河子大學試驗站葡萄園感病品種紅地球葡萄（Vitis vinifera L.cv.Red Globe）上采集典型新鮮的霜霉病(Plasmopara viticola(Berk.et Curtis)Berl.et de Toni)葉片，用流水沖洗10 min，直至霉層完全沖凈，室溫下放置10 min，使葉片表面無明顯水分，然后在保濕缸中20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)12 h，待病部生長出新的孢子囊，即視為同齡孢子囊[10]。

1.1.2 供試品種

供試品種為感病品種紅地球葡萄。3年生紅地球葡萄苗（Vitis vinifera L.cv.Red Globe）購自新疆石河子葡萄研究所，于石河子大學北區(qū)農學實驗站培育（25℃）；實驗選取7月齡葡萄莖上距頂尖第4或第5葉（大小相近）摘取后（含葉柄）避光保存[11]。

1.2 試劑

白藜蘆醇標準品（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；甲醇（AR，天津市富宇精細化工有限公司）、乙腈（色譜純，美國 Fisher公司）；FeCl3（AR，天津盛奧化學試劑有限公司）；谷胱甘肽乙酯（GSH-EE，美國Sigma公司）、N-乙酰-L-半胱氨酸（美國Sigma公司）；其余試劑均為分析純，稀釋及空白處理中的水為實驗室制備雙蒸水。

1.3 方法

1.3.1 霜霉菌對葡萄葉片的侵染

將制備的新鮮同齡孢子囊用小排筆刷到滅菌的平皿中加無菌水混勻制成懸液，將懸液倒入噴壺中備用。將滅菌的培養(yǎng)皿底部放置同底大小濾紙，并用無菌水潤濕。將孢子囊懸液噴于葡萄葉片背面，置于培養(yǎng)皿中封口培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度20℃，濕度90%，于氣候箱中避光培養(yǎng)3～5 d，侵染過程如圖1所示。

圖1 感染霜霉菌的葉片（400×）Fig.1 Leaves infected with downy mildew（400×）

1.3.2 霜霉菌發(fā)酵液的制備

將培養(yǎng)好的新鮮同齡孢子囊用小排筆刷到滅菌的平皿中加無菌水混勻制成懸液，用血球計數(shù)的方法計算菌液中霜霉菌孢子數(shù)，調節(jié)菌液孢子數(shù)至107個/mL待用。

將孢子囊懸液噴灑于葡萄葉片背面，置于裝有50 mL滅菌水的三角錐形瓶中封口培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度20℃恒溫搖床中避光震蕩培養(yǎng)0、24、48和72 h的相同時間點進行取樣，液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。前處理實驗分組與流程參考表1，其中 NAC的濃度為 1 mmol/L[12]，GSH-EE的濃度為 2 mmol/L（表 1）。

表1 抗氧化劑和助氧化劑的處理方式Tab.1 Antioxidants and Auxiliary oxidant treatment

1.3.3 葉片組織中ROS積累測定

定量檢測葉片組織中H2O2：提取葉片細胞間隙液，提取方法參考 Sutherland等人[13]，測定 560 nm（或595 nm）處吸光度值。具體方法參照上海生工生物工程股份有限公司的過氧化氫定量分析試劑盒推薦方法。

1.3.4 白藜蘆醇的提取和檢測

分別于0、24、48、72和96 h采集發(fā)酵后的葡萄葉片，將稱重后的葡萄葉片加適量甲醇，研磨，超聲提取20 min，振蕩離心，提取3次，再將3次提取的上清液收集蒸干，干樣品用甲醇溶解，并用甲醇定容至10 mL容量瓶中。通過HPLC法對葡萄葉片發(fā)酵液中的白藜蘆醇進行定量分析，參照田春芳等[14]的方法。上述操作均在避光條件下進行。用HPLC檢測：將制備的樣品（10000×g）離心10 min，取上清液過有機膜 （0.45 μm），0.2%磷酸水過水膜（0.45 μm）。色譜條件：采用二元梯度洗脫，流動相B為雙蒸水（0.2%磷酸），A為乙腈，柱溫25℃，進樣量20 μL，流速 1 mL/min，檢測波長 306 nm。色譜柱Atlantis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司）。洗脫程序：0-4 min，80%～76%B；4-20 min，76%～69%B；20-25 min，69%～60%B。每個樣品重復3次。白藜蘆醇含量采用（μg/g鮮重）表示。

1.3.5 白藜蘆醇茋合酶基因的RT-PCR檢測

選取 0、24、48、72和 96 h發(fā)酵后的葡萄葉片，用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA（天根生化科技有限公司，北京），參考方法[15]；cDNA第一條鏈合成根據(jù)（PrimeScript R RT reagent Kit Perfect Real Time，TaKaRa）推薦方法進行；根據(jù)參考文獻設計葡萄白藜蘆醇合成途徑關鍵酶的引物：苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸 -4-羥化酶（C4H）和4-肉桂酸輔酶A連接酶（4CL）及白藜蘆醇合成酶 （STS）[16]；內參 18S rRNA[17]。RT-PCR反應及電泳相關步驟參考文獻[17]，引物序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences table

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗測定均重復3次。結果統(tǒng)計和方差分析采用SPSS軟件進行，結果以平均值±標準偏差（Mean values±S）表示。

實驗組之間統(tǒng)計學差異利用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01表示差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 霜霉菌處理時間與白藜蘆醇積累水平呈現(xiàn)正相關

結果表明，隨著處理時間的增加葡萄葉片中白藜蘆醇的含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢（圖3），并且在處理72 h時白藜蘆醇積累量最高，其含量達到59.46 μg/g，是空白組的2.12倍；并呈時效依賴關系。

圖2 霜霉菌處理葡萄葉片后HPLC分析Fig.2 The HPLC analysis of grape leaves treated with downy mildew

圖3 霜霉菌對葡萄葉片中白藜蘆醇誘導的時效關系Fig.3 The time-effect of resveratrol induced by downy mildew in grape leaves

2.2 霜霉菌上調了葡萄茋類物質合成途徑相關基因表達

圖4為茋類物質合成途徑RT-PCR凝膠電泳圖。由圖4可知RT-PCR凝膠電泳圖表明隨著處理時間的增加，苯丙氨酸代謝公共途徑相關分子表達有明顯的變化。公共途徑中茋合酶（STS）基因隨著處理時間的增加而增加，在72 h時表達量最高，這與白藜蘆醇的積累時間一致，具有明顯的時效關系；而苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸 -4-羥化酶（C4H）和 4-肉桂酸輔酶 A連接酶（4CL）基因表達則隨著處理的增加在24 h或48 h時表達量最高。

圖4 霜霉菌對紅地球葡萄葉片中茋類物質合成限速酶基因表達的影響Fig.4 The effect of downy mildew treatment on stilbene material synthesis rate-limiting enzymes gene expression in grape leaf

2.3 霜霉菌發(fā)酵后引起細胞ROS水平的升高

過氧化氫（最主要的ROS種類）被認為是生物和非生物脅迫的過程中重要的信號分子，它從協(xié)調生理過程到應激反應起著多方面的作用。細胞內源性H2O2在較低的濃度，它可以啟動細胞內信號傳導活動，而在較高的濃度可能導致植物細胞的代謝功能障礙，同時誘導核酸，蛋白質和脂質損傷[18]。檢測葉片中H2O2含量可以看出霜霉菌侵染葉片24 h時葡萄葉片產生的內源性的H2O2含量最高，達到2.77 μmol/g Fw，是空白處理組的2.7倍。隨著處理時間的增加，H2O2含量也逐漸減少，但整體水平高于空白處理組。

圖5 霜霉菌發(fā)酵葡萄葉片后細胞間隙液H2O2的含量Fig.5 Changes of H2O2contents in intercellular fluid of grape leaves after fermentation with downy mildew

2.4 氧化還原調控正反驗證

由圖我們可以看出在霜霉菌處理時間72 h時，加預處理助氧化劑H2O2和FeCl3處理組的白藜蘆醇含量有所增加，而加了預處理抗氧化劑NAC和GSH-EE的處理組白藜蘆醇的含量則有所減少（圖6）。

圖6 霜霉菌在不同前處理條件下對葡萄葉片白藜蘆醇誘導的量效關系（72 h）Fig.6 The dose-effect of downy mildew on resveratrol content in grape leaves under different pretreatment conditions for 72 hours treatment

3 討論

本文采用紅地球葡萄葉片為研究材料進行研究，通過定量霜霉菌檢測白藜蘆醇的含量來探究葡萄葉片中茋類物質的積累與霜霉菌之間的關系。

在植物與病原真菌互作中，無論是抗病反應還是感病反應，雙方都會發(fā)生一系列形態(tài)上的變化。植物與病原真菌的互作分為親和互作（特異性侵染）與非親和互作（非特異性侵染）。在親和互作中，一些真菌利用植物表面的氣孔或創(chuàng)傷入侵，許多毒性較強的真菌還具有主動入侵的機制，如以附著孢形式入侵植物，造成植物感染[19]。在非親和互作中，在侵染處形成與周圍健康組織差異明顯的局部細胞壞死－過敏反應（hypersensitive reaction，HR），并伴隨有高水平的H2O2[20]。在葡萄中，Liswidowati等人認為：在真菌誘導前，植物細胞內基本上沒有茋類化合物這種物質，就算有含量也很少。這一觀點與Pezet R等人[9]的研究結果類似，用Plasmopara viticola（霜霉?。┨幚砥咸讶~片后分離并檢測相關的芪類物質，結果發(fā)現(xiàn)經處理后的葡萄葉片可以產生更多的芪類物質，正常的對照組葡萄葉片檢測出的芪類物質相對較少。

實驗研究發(fā)現(xiàn)霜霉菌對葡萄葉片中的茋類物質具有顯著的誘導作用，且白藜蘆醇的積累呈現(xiàn)一定的時效依賴關系。在72 h時白藜蘆醇的積累量達到最高，鮮重為59.46 μg/g，是空白組的2.12倍。隨著時間的增加，ROS水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在24 h時達到最大值。檢測苯丙氨酸代謝途徑（白藜蘆醇合成途徑）相關酶基因[14]苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）和4-肉桂酸輔酶A連接酶（4CL）以及茋合酶（STS）的表達，發(fā)現(xiàn)STS基因隨著處理時間的增加而增加，在72 h時表達量最高，這與白藜蘆醇的積累時間一致，具有明顯的時效關系；而PAL、C4H和4CL基因表達量則隨著處理時間的增加在24 h或48 h時表達量最高，這與葉片內源性H2O2含量檢測結果一致。已有報道表明：茋類化合物通過合成植保素來參與植物的防御反應，而ROS在植物防御過程中可能起著信號傳遞作用和直接刺激植物體發(fā)揮植保素的功能[21]。在霜霉菌侵染葡萄葉片的前期ROS大量積累，當超過植物體內ROS動態(tài)平衡后，刺激機體開啟茋類物質合成途徑，并在72 h時達到最高。另一方面，造成白藜蘆醇積累的原因可能是由于霜霉菌侵染正常葡萄葉片時，在侵染處形成與周圍健康組織差異明顯的局部細胞壞死區(qū)域，它能阻斷病原菌的營養(yǎng)來源，限制其進一步擴散。然而，一些研究表明，細胞過敏性壞死并不足以阻止所有的病原真菌的擴散，某些植物的抗病反應過程也并不一定伴隨有HR產生[22]。Konate等在煙草花葉病毒感染的煙草葉片的緊鄰壞死斑周圍區(qū)域里發(fā)現(xiàn)一些病毒顆粒的存在[23]。因此，當病原真菌突破壞死斑的界限后，周圍細胞中被強烈誘導的防御反應就成為限制病原菌擴散的主要屏障。然而，這種具有防御作用的物質通常被稱之為植保素，白藜蘆醇是葡萄中最主要的植保素。

最后，根據(jù)課題組前期研究成果在實驗中加入了抗氧化劑NAC、GSH-EE和助氧化劑H2O2來驗證霜霉菌與白藜蘆醇的積累在氧化損傷角度的關系。結果表明，加了助氧化劑H2O2和FeCl3處理組的白藜蘆醇含量增加，而加了抗氧化劑NAC和GSH-EE的處理組白藜蘆醇的含量則減少。說明霜霉菌同樣能夠造成植物氧化損傷，進而刺激機體產生能夠保護機體的芪類物質。

4 結論

白藜蘆醇被認為是茋類物質單體中最重要的生物活性物質，對于植物抗病具有重要意義。霜霉菌處理葡萄葉片時會誘導白藜蘆醇的積累，在72 h時其含量達到59.46 μg/g，是空白組的2.12倍，且植物體內ROS水平在24 h達到最高；加助氧化劑H2O2和FeCl3共處理組的白藜蘆醇含量有所提高；而加了抗氧化劑NAC和GSH-EE的共處理組白藜蘆醇的含量則有所減少。霜霉菌誘導白藜蘆醇積累與植物氧化脅迫有密切關系。

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Accumulation of resveratrol and redox regulation in grape induced by downy mildew

Dong Jinlei,Zhang Shanshan,Wang Xiaoqin,Zhang Bo*
(School of Pharmacy,Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

Downy mildew is the most common grape disease.This study carried out a research on the patterns of phytoalexin accumulation and reactive oxygen regulation during the infection of downy mildew on grape leaves.7-month-old grapevine(Red globe)leaves and fresh downy mildew were selected for innoculation in 20℃under dark conditions.The time-effect relationships between infection and resveratrol content were analyzed by HPLC method.Similarly,the accumulation of reactive oxygen species(ROS)after infection was determined by spectrophotometric method.The gene-expression level of key enzymes in stilbene pathway was semi-quantified by RT-PCR assay.The relationship between the resveratrol-elicitied potency by downy mildew and ROS accumulation was identified by positive and negative validation via additional both pro-oxidative or anti-oxidative approaches.The results showed that downy mildew induced the accumulation of ROS in grape leaves which reached the highest level at 24 h.Resveratrol accumulated with time and at 72 h it reached 59.46 μg/g.The expression of STS gene was significantly up-regulated,while the expression of PAL,C4H and 4CL reached the highest at 24 h or 48 h in the resveratrol synthesis pathway.The content of resveratrol in grape leaves increased in H2O2and FeCl3treated groups,while the content of resveratrol decreased in the treatment group treated with antioxidant NAC and GSH-EE.It suggests that the accumulation of resveratrol induced by downy mildew is related to redox mechanism.

resveratrol;downy mildew;stilbene biosynthesis;ROS accumulation;Vitis viniferaL.cv.Red Globe

R363

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.04.016

1007-7383(2017)04-0486-07

2017-01-25

國家自然科學基金項目（31160058），新疆兵團重點領域科技攻關項目（2014BA029）

董錦蕾（1990-），女，碩士研究生，專業(yè)方向為生物技術制藥。

*通信作者：張波（1978-），男，教授，從事腫瘤藥理及生物技術制藥研究，e-mail:Bozhang_lzu@126.com。