殷玉敬 高輝 郭佳 高洋

環(huán)狀RNA（circular RNAs, circRNAs）廣泛地分布于人體各種組織，并在組織重塑、血管生成、胚胎形成以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，也是RNA領(lǐng)域最新的研究熱點(diǎn)[1]。與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，富含microRNA結(jié)合位點(diǎn)，可通過(guò)miRNA海綿的作用解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平，這一作用機(jī)制被稱為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA機(jī)制，在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[2,3]。

近年來(lái)，circRNAs在腫瘤的作用受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如circRNAs HIPK3可通過(guò)調(diào)控miR-379促進(jìn)NCI-H1299和NCI-H2170體外增殖，circRNAs ITCH可通過(guò)Wnt/β-Catenin調(diào)控肺癌細(xì)胞體外增殖[4,5]。

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康，肺腺癌具有侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差、多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。我國(guó)是肺癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家之一，為了進(jìn)一步闡明circUBAP2在肺腺癌發(fā)生發(fā)展的作用，本文研究circUBAP2在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)差異，通過(guò)siRNA干擾circUBAP2表達(dá)研究其對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和侵襲的影響，并初步分析其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌和相對(duì)應(yīng)的30例正常肺組織均通過(guò)病理學(xué)證實(shí)，取自包頭腫瘤醫(yī)院，并經(jīng)液氮保存?zhèn)溆?。人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)（上海）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶液、TRIzol及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000均購(gòu)自Life Technology公司（美國(guó)）；CCK-8試劑購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司（中國(guó)）；報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-basic購(gòu)自Promega公司（美國(guó)）；circUBAP2 siRNA質(zhì)粒和對(duì)照siRNA質(zhì)粒均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RTPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司（中國(guó)）；細(xì)胞周期和凋亡Annexin V-FITC/PI試劑盒均購(gòu)自BD公司（美國(guó)）；CDK6、cyclin D1、p27、Bcl-2、Survivin、Bax、FAK、Rac1、MMP2和β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司（美國(guó)）；c-IAP1和JNK、ERK1/2抗體均購(gòu)自CST公司（美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 siRNA 轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%的的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于37oC、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)50%左右時(shí)，按照Lipofectamine 3000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將50 nmol/L circUBAP2 siRNA質(zhì)粒和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后EDTA-胰酶消化，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞分為3組：未處理組（只加Lipofectamine 3000的A549細(xì)胞）、對(duì)照siRNA組（轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA的A549細(xì)胞）、siRNA組（轉(zhuǎn)染circUBAP2 siRNA質(zhì)粒的A549細(xì)胞）。

1.2.2 CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖 分別收集轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后A549細(xì)胞鋪于96孔板中，每個(gè)時(shí)點(diǎn)5個(gè)復(fù)孔，按CCK-8的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，加入CCK-8試劑于37oC中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后與酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm的吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用0.25%的胰酶消化，2,000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，PBS洗2次，2,000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，500 μL 70%乙醇固定，4oC過(guò)夜。第2天，將乙醇固定的細(xì)胞4oC 2,000 r/min離心5 min，棄上層乙醇溶液。采用冷的PBS洗細(xì)胞2次，每管加50 g/L的PI溶液500 μL重懸細(xì)胞沉淀，室溫避光靜置30 min染色，BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，鋪于用poly-HEMA包被的6孔板，培養(yǎng)48 h，離心收集，以預(yù)冷的PBS洗滌，按Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，BD流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)circUBAP2下游靶基因的變化 肺癌和相對(duì)應(yīng)的正常肺組織總RNA，以及細(xì)胞總RNA均采用TRIzol試劑（Life Technology公司）進(jìn)行提取，紫外分光光度儀測(cè)定其濃度。取總RNA 2 μg，按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參照，ABI 7500熒光定量PCR儀上SYBR Green I染料檢測(cè)各基因的表達(dá)情況。反應(yīng)程序：94oC變性3 min后，按下述條件擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)：95oC 5 s，退火溫度30 s，72oC 95 s，72oC延伸5 min。采用2-△△CT法分析各個(gè)樣品的基因相對(duì)表達(dá)差異，各基因引物序列如下表，引物由上海生工生物工程有限公司合成并純化。

1.2.6 Western blot檢測(cè)circUBAP2下游靶蛋白的變化 收集轉(zhuǎn)染后48 h后的A549細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF后離心收集總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4oC、5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入CDK6（1:2,000）、cyclin D1（1:2,000）、p27（1:2,000）、c-IAP1（1:2,000）、Bcl-2（1:2,000）、Survivin（1:2,000）、Bax（1:2,000）、FAK（1:2,000）、Rac1（1:2,000）、MMP2（1:2,000）、p-JNK（1:800）、p-ERK1/2（1:600）、JNK（1:1,500）、ERK1/2（1:1,500）和β-actin（1:5,000）抗體4oC孵育過(guò)夜。TBST洗去一抗，IgG-HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL試劑盒顯影，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn) 本研究中已通過(guò)TargetScan軟件預(yù)測(cè)circRNA UBAP2可能結(jié)合miR-339-5p、miR-1296-5p、miR-96-3p、miR-215-3和pmiR-135b-3p，降低上述miRNAs豐度，本研究將線性UBAP2序列5’-CTATCAATATATTG CTGGAAGGGAATTCAGACACAGCAACAGCTGAACAG ATGCGTCTCG-3’構(gòu)建至熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic，將circRNA UBAP2、UBAP2和上述miRNAs分別共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，以酶標(biāo)儀觀測(cè)熒光強(qiáng)度的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circUBAP2在肺癌組織中高表達(dá) Real-time PCR結(jié)果顯示，肺腺癌組織中circUBAP2的相對(duì)表達(dá)量與正常肺組織差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.743,P=0.001），肺腺癌組織中circUBAP2的相對(duì)表達(dá)量高于正常肺組織（圖1）。

2.2 circUBAP2沉默A549細(xì)胞株的建立 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），A549細(xì)胞circUBAP2 siRNA組中circUBAP2的表達(dá)水平與未處理組和對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.901,P＜0.001）。

2.3 circUBAP2沉默對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞增殖水平以O(shè)D值表示，實(shí)驗(yàn)組與未處理組在24 h、48 h、72 h OD值比較，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD值有差別（F=33.581,P＜0.001），②實(shí)驗(yàn)組與未處理組OD值有差別（F=84.692,P＜0.001），實(shí)驗(yàn)組與未處理組相比OD值比較低，細(xì)胞增殖受到抑制。③實(shí)驗(yàn)組與未處理組的OD值變化趨勢(shì)有差別（F=6.133,P=0.021），見(jiàn)圖3。

表1 Real-time PCR引物及退火溫度Tab 1 Real-time primers and anealing temperatures

表2 circUBAP2沉默對(duì)A549細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響Tab 2 The effect of circUBAP2 siRNA on mRNA expression in A549 cells

圖1 肺癌組織及其對(duì)應(yīng)的正常肺組織中circUBAP2的表達(dá)水平。與正常組相比，*P=0.001。Fig 1 The expression of circUBAP2 in human lung cancer and normal tissues. Compared with normal group, *P=0.001.

圖2 circUBAP2 siRNA對(duì)A549細(xì)胞中circUBAP2表達(dá)的影響。與未處理組相比，*P＜0.05。Fig 2 The effect of circUBAP2 siRNA on circUBAP2 expression in A549 cells. Compared with untreated group, *P＜0.05.

圖3 circUBAP2沉默對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。與未處理組相比，*P＜0.05。Fig 3 The effect of circUBAP2 siRNA on cell proliferation in A549 cells.Compared with untreated group, *P＜0.05.

2.4 circUBAP2沉默對(duì)A549細(xì)胞周期分布的影響 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，circUBAP2 siRNA組中A549細(xì)胞在G0期/G1期比例為（71.21±5.29）%，而未處理組和對(duì)照siRNA組的比例分別為（49.07±5.83）%和（46.58±4.24）%，采用單因素重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析和t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.802,P＜0.001），circUBAP2 siRNA組G0期/G1期比例高于未處理組（圖4）。

2.5 circUBAP2沉默對(duì)A549細(xì)胞失巢凋亡的影響 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示（圖5），circUBAP2 siRNA組中A549細(xì)胞的凋亡率為（49.11±3.62）%，與未處理組（23.74±2.62）%和與對(duì)照siRNA組（24.55±3.11）%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=84.210, P＜0.001）。

圖4 circUBAP2沉默對(duì)A549細(xì)胞周期的影響（n=3）。A:circUBAP2沉默后A549細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)周期檢測(cè)結(jié)果；B：circUBAP2沉默后A549細(xì)胞G0期/G1期比例顯著升高。與未處理組相比，*P＜0.05。Fig 4 The effect of circUBAP2 siRNA on cell cycle in A549 cells (n=3). A: The flow cytometry results showed the cell cycle of circUBAP2 siRNA in A549 cells; B: The G0/G1 ratio was significantly increased after circUBAP2 siRNA in A549 cells. Compared with untreated group,*P＜0.05.

2.6 circUBAP2沉默對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，circUBAP2 siRNA干擾后，其細(xì)胞侵襲力相對(duì)與對(duì)照組明顯降低（圖6），circUBAP2 siRNA組中A549細(xì)胞的侵襲率為（38.72±4.11）%，與未處理組（100.0±10.21）%與對(duì)照siRNA組（97.60±8.62）%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=92.460, P＜0.001），表明沉默circUBAP2可抑制肺癌A549細(xì)胞的體外侵襲能力。

2.7 circUBAP2沉默處理對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)和Real-time PCR結(jié)果顯示，與未處理組細(xì)胞相比，circUBAP2 siRNA處理后A549細(xì)胞中的周期凋亡相關(guān)基因CDK6、cyclin D1、c-IAP1、Bcl-2和Survivin的mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著下降，而p27和Bax的表達(dá)顯著上升。干擾組中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因中FAK、Rac1和MMP2的表達(dá)較對(duì)照組都顯著下降，采用單因素重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析和t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

2.8 circUBAP2沉默對(duì)JNK-MAPK信號(hào)途徑的影響 我們采用Western blot檢測(cè)了ERK1/2和JNK的活性表達(dá)。結(jié)果表明，circUBAP2干擾可下調(diào)JNK和ERK1/2的活性（圖8），提示JNK-MAPK信號(hào)途徑在circUBAP2調(diào)控肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

2.9 circUBAP2直接作用miRNA 我們采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析了circUBAP2直接作用miRNA。結(jié)果表明，circUBAP2可挽救miR-339-5p、miR-96-3p和miR-135b-3p對(duì)UBAP2熒光的抑制作用（圖9），則表明circUBAP2可與上述miRNA相結(jié)合，miR-339-5p、miR-96-3p和miR-135b-3p是circUBAP2直接作用miRNA。

3 討論

研究顯示，circUBAP2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，參與腫瘤的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移，其在腫瘤中可能扮演癌基因的作用[6]，但circUBAP2在肺癌的作用機(jī)制尚不清楚。肺腺癌是惡性程度較高的肺癌類型，因此，本研究首先檢查了30例肺腺癌組織及對(duì)應(yīng)的正常肺組織中circUBAP2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)circUBAP2在肺腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肺組織，提示circUBAP2在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其確切的作用機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

為了進(jìn)一步研究circUBAP2在肺腺癌細(xì)胞中的作用，我們采用siRNA干擾技術(shù)沉默circUBAP2的表達(dá)，體外研究circUBAP2對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞失巢凋亡和細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circUBAP2表達(dá)沉默能抑制肺癌細(xì)胞體外增殖及侵襲能力，并且誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0期/G1期停滯和細(xì)胞失巢凋亡，進(jìn)一步證實(shí)circUBAP2在肺癌細(xì)胞中扮演癌基因的作用。

圖5 circUBAP2沉默對(duì)A549細(xì)胞失巢凋亡的影響Fig 5 The effect of circUBAP2 siRNA on cell anoikis in A549 cells

圖6 circUBAP2沉默對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）。A：circUBAP2沉默后A549細(xì)胞Transwell侵襲檢測(cè)結(jié)果；B：circUBAP2沉默后A549細(xì)胞侵襲率顯著下降。與未處理組相比，*P＜0.05。Fig 6 The effect of circUBAP2 siRNA on invasion in A549 cells (×200). A: The Transwell results showed the invasion of circUBAP2 siRNA in A549 cells; B: The invasion rate was significantly decreased after circUBAP2 siRNA in A549 cells.Compared with untreated group, *P＜0.05.

圖7 circUBAP2沉默對(duì)細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig 7 The effect of circUBAP2 siRNA on cell apoptosis and metastasis related genes in A549 cells

圖8 circUBAP2沉默對(duì)JNK-MAPK信號(hào)途徑的影響Fig 8 The effect of circUBAP2 siRNA on JNK-MAPK pathway in A549 cells

圖9 circUBAP2在A549細(xì)胞中的直接作用miRNA。與UBAP2組相比，*P＜0.05；與UBAP2+miRNA組相比，#P＜0.05。Fig 9 The direct miRNA of circUBAP2 in A549 cells. Compared with UBAP2 group, *P＜0.05; compared with UBAP2+miRNA group, #P＜0.05.

為了進(jìn)一步探討circUBAP2表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力受抑制的可能分子機(jī)制，我們研究了細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因CDK6、cyclin D1、p27、c-IAP1、Bcl-2、Survivin和Bax表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDK6、cyclin D1和c-IAP1的表達(dá)顯著下調(diào)，而p27和Bax顯著上升。周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK6是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要因子，和cyclin D結(jié)合形成異二聚體，而實(shí)現(xiàn)對(duì)G1期-S期的推進(jìn)和轉(zhuǎn)化作用[7]。P27可通過(guò)結(jié)合cyclin-CDK2復(fù)合物和cyclin-CDK4復(fù)合物并抑制其活性，調(diào)控 p53/p27信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)控將細(xì)胞周期阻滯在G0期/G1期[8-11]。

失巢凋亡（anoikis）是一種由細(xì)胞外基質(zhì)和其他細(xì)胞脫離接觸而誘發(fā)的細(xì)胞程序性死亡，在機(jī)體發(fā)育、組織自身平衡、疾病發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。因此考察circUBAP2對(duì)肺癌細(xì)胞失巢凋亡的影響，可以更加真實(shí)地反映其在體內(nèi)調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，本研究發(fā)現(xiàn)沉默circUBAP2的表達(dá)可誘導(dǎo)A549細(xì)胞失巢凋亡。c-IAP1是抗細(xì)胞凋亡因子家族的重要成員之一，可通過(guò)抑制Caspase3、7、9等酶的活性而發(fā)揮阻斷凋亡的作用[12]。Bcl-2、Survivin和Bax是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子[13]，circUBAP2可能通過(guò)調(diào)控上述基因的表達(dá)參與肺癌細(xì)胞的失巢凋亡。

Rac1是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，通過(guò)GDP/GTP循環(huán)發(fā)揮其生物學(xué)功能，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲轉(zhuǎn)移等細(xì)胞行為。FAK是Rac1的重要靶基因，是Rac-FAK1信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因，在細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMP-2是主要的IV型基質(zhì)金屬蛋白酶，與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也是Rac-FAK1信號(hào)途徑的重要下游基因[14]。本研究中，circUBAP2干擾可抑制Rac1和FAK的表達(dá)，并進(jìn)而抑制MMP-2的表達(dá)，提示circUBAP2可能通過(guò)Rac-FAK1信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

JNK信號(hào)途徑在腫瘤細(xì)胞侵襲中起著重要作用，其中JNK和ERK1/2為該途徑的關(guān)鍵部位[15]。本研究顯示，circUBAP2干擾可抑制JNK和ERK1/2的活性，提示JNK信號(hào)途徑在circUBAP2調(diào)控肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用。環(huán)狀RNA分子具有miRNA作用位點(diǎn)，可以通過(guò)miRNA海綿作用競(jìng)爭(zhēng)性的與miRNA結(jié)合，從而間接調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，被結(jié)合的miRNA可以被認(rèn)為是環(huán)狀RNA的直接作用miRNA。本研究通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析了circUBAP2直接作用miRNA。結(jié)果表明miR-339-5p、miR-96-3p和miR-135b-3p是circUBAP2直接作用miRNA。

總之，circUBAP2在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，沉默circUBAP2可抑制肺癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)、侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡，其可能成為肺癌治療的重要靶點(diǎn)。