黃迎 蘇健 黃小穗 盧丹霞 謝至 楊素清 郭偉浜 呂志異 吳紅穗 張緒超

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1, UGT1A1 ）是伊立替康（irinotecan）的主要代謝酶，其活性與伊立替康的療效及不良反應(yīng)密切相關(guān)，而UGT1A1*28基因多態(tài)性可顯著影響該酶的表達(dá)與活性，增加伊立替康化療患者發(fā)生腹瀉、嚴(yán)重粒細(xì)胞減少等不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。伊立替康是小細(xì)胞肺癌標(biāo)準(zhǔn)二線治療方案，檢測(cè)UGT1A1*28基因多態(tài)性對(duì)于指導(dǎo)肺癌個(gè)體化治療具有一定臨床意義[1-4]。

目前檢測(cè)基因多態(tài)性常用的方法主要包括：Sanger測(cè)序法、變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC）、變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis, DGGE）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism, SSCP）、熒光定量PCR、PCR-LDR等多種。Sanger測(cè)序法是檢測(cè)UGT1A1*28突變的傳統(tǒng)和經(jīng)典方法，但Sanger測(cè)序法耗時(shí)，且靈敏度低，僅達(dá)10%[5,6]。本研究嘗試用片段分析方法，以期快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)UGT1A1*28多態(tài)性，獲得一種更適用于臨床的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 外周血DNA提取試劑盒（Qiagen公司），緩沖液、超純甲酰胺、POP4膠和GeneScan-500 LIZ Size Standard（美國(guó)Applied Biosystems，ABI公司）。3730基因分析儀（美國(guó)Applied Biosystems，ABI公司），QIAsymphony SP高通量全自動(dòng)樣品純化工作站（Qiagen公司），Nano Drop 8000分光光度計(jì)（Thermo公司），PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技公司），水平電泳儀（德國(guó)BIO-RAD公司），UVI凝膠成像系統(tǒng)（德國(guó)BioRad公司）。

1.2 樣本及質(zhì)控品 286例樣本均取自廣東省人民醫(yī)院2014年4月-2015年5月住院肺癌患者，抽取靜脈EDTA抗凝全血1 mL?；颊吲R床特征見表1，所有患者均簽署知情同意書；10份UGT1A1*28質(zhì)控品來(lái)源于國(guó)家衛(wèi)計(jì)委。

1.2.1 引物合成 片段分析引物：上游引物：5’FA M-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA3’，下游引物：5’TAGCACCTGACGCCTCGTTGT3'；擴(kuò)增產(chǎn)物為1 2 8 b p。S a n g e r測(cè)序上游引物：5’CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA3’；下游引物：5’ACAACGAGGCGTCAGGTGCTA3’均由Life公司合成。

1.2.2 DNA提取 按試劑說明書提取基因組DNA，測(cè)OD值，并配成10 ng/μL。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 總反應(yīng)體系10 μL，含Premix Ex Taq Hot Start Version 5 μL（大連TAKARA公司），DNA模板1 μL，2 μM上下游引物各0.5 μL，ddHO23 μL。擴(kuò)增條件為：94oC預(yù)變性3 min，94oC變性30 s，55oC退火30 s，72oC延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后4oC保存。每次實(shí)驗(yàn)均加一個(gè)無(wú)模板空白對(duì)照。

1.3 基本掃描分析 取熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物1 μL，加69 μL水作1:70稀釋，取1 μL稀釋產(chǎn)物與0.5 μL Genescan-500 LIZ Size Standard及9 μL去離子甲酰胺混合，在ABI-3730 DNA序列分析儀中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。計(jì)算機(jī)自動(dòng)收集電泳過程中不同時(shí)間所出現(xiàn)的不同顏色和強(qiáng)度的熒光素，以顯示出不同的位置、高度、顏色和形態(tài)的峰；Gene Scan Genotyper 3.5軟件自動(dòng)分析收獲的數(shù)據(jù)。

1.4 確定方法學(xué)的準(zhǔn)確度、精確度及最低檢測(cè)限 將DNA配制成不同的濃度（1 ng/μL、2.5 ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL、20 ng/μL），每個(gè)濃度檢測(cè)三個(gè)復(fù)孔，以確定檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限。所有樣本及質(zhì)控品均用Sanger測(cè)序法同時(shí)檢測(cè)以確定檢測(cè)的準(zhǔn)確度；取4份樣本由兩個(gè)操作者分兩個(gè)批次進(jìn)行檢測(cè)以確定重復(fù)性。

1.5 Sanger測(cè)序 使用本室建立起來(lái)的方法，簡(jiǎn)述如下：PCR反應(yīng)體系：每個(gè)25 μL的PCR反應(yīng)包括1 μL（20 ng/μL）模板DNA，12.5 μL Premix Ex Taq HS酶（大連TAKARA公司），1 μL正向和反向引物混合物，10.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：初始變性94oC 5 min：變性94oC 30 s，退火55oC 30 s，72oC延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72oC延伸7 min。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段符合條件后，純化產(chǎn)物。純化的PCR產(chǎn)物用BigDye Teminator V3.1按操作說明書進(jìn)行標(biāo)記及純化，然后在ABI-3730測(cè)序儀上進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Chromas 2.31軟件分析，人工校讀分析UGT1A1上游啟動(dòng)子序列A（TA）nTAA中的TA重復(fù)序列。

1.6 樣本檢測(cè) 先取20例樣本作為實(shí)驗(yàn)集，同時(shí)用片段分析法及Sanger測(cè)序法檢測(cè)UGT1A1*28多態(tài)性，確定三種基因片段在毛細(xì)管電泳時(shí)的位置；其余266例為驗(yàn)證集，與10份質(zhì)控品一起同時(shí)用片段分析法及Sanger測(cè)序法檢測(cè)UGT1A1*28多態(tài)性。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 286例肺癌患者的臨床特征見表1，肺腺癌181例，鱗癌67例，小細(xì)胞肺癌17例，其他病理類型21例。17例小細(xì)胞肺癌中，7例放棄治療；在10例接受了化療的患者中，有3例分別接受一線、二線和三線依立替康治療，均無(wú)不可耐受的嚴(yán)重不良反應(yīng)，基因型均為TA6/6型。

2.2 片段分析數(shù)據(jù)判讀 電泳結(jié)束后，GenScan3.5軟件自動(dòng)分析生成的圖譜文件，給出各片段位置、峰值大小。由于PCR引物標(biāo)記上了VIC熒光，UGT1A1不同的分子分型在毛細(xì)管電泳圖上產(chǎn)生位置和峰高不同的綠色產(chǎn)物峰。通過實(shí)驗(yàn)集的20例樣本確定UGT1A1三種多態(tài)性的峰圖特征：?jiǎn)蝹€(gè)124.2大小的峰為TA6/6型，單個(gè)126.4大小的峰為TA7/7型，124.2及126.4兩個(gè)峰為TA6/7型（圖1）。

2.3 片段分析 片段分析10個(gè)質(zhì)控品結(jié)果完全正確（表2）。DNA最少上樣量為1 ng/μL，不同操作者兩批次檢測(cè)的結(jié)果完全一致。

2.4 兩種方法一致性結(jié)果 286例樣本通過片段分析法檢測(cè)出UGT1A1*28為TA6/TA6 236例（82.5%），TA6/TA7為48例（16.8%），TA7/7為2例（0.7%）；與Sanger測(cè)序結(jié)果呈一致性，準(zhǔn)確度達(dá)100%。10份質(zhì)控品結(jié)果百分之百正確。

3 討論

圖1 UGT1A1*28基因分型圖例。A、B：UGT1A1*28 TA6/6野生型，峰的位置位于124.2；C、D：UGT1A1*28 TA 7/7純合突變型，峰的位置位于126.4；E、F：UGT1A1*28 TA6/7雜合型，有兩個(gè)峰，位置分別為124.2及126.4；A、C和E是片段分析圖譜；B、D及F是Sanger測(cè)序圖譜。Fig 1 Representative figures of UGT1A1*28 polymorphysin. A, B: UGT1A1*28 TA6/6. The trace is located in 124.1; C, D: UGT1A1*28 TA 7/7. The trace is located in 126.4; E, F: UGT1A1*28 TA6/7. There are two traces which are located in 124.2 and 126.4, respectively. A, C and E are generated with fragment analysis, while B, D and F are generated with Sanger sequencing.

表1 286例患者的臨床特征及UGT1A1*28多態(tài)性Tab 1 Characteristics of patients with lung cancer and UGT1A1*28 polymorphism

表2 片段分析檢測(cè)10例UGT1A1質(zhì)控品結(jié)果Tab 2 Results of 10 standards detected with Sanger sequencing and Fragment analysis

本研究建立一種片段分析法快速檢測(cè)UGT1A1*28多態(tài)性，一共檢測(cè)286例肺癌患者血液標(biāo)本，與Sanger測(cè)序比較，準(zhǔn)確性均達(dá)100%，參加國(guó)家衛(wèi)計(jì)委室間質(zhì)評(píng)結(jié)果完全正確。最少DNA用量可達(dá)1 ng/μL。3例小細(xì)胞肺癌患者分別接受一線、二線和三線依立替康治療，均無(wú)不可耐受的嚴(yán)重不良反應(yīng)，基因型均為TA6/6型。

UGT1A1啟動(dòng)子區(qū)域的TATAA區(qū)若插入一個(gè)TA，即A（TA）7TAA；野生型則為A（TA）6TAA。UGT1A1*28多態(tài)性有三個(gè)基因型：TA6/TA6（野生型）、TA6/TA7（雜合突變型）和TA7/TA7（純合突變型）。TA6/7和TA7/7基因型的UGT1A蛋白質(zhì)的代謝中間產(chǎn)物SN-38的糖脂化作用下降，因而增加了伊立替康的毒副作用，臨床通過減少藥物用量，可以減輕毒副作用，但對(duì)藥物療效影響不大，因此，UGT1A1*28基因的多態(tài)性有助于指導(dǎo)臨床用藥[1-4]。

目前，檢測(cè)UGT1A1*28基因的多態(tài)性的方法主要是Sanger測(cè)序法[7,8]，但Sanger測(cè)序法步驟繁瑣、一個(gè)檢測(cè)周期需要兩天，結(jié)果判讀較復(fù)雜，不能為臨床提供快速的檢測(cè)服務(wù)。

片段分析方法基本工作原理是用熒光標(biāo)記的引物擴(kuò)增DNA目的片段，若目的片段由于突變導(dǎo)致片段大小發(fā)生改變，將熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物置于ABI-3730基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳結(jié)果用GenScan 3.5軟件進(jìn)行分析，電泳圖上出現(xiàn)兩個(gè)位置不一樣的峰形，根據(jù)產(chǎn)物峰的位置大小可作出結(jié)果判斷。毛細(xì)管電泳分辯率高，可以區(qū)分1個(gè)堿基的差異。由于此技術(shù)操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、費(fèi)用少，已得到廣泛的應(yīng)用。Furtado等[9]在真性紅細(xì)胞增多癥樣本中比較Sanger測(cè)序法、熔解曲線法（high resolution melting,HRM）及片段分析法檢測(cè)JAK2基因12外顯子的突變，包括缺失突變、插入突變、K539L點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)片段分析更靈敏，可檢測(cè)突變含量為2%的樣本（極限為0.5%），而HRM法及Sanger測(cè)序靈敏度則為10%；片段分析法結(jié)果解讀更容易。該研究者設(shè)計(jì)了單管檢測(cè)JAK2基因缺失突變、插入突變、K539L突變，提高了檢測(cè)通量，缺點(diǎn)是不能同時(shí)檢測(cè)其他類型的點(diǎn)突變。Gardner等[10]在47例血液腫瘤標(biāo)本中比較了片段分析法、Sanger測(cè)序法及二代測(cè)序法檢測(cè)CALR基因外顯子9的缺失及插入突變。發(fā)現(xiàn)1例缺失突變，2例插入突變；片段分析法與Sanger測(cè)序法結(jié)果完全一致，二代測(cè)序法用常規(guī)流程檢測(cè)時(shí)，該1例缺失突變未能檢測(cè)，用IGV軟件分析，發(fā)現(xiàn)是因?yàn)樵搮^(qū)域的復(fù)蓋度不夠?qū)е陆Y(jié)果為陰性。但I(xiàn)GV可同時(shí)發(fā)現(xiàn)1個(gè)小缺失及幾個(gè)點(diǎn)突變。

UGT1A1*28基因在啟動(dòng)子區(qū)域的TATAA盒在野生型為6個(gè)TA，其多態(tài)性插入了一個(gè)TA，野生型及突變型DNA片段之間相差兩個(gè)堿基，在毛細(xì)管電泳時(shí)可以明顯區(qū)分開來(lái)。本研究中所建立的片段分析法DNA用量少，可節(jié)約樣本量；檢測(cè)通量高（一次可檢測(cè)96個(gè)樣本），檢測(cè)周期短，一個(gè)檢測(cè)周期僅需1天；精確度及準(zhǔn)確度均達(dá)到100%；成本低，適用于臨床檢測(cè)。近幾年，雖然二代測(cè)序法以更高的靈敏度及更高的通量廣受矚目，但也因其存在一定的錯(cuò)誤率及高費(fèi)用、高技術(shù)要求，讓基層單位望而卻步。

毛細(xì)管電泳時(shí)，DNA產(chǎn)物的上樣量對(duì)電泳圖譜的質(zhì)量影響較大，上樣量過少，產(chǎn)物峰過低，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失??；若上樣量過大，背景過高可導(dǎo)致誤判結(jié)果。用水稀釋PCR產(chǎn)物至一合適濃度，使產(chǎn)物的峰高與分子量標(biāo)記LIZ500的峰高相當(dāng)，則電泳圖譜為最佳。

有研究[11,12]認(rèn)為：依立替康毒副作用與UGT1A1*6多態(tài)性有強(qiáng)相關(guān)關(guān)系而與UGT1A1*28多態(tài)性非相關(guān)；也有研究指出在亞裔患者中，依立替康毒副作用與UGT1A1*6/28均非相關(guān)。由于本研究小細(xì)胞肺癌的病例數(shù)較少，且沒有檢測(cè)UGT1A1*6多態(tài)性，未能闡明中國(guó)小細(xì)胞肺癌患者依立替康毒副作用與UGT1A1*6/28多態(tài)性的相關(guān)性。

綜上所述，片段分析法適用于臨床檢測(cè)UGT1A1*28多態(tài)性，成本低且方便快捷。