李娟 汪毅 劉柳 袁媛 鮑揚漪

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducting ligand, TRAIL）屬于TNF超家族，可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。TRAIL可通過與其受體TRAIL-R1 （death receptor 4, DR4）、TRAIL-R2（death receptor 5, DR5）結(jié)合促使靶細胞發(fā)生凋亡。然而，相當數(shù)量的腫瘤細胞可耐受TRAIL誘導的凋亡而得以存活——針對此類已發(fā)生TRAIL抵抗的腫瘤細胞，僅以TRAIL處理無法對之進行殺傷。腫瘤細胞對TRAIL發(fā)生耐受的原因是多方面的：腫瘤細胞表面的DR4、DR5表達低下或功能異常、TRAIL與DR4、DR5結(jié)合后胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導受阻、胞內(nèi)抗凋亡蛋白高表達以及促生存通路活化等因素均能使腫瘤細胞對TRAIL發(fā)生原發(fā)（繼發(fā)）的抵抗[1]。理解腫瘤細胞TRAIL抵抗現(xiàn)象的發(fā)生機制有助于逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對TRAIL的耐受；此外，將傳統(tǒng)化療或表觀調(diào)節(jié)類藥物（即增敏劑）與TRAIL處理相聯(lián)合作用于腫瘤細胞，上調(diào)TRAIL的促凋亡效應也是目前TRAIL的研究重點之一。TRAIL治療晚期非小細胞肺癌[2]（non-small cell lung cancer, NSCLC）及轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌[3]已經(jīng)進入II期臨床試驗，但腫瘤細胞對TRAIL的抵抗問題同樣限制了其在臨床上的應用。

硫利達嗪（thioridazine, THZ）為一種多巴胺受體阻滯劑，廣泛應用于精神分裂癥的治療，最近其被證實對多種腫瘤細胞具有抗增殖活性[4-7]。本課題組前期實驗證實[8]，THZ可抑制食管癌ECA-109、TE-1細胞的增殖，且對食管癌細胞具有放射處理增敏效應，其機制可能與下調(diào)線粒體抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL及抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性有關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，我國肺癌患者部分存在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變，而在晚期肺腺癌患者中，EGFR突變陽性率高達50%左右[9]，臨床試驗發(fā)現(xiàn)，針對EGFR突變患者的靶向藥物——EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）如吉非替尼等治療在取得療效進展的同時也存在一定程度的耐藥問題[10]，因此本實驗以EGFR突變型NSCLC PC9細胞為研究對象，觀察THZ對TRAIL的殺傷增敏效應及對TRAIL抵抗的逆轉(zhuǎn)作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞株 人肺腺癌細胞株P(guān)C9購買于中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要藥品與試劑 硫利達嗪，4-PBA購于美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO）、MTT試劑購于美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、1×PBS緩沖溶液購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于浙江天杭生物；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物公司；胰酶、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于北京碧云天生物公司；重組人TRAIL蛋白（rh-TRAIL）、DR5-PE流式抗體購于美國eBioscience公司；兔抗人GRP78單抗、p-eIF2α單抗、ATF4單抗、Caspase-3多抗、PARP單抗及小鼠抗人CHOP單抗、Caspase-8單抗、Caspase-9單抗購于美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人DR5單抗購于英國Abcam公司；兔抗人p-PERK多抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；兔二抗及小鼠二抗購于北京中杉金橋公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與藥物保存使用 配制含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基體積加入雙抗，該培養(yǎng)基用于PC9細胞培養(yǎng)與傳代。加入培養(yǎng)基后將細胞置于37oC、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。注意觀察細胞生長情況及密度，每天全量換液，當細胞呈對數(shù)生長時用0.25%胰酶消化傳代。THZ以DMSO為溶媒進行配制，濃度為0.1 mol/L，為避免藥物的反復凍融，將其分裝成每管10 μL于-80oC冰箱儲存，使用時以完全培養(yǎng)基稀釋成需要的濃度，DMSO終濃度須小于0.1%。重組人TRAIL蛋白以去離子水為溶酶進行配制，濃度為0.1 mg/mL，分裝為每管10 μL于-20oC保存，使用時以完全培養(yǎng)基稀釋成需要的濃度。

1.3 THZ和TRAIL單藥或聯(lián)合處理PC9細胞MTT法實驗步驟 取呈對數(shù)生長PC9細胞，按8×103個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)至細胞呈對數(shù)生長時，對照組換液，實驗組每孔更換含不同濃度的THZ（0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L、40 μmol/L、45 μmol/L、50 μmol/L）的培養(yǎng)基，各組均設(shè)置3個副孔和一個空白孔，培養(yǎng)24 h。為觀察THZ與TRAIL對細胞增殖的影響，細胞給予不同濃度THZ（0 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L）、TRAIL（0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL）單獨或聯(lián)合處理，培養(yǎng)24 h后應用MTT檢測THZ對細胞生長狀況的影響，酶標儀（490 nm和655 nm雙波長）測定各孔吸光度值（optical density, OD），絕對吸光度值=細胞孔吸光度值-空白孔吸光度值，并計算細胞存活率=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。實驗重復3次。

1.4 Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關(guān)鍵蛋白的表達 取對數(shù)生長細胞，按實驗分組更換含THZ培養(yǎng)基，實驗組1：0 μmol/L（對照組）、25 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L；實驗組2：0 μmol/L（對照組）、25 μmol/L THZ聯(lián)合50 ng/mL TRAIL、50 ng/mL TRAIL、1 mmol/L 4-PBA及25 μmol/L THZ聯(lián)合50 ng/mL TRAIL，培養(yǎng)24 h后常規(guī)胰酶消化收集細胞，計數(shù)后加入相應量的細胞裂解液后沸水浴裂解提取蛋白。蛋白樣品離心處理后制膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉1 h，室溫孵育1:1,000一抗1 h，1×TBST洗膜10 min，3遍，室溫孵育1:5,000二抗1 h，1×TBST洗膜10 min，3遍，在PVDF膜表面涂布發(fā)光劑，暗室曝光顯影。Western blotting條帶經(jīng)掃描儀掃描成像后，采用Image J進行灰度分析，計算目的蛋白與β-actin的灰度比值，進行下一步統(tǒng)計分析。實驗重復3次。

1.5 流式檢測細胞表面DR5表達水平 取處于對數(shù)生長期的PC9細胞，按2×105個/孔接種于六孔板。常規(guī)培養(yǎng)至細胞呈對數(shù)生長時，按實驗分組更換含培養(yǎng)基，實驗組為：THZ（25 μmol/L）、THZ（25 μmol/L）聯(lián)合4-PBA（1 mmol/L），對照組加0.1%DMSO培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，PBS洗滌后重懸，DR5抗體孵育，混勻，4oC反應30 min，上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.6 流式檢測細胞凋亡率 取處于對數(shù)生長期的PC9細胞，按2×105個/孔接種于六孔板。常規(guī)培養(yǎng)至細胞呈對數(shù)生長時，按實驗分組更換含培養(yǎng)基，實驗組為：TRAIL（50 ng/mL）、TRAIL（50 ng/mL）聯(lián)合THZ（25 μmol/L）、4-PBA（1 mmol/L）干預TRAIL（50 ng/mL）聯(lián)合THZ（25 μmol/L），對照組加培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，PBS洗滌后重懸，計數(shù)，加入400 μL Annexin V結(jié)合液重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為1×106個/mL，加入5 μL Annexin V，再加入10 μL PI，混勻，室溫下避光反應15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡，計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析及Dunnett-t檢驗，顯著性檢驗水準取α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 THZ對PC9細胞的增殖抑制作用 MTT結(jié)果顯示，THZ對PC9細胞的增殖抑制效應呈劑量依賴性，THZ對PC9細胞的半數(shù)抑制濃度值（half maximal inhibitory concentration, IC50）為（29.8±1.6）μmol/L。自20 μmol/L起，各實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1A）。400倍光鏡下觀察細胞，實驗組細胞隨著藥物濃度增加，細胞數(shù)量減少，貼壁減少，體積縮小，邊緣透亮，漂浮狀細胞增加（圖1B）。Western blotting結(jié)果顯示隨著THZ濃度增加，Cleaved-caspase-3及Cleaved-caspase-9表達水平明顯增加（圖1C）。

2.2 MTT檢測THZ與TRAIL聯(lián)合的協(xié)同指數(shù) THZ聯(lián)合TRAIL能顯著降低細胞的存活率（圖2），25 μmol/L THZ及50 ng/mL TRAIL聯(lián)合作用于PC9細胞的CI值為0.623（CI＜1）（圖2），表明THZ及TRAIL可協(xié)同抑制PC9細胞存活率。

2.3 THZ誘導PC9細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PBA對細胞表面DR5表達的影響 Western blotting結(jié)果顯示：不同濃度THZ誘導PC9細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，隨著THZ濃度增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關(guān)鍵蛋白GRP78、CHOP表達上調(diào)（F=11.45, P=0.001,4; F=12.94, P＜0.01），相關(guān)蛋白p-PERK（F=35.61, P＜0.01）、p-eIF2α（F=54.26, P＜0.01）、ATF4（F=38.04, P＜0.01）表達上調(diào)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義。流式細胞術(shù)顯示：25 μmol/L THZ可顯著上調(diào)細胞表面DR5表達，而4-PBA可抑制THZ對細胞表面DR5的上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（F=61.19, P＜0.01）（圖3）。

圖1 THZ對PC9的增殖抑制作用。A：THZ呈：劑量依賴性抑制PC9細胞增殖。不同濃度THZ（10 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L、40 μmol/L、45 μmol/L和50 μmol/L）處理細胞24 h，MTT檢測細胞存活率。B：光鏡觀察THZ對PC9細胞形態(tài)影響（×400）。C：不同濃度THZ（25 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L）處理細胞24 h后觀察細胞形態(tài)變化。不同濃度THZ（25 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L）處理細胞24 h后，Western blotting檢測Cleaved-caspase-3及Cleaved-caspase-9表達情況，*P＜0.05, **P＜0.01，***P＜0.001。Fig 1 The proliferation inhibition effect of THZ on PC9 cells. A: THZ inhibited cell survival of PC9 cells in a dose-dependent manner. Cells were treated with different concentrations of THZ (10 μmol/L, 20 μmol/L, 25 μmol/L, 30 μmol/L, 35 μmol/L, 40 μmol/L, 45 μmol/L and 50 μmol/L) for 24 h, and MTT assays was utilized to measure cell viability. B: Morphologic observation of PC9 cells treated with THZ (×400). C: Cells were treated with different concentrations of THZ (25 μmol/L, 30 μmol/L and 35 μmol/L). After treated with different concentration of THZ (25 μmol/L, 30 μmol/L and 35 μmol/L), expression of Cleaved-caspase-3 and Cleaved-caspase-9 were detected by Western blotting. *P＜0.05, **P＜0.01,***P＜0.001.

圖2 THZ聯(lián)合TRAIL抑制PC9細胞增殖 不同濃度THZ（20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L）聯(lián)合不同濃度TRAIL（10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL）作用于細胞24 h后，細胞的存活率（A）及THZ與TRAIL的聯(lián)合指數(shù)（B）。Fig 2 Combination treatment of THZ and TRAIL inhibited cell survival in PC9 cells. Cells were treated with different dose of THZ (20 μmol/L, 25 μmol/L and 30 μmol/L) and different dose of TRAIL (10 ng/mL, 50 ng/mL and 100 ng/mL) for 24 h. Cell viability (A) was measured by MTT assays and combination index (CI) of THZ and TRAIL (B) were calculated.

圖3 THZ誘導PC9細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。A：THZ誘導細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達變化，不同濃度THZ（25 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L）作用于細胞24 h后，Western blotting檢測GRP78、CHOP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4表達水平；B：流式細胞術(shù)檢測THZ（25 μmol/L）單獨或聯(lián)合4-PBA（1 mmol/L）處理PC9細胞對細胞表面DR5表達的影響。THZ作用于細胞24 h可上調(diào)細胞表面DR5表達，而4-PBA聯(lián)合THZ組可顯著抑制細胞DR5表達上調(diào)。*P＜0.05,**P＜0.01, ***P＜0.001。Fig 3 ER stress induced by THZ in PC9 cells. A: Expression of ER stress related proteins induced by THZ; B: Cell surface DR5 was detected by flow cytometry of PC9 cells following THZ (25 μmol/L) or combined with 4-PBA (1 mmol/L). After treated with thioridazine 24 h, cell surface DR5 increased significantly in PC9 cells, which can be inhibited by 4-PBA. *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

2.4 THZ可增敏TRAIL對PC9細胞的殺傷效應且4-PBA可抑制此效應 Western blotting結(jié)果顯示：THZ聯(lián)合TRAIL可顯著增加Cleaved-caspase-8、Cleaved-PARP及DR5表達水平（圖4A）。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：THZ聯(lián)合TRAIL組細胞凋亡率為（32.6±4.7）%，單TRAIL處理組為（3.6±1.3）%，加入了4-PBA的THZ聯(lián)合TRAIL組為（17.3±2.9）%，與對照組及單獨TRAIL組相比，THZ聯(lián)合TRAIL組細胞凋亡率明顯增加，而4-PBA可顯著抑制THZ增敏TRAIL誘導的細胞凋亡，與THZ聯(lián)合差異有統(tǒng)計學意義（F=93.51, P＜0.01）（圖4B）。

圖4 THZ聯(lián)合TRAIL誘導PC9細胞凋亡。A：流式細胞術(shù)檢測THZ（25 μmol/L）聯(lián)合TRAIL（50 ng/mL）組、TRAIL組、4-PBA（1 mmol/L）及THZ聯(lián)合TRAIL組細胞凋亡率；B：Western blotting分析各組Cleaved-caspase-8、Cleaved-PARP及DR5表達水平。**P＜0.01, ***P＜0.001。Fig 4 Cell apoptosis induced by combination treatment of THZ and TRAIL in PC9 cells. Cells were treated with TRAIL (50 ng/mL) and/or THZ (25 μmol/L) and/or 4-PBA (1 mmol/L) for 24 h. The apoptosis rate (A) and expression of Cleaved-caspase-8, Cleaved-PARP and DR5 (B) of PC9 cells were measured by flow cytometry and Western blotting respectively. **P＜0.01, ***P＜0.001.

3 討論

自2012年Burgess及Sachlos等發(fā)現(xiàn)THZ可顯著降低人類急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia, AML）細胞的增殖與自我更新能力以來[11,12]，THZ陸續(xù)被證實在體內(nèi)外對多種腫瘤細胞具有抗增殖活性——包括宮頸癌細胞、子宮內(nèi)膜癌細胞[4]、卵巢癌細胞[5]、乳腺癌細胞[6]、胃癌細胞[7]等。本研究組之前證實15 μmol/L THZ即可顯著誘導食管癌細胞凋亡及周期阻滯，且可在體內(nèi)外增敏放療的殺傷效應，其機制可能與下調(diào)線粒體抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL及抑制PI3K/mTOR通路的激活有關(guān)[8]。THZ可能作為一種抗腫瘤的新藥應用于今后的臨床治療。

THZ單獨處理對PC9細胞具有明顯的殺傷效應，表現(xiàn)為Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9表達水平上升，提示THZ具有顯著的體外抗腫瘤效應——這與課題組之前結(jié)果一致[13]。缺血再灌注損傷、氧化應激、藥物及放射線處理等因素均可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生，由此產(chǎn)生的未（錯誤）折疊的蛋白堆積、細胞蛋白質(zhì)合成減少及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解功能增強等級聯(lián)反應，稱為未折疊蛋白反應（unfolded protein response, UPR）[14]。若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)時相過長或是強度過高，且應激因素無法消除時，細胞將因無法及時去除錯誤折疊蛋白而最終啟動凋亡途徑[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應為雙向調(diào)節(jié)反應，低程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激上調(diào)細胞適應能力，保護細胞免于凋亡——在腫瘤治療中可表現(xiàn)為腫瘤細胞對化療藥物的抵抗性升高，參與化療耐藥的發(fā)生過程。UPR主要由GRP78介導，當細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，感受器IRE1、PERK以及ATF6可與GRP78解離并進一步激活各自的信號通路[16]，故GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生的標志性分子。其中，活化的PERK使eIF2α磷酸化，磷酸化的eIF2α能下調(diào)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，但能增加ATF4的轉(zhuǎn)錄表達，ATF4表達能進一步誘導CHOP表達，該通路為CHOP表達所必需的通路[17]，而CHOP被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡中的關(guān)鍵分子，GRP78的過表達將會抑制CHOP的表達及凋亡的發(fā)生。研究[18]表明，抑制PERK/eIF2α通路可顯著增強細胞凋亡作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，25 μmol/L THZ處理PC9細胞后GRP78、CHOP表達水平比對照組明顯增加，且隨著藥物濃度增加，其表達水平逐漸增加，提示THZ處理可使PC9細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，同時PC9細胞內(nèi)的p-PERK、p-eIF2α、ATF4表達水平較對照組明顯上調(diào)，PERK/eIF2α通路被顯著激活。最終上調(diào)CHOP表達，使PC9凋亡過程啟動。

TRAIL可表達于包括活化及靜息B淋巴細胞、活化的T細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞在內(nèi)的多種免疫細胞，是其重要殺傷性配體，TRAIL單體蛋白也被證實可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡且，對正常細胞（組織）毒性較低。TRAIL與其受體DR4/DR5結(jié)合后可形成死亡誘導信號復合體（death inducing signaling complex, DISC），依次激活caspase-8/10、caspase-3啟動凋亡發(fā)生——經(jīng)上述途徑凋亡的細胞稱為I型細胞。而在某些細胞中，TRAIL與DR4或DR5結(jié)合后誘導的外源性促凋亡通路尚不足以啟動靶細胞凋亡，尚需線粒體途徑的參與，稱為II型細胞[19]。腫瘤細胞可對TRAIL誘導的凋亡發(fā)生抵抗，其機制可能與其高表達誘騙受體（Decoy receptors）繼而競爭性抑制DR4和/或DR5有關(guān)。此外，腫瘤細胞DR4和/或DR5表達缺失也是TRAIL抵抗發(fā)生的重要因素。耐受TRAIL的腫瘤細胞在體外能被化療藥物增敏，提示聯(lián)合治療在處理TRAIL抵抗腫瘤細胞中可能有一定的意義。研究表明，乳腺癌細胞株發(fā)生TRAIL抵抗與其細胞膜表面DR4/DR5內(nèi)吞，導致乳腺癌細胞株表面DR4、DR5缺如關(guān)系密切[20]。槲皮素可通過上調(diào)DR5增敏TRAIL誘導卵巢癌細胞凋亡[21]，TRAIL抵抗腫瘤細胞中DR5過表達可重塑TRAIL的敏感性[22]。本實驗流式結(jié)果顯示，50 ng/mL TRAIL與25 μmol/L THZ聯(lián)合處理可顯著降低細胞存活率，兩藥具有協(xié)同作用，聯(lián)合組細胞凋亡率明顯增加。其原因可能與THZ顯著增加PC9細胞表面DR5表達水平有關(guān)。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PBA加入后，THZ誘導的DR5表達上調(diào)即被終止，繼而降低TRAIL聯(lián)合THZ處理組細胞的凋亡率。提示THZ協(xié)同增效TRAIL可能是通過激活ER stress而上調(diào)PC9表面DR5表達引起的。Western blotting結(jié)果也顯示，TRAIL與THZ聯(lián)合組細胞Cleaved-caspase-8、Cleaved-PARP、DR5表達水平較對照組明顯增加，而4-PBA的加入可抑制以上蛋白表達。

綜上所述，THZ能誘導人肺腺癌PC9細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并介導DR5上調(diào)，繼而增敏TRAIL對PC9細胞的凋亡誘導效應，因此THZ可能作為一種有潛力的TRAIL增敏劑。本實驗為體外實驗，需進一步在體內(nèi)驗證體外實驗結(jié)果涉及的分子機制。