鄧敏華 李進(jìn)華 甘燁 陳平

因?yàn)榉闻c外界相通，所以肺上皮細(xì)胞持續(xù)暴露在過(guò)敏原、污染物、刺激物、煙霧、細(xì)菌/病毒感染等損傷因子下。若肺上皮細(xì)胞損傷和再生修復(fù)能力失衡，則導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。氣道上皮在刺激損傷后的修復(fù)過(guò)程可分為3個(gè)相輔相成的步驟：①鄰近上皮細(xì)胞通過(guò)局部擴(kuò)散和遷移覆蓋受損裸露區(qū)域；②肺上皮干/祖細(xì)胞通過(guò)遷移和增殖重建上皮；③上皮干/祖細(xì)胞分化為各種特定細(xì)胞以修復(fù)氣道屏障和呼吸功能[1]。肺上皮干/祖細(xì)胞在維持肺內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和損傷后的再生修復(fù)中起重要作用，分離和鑒定肺上皮干/祖細(xì)胞，深入了解他們?cè)诜闻K生理病理?xiàng)l件下的具體作用機(jī)理，對(duì)肺臟疾病的防治意義深遠(yuǎn)。肺干細(xì)胞是存在于肺組織內(nèi)的成體干細(xì)胞，他們?cè)诜€(wěn)態(tài)下以極低的頻率分裂，具有長(zhǎng)期自我更新和產(chǎn)生一種或多種高度分化功能細(xì)胞的能力；肺祖細(xì)胞也能分化為一種或多種高度分化細(xì)胞，但是通常被認(rèn)為僅具有有限的自我更新能力。由于目前尚無(wú)公認(rèn)的可評(píng)估自我更新能力的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)方法來(lái)區(qū)別肺干細(xì)胞和祖細(xì)胞，并且這種自我更新能力可能受微環(huán)境因素的影響，所以學(xué)者們多將肺干細(xì)胞和祖細(xì)胞一并討論。肺內(nèi)的干/祖細(xì)胞包括肺上皮干/祖細(xì)胞、肺間充質(zhì)干細(xì)胞和肺內(nèi)皮祖細(xì)胞等，而且多種肺臟難治性疾病如肺癌、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺囊性纖維化、特發(fā)性肺纖維化等都可能與肺干/祖細(xì)胞的調(diào)節(jié)和功能異常密切相關(guān)。本文就已經(jīng)鑒定的肺上皮干/祖細(xì)胞的種類、肺上皮干/祖細(xì)胞的研究方法以及他們和肺癌的關(guān)系的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 肺上皮干/祖細(xì)胞種類

肺上皮干/祖細(xì)胞可能是兼職（faculative）干/祖細(xì)胞，即在正常情況下處于靜息狀態(tài)并參與肺臟呼吸功能，如一些干/祖細(xì)胞分泌對(duì)氣體交換至關(guān)重要的蛋白，但是當(dāng)肺損傷時(shí)則迅速變?yōu)槎虝簲U(kuò)充細(xì)胞參與損傷后的再生修復(fù)[2]。由不同類型的細(xì)胞、多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和一些生長(zhǎng)因子組成的微環(huán)境構(gòu)成“干細(xì)胞龕位（stem cell niches）”，這種龕位對(duì)于決定干/祖細(xì)胞的功能和分化效能起關(guān)鍵作用[3]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肺內(nèi)存在多種位于特定區(qū)域龕位內(nèi)的上皮干/祖細(xì)胞，不同的肺上皮干/祖細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)和損傷修復(fù)反應(yīng)中可能發(fā)揮各自特定的作用，不同類型或程度的損傷啟動(dòng)不同的肺上皮干/祖細(xì)胞參與修復(fù)[4]。表1列出了主要的肺上皮干/祖細(xì)胞及其表面標(biāo)記，我們將按這些干細(xì)胞龕位所在部位的順序?qū)Ψ紊掀じ?祖細(xì)胞進(jìn)行闡述。

1.1 近端氣道（氣管-支氣管）肺上皮干/祖細(xì)胞 基底細(xì)胞（basal cells, BCs）是在小鼠的氣管和近端氣道以及人類的全氣道的穩(wěn)態(tài)與損傷后再生修復(fù)中起重要作用的干/祖細(xì)胞。將經(jīng)過(guò)熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)（fluoresence-activated cell sorting, FACS）分離的BCs（Trp63+NGFR+Krt5+）在基質(zhì)膠中培養(yǎng)可形成克隆結(jié)構(gòu)，并且這種克隆結(jié)構(gòu)表達(dá)纖毛細(xì)胞和Clara細(xì)胞的表面標(biāo)記。譜系示蹤技術(shù)也證明，BCs可自我更新并在穩(wěn)態(tài)與SO2吸入損傷后分化為纖毛細(xì)胞和Clara細(xì)胞[5]。最近，Watson等[6]利用長(zhǎng)期譜系示蹤技術(shù)和單細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)基底細(xì)胞是由數(shù)量相近的基底干細(xì)胞（basal stem cells, BSCs）和基底腔祖細(xì)胞（basal luminal precursor cells, BLPCs）組成。他們都表達(dá)Trp63和Krt5，幾乎不表達(dá)Krt14，但是在受損后Krt14卻迅速表達(dá)上調(diào)，這提示Krt14可能是在再生上皮中鑒定活化干細(xì)胞的一個(gè)重要分子標(biāo)記。在穩(wěn)態(tài)環(huán)境下，BSCs通過(guò)不對(duì)稱分裂生成一個(gè)新的BSC和一個(gè)BLPC，后者可進(jìn)一步分化為Clara細(xì)胞或神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。BLPCs的自我更新速率很低甚至可忽略，而且因?yàn)楸磉_(dá)Krt8，有所區(qū)別于BSCs。有意思的是，Pardo-Saganta等[7]利用SO2損傷模型觀察到在Krt8+祖細(xì)胞形成之前，Trp63+基底細(xì)胞群便分離出兩個(gè)亞群，一個(gè)將分化為成熟Clara細(xì)胞，另一個(gè)將分化為纖毛細(xì)胞，而且這種現(xiàn)象并沒(méi)有在穩(wěn)態(tài)上皮中被觀察到，這說(shuō)明BCs在損傷后產(chǎn)生不同于穩(wěn)態(tài)環(huán)境下的祖細(xì)胞亞群?；准?xì)胞可以作為氣道上皮的組織特異性干細(xì)胞，但是他們的異質(zhì)性還有待于進(jìn)行進(jìn)一步研究[8]。

表1 小鼠主要的肺上皮干/祖細(xì)胞Tab 1 Major lung epithelial stem and progenitor cell types in adult murine

導(dǎo)管細(xì)胞是位于氣管粘膜下腺體（submucosal glands,SMGs）導(dǎo)管部的多能干/祖細(xì)胞。Borthwick等[9]將導(dǎo)管細(xì)胞種植到去除上皮的氣管基底膜上，再將其一起移植到免疫缺陷小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可在裸露的氣管內(nèi)再生上皮樣表面。在嚴(yán)重的缺血缺氧損傷后，導(dǎo)管細(xì)胞可分化為粘膜下腺小管、導(dǎo)管細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞[10]。

1.2 細(xì)支氣管肺上皮干/祖細(xì)胞 Clara細(xì)胞已被譜系示蹤技術(shù)證明為可自我更新并能產(chǎn)生纖毛細(xì)胞的干/祖細(xì)胞[11]。在小鼠細(xì)支氣管區(qū)的神經(jīng)內(nèi)分泌小體（neuroendocrine body, NEB）周圍和細(xì)支氣管肺泡連接處（bronchioalveolar duct junction, BADJ）分別代表兩個(gè)不同的干細(xì)胞龕位。譜系示蹤實(shí)驗(yàn)證明，CGRP+肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（pulmonary neuroendocrine cells, PNECs）不僅在穩(wěn)態(tài)下可以自我更新，而且在萘損傷后可分化為Clara細(xì)胞和纖毛細(xì)胞，但是PNECs的去除對(duì)Clara細(xì)胞修復(fù)并無(wú)明顯影響[12]，這表明PNECs可能不是參與細(xì)支氣管修復(fù)的主要細(xì)胞。NEB周圍和BADJ都有變異Clara（variant Clara,vClara）細(xì)胞分布，他們是在萘損傷后位于終末細(xì)支氣管最早而且最主要的增殖細(xì)胞，并且可以自我更新并能分化為Clara細(xì)胞[13]。Teisanu等[14]通過(guò)包括三維培養(yǎng)技術(shù)、譜系示蹤技術(shù)等在內(nèi)的多種技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一種對(duì)萘耐受的細(xì)支氣管祖細(xì)胞，他們是CD45-CD31-CD34-EpCAM+Sca-1loAFlo細(xì)胞，而在CD45-CD31-CD34-EpCAM+Sca-1loAFhi（hi：high，高表達(dá)）細(xì)胞群中包含對(duì)萘敏感的Clara細(xì)胞。BADJ區(qū)內(nèi)還分布極少量對(duì)萘耐受的細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞（bronchioalveolar stem cells, BASCs），他們共表達(dá)CCSP和pro-SPC，可在體外自我更新并能分化為Clara細(xì)胞、I型肺泡細(xì)胞（type I alveolar cell, ATI）和II型肺泡細(xì)胞（type II alveolar cell, ATII），但是不能分化為纖毛細(xì)胞[15,16]。利用CD31-CD45-Sca-1+表型可將BASCs陽(yáng)性富集[17]。然而，另一項(xiàng)研究結(jié)果[15]顯示利用CD45-CD31-EpCAM+Sca-1loCD24lo表型可富集BASCs。此外，McQualter等[18]采用FACS分選出肺CD45-CD31-EpCAMhiCD49f+CD104+CD24lo細(xì)胞，將這些細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)時(shí)形成了表達(dá)氣道和/或肺泡系標(biāo)記的克隆。

Kumar等[19]報(bào)道了當(dāng)亞致死劑量的H1N1流感病毒感染小鼠后，一群Trp63+Krt5+細(xì)胞遷移至細(xì)支氣管及其周圍肺泡區(qū)域，增殖修復(fù)受損的肺泡上皮。近期兩篇發(fā)表于Nature的研究對(duì)此細(xì)胞的來(lái)源和作用機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探討。雖然這些細(xì)胞，有些學(xué)者稱之為遠(yuǎn)端氣道干細(xì)胞（distal airway stem cells, DASCs）和氣管基底干細(xì)胞具有類似的分子標(biāo)記，但是卻與基底干細(xì)胞在體外培養(yǎng)和體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出不同特性。氣管基底干細(xì)胞在體外和體內(nèi)研究中生成的都是更接近近端的氣道上皮，而這些細(xì)胞在體外可形成肺泡球狀物，在體內(nèi)可產(chǎn)生肺泡細(xì)胞和Clara細(xì)胞，并且krt5譜系研究表明這些細(xì)胞是在肺損傷后才產(chǎn)生的[20]。Zuo等[20]為了更進(jìn)一步明確DASCs在H1N1所致肺損傷修復(fù)中的作用，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)去除了小鼠的DASCs，發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組小鼠，這些小鼠在感染H1N1后出現(xiàn)了肺功能下降并且富集的白細(xì)胞也未消散的情況。令人驚訝的是，將從健康小鼠分離出的DASCs經(jīng)擴(kuò)增后通過(guò)氣管內(nèi)滴注移植入小鼠肺內(nèi)，上述現(xiàn)象得到了緩解。Zuo和Vaughan兩者的團(tuán)隊(duì)[20,21]都通過(guò)譜系示蹤技術(shù)對(duì)于H1N1感染誘導(dǎo)出的krt5+細(xì)胞的細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行研究，但兩者的結(jié)果卻不一致。Zuo等[20]觀察到超過(guò)50%的這些細(xì)胞來(lái)自于已存在的krt5+譜系細(xì)胞，而Vaughan的團(tuán)隊(duì)卻只追蹤到13%來(lái)源于krt5+譜系。這原因可能是兩者采用不同的報(bào)告系統(tǒng)（Zuo等采用使用一個(gè)帶有牛krt5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因，而Vaughan等[21]是在內(nèi)源性krt5基因的3'端未轉(zhuǎn)譯區(qū)敲入一個(gè)轉(zhuǎn)基因）。Vaughan等的研究結(jié)果顯示這些誘導(dǎo)出的krt5+細(xì)胞也不是來(lái)源于SPC+譜系或CC10+譜系，因而他們稱之為譜系陰性上皮祖細(xì)胞（lineagenegative epithelial progenitor, LNEPs）。在Vaughan等的實(shí)驗(yàn)中這些細(xì)胞也出現(xiàn)于博來(lái)霉素?fù)p傷后，盡管數(shù)量程度低于流感病毒感染后，但是也提示krt5+再生過(guò)程并不是流感病毒感染后的特異性過(guò)程。Vaughan等還發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可能來(lái)源于整合素β4+CD200+上皮干/祖細(xì)胞，這與Quantius等[22]的研究結(jié)果一致。他們觀察到高致病性的流感病毒雖然可以感染小鼠肺內(nèi)多種細(xì)胞群，但對(duì)一個(gè)具有高增殖能力的上皮細(xì)胞亞群（EpCAMhiCD24lowintegrinα 6high）表現(xiàn)出強(qiáng)烈的趨向性。這些細(xì)胞表達(dá)Sca-1，高度富集整合素β4+CD200+上皮干/祖細(xì)胞，且促進(jìn)流感病毒感染后的Trp63+Krt5+再生過(guò)程。

1.3 肺泡上皮干/祖細(xì)胞 ATII細(xì)胞早于1974年就被鑒定為肺泡上皮的干/祖細(xì)胞[23]。Desai等[24]綜合運(yùn)用分子標(biāo)記、譜系追示和三維培養(yǎng)等方法發(fā)現(xiàn)在胚胎肺發(fā)育過(guò)程中ATI和ATII細(xì)胞都來(lái)源于一種雙能祖細(xì)胞，而在出生后新生的ATI細(xì)胞來(lái)自于少量的具有自我更新能力的成熟ATII細(xì)胞，并且ATII細(xì)胞的這種干細(xì)胞特性在ATI細(xì)胞受損后迅速被廣泛地激活。Liu等[25]采用譜系示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)參與綠膿桿菌介導(dǎo)的肺泡損傷后修復(fù)的是ATII細(xì)胞的一種亞群，即Sca-1+ATII細(xì)胞。這些細(xì)胞不表達(dá)整合素β4、Trp63和CCSP，是不同于其他遠(yuǎn)端氣道祖細(xì)胞及Sca-1+BASCs的。除了ATII細(xì)胞，還有其他干/祖細(xì)胞參與肺泡上皮的穩(wěn)態(tài)維持和損傷后修復(fù)。利用譜系示蹤技術(shù)在CCSP-CreER（Cre recombinase-modified estrogen receptor fusion protein）小鼠（CCSP驅(qū)動(dòng)的可誘導(dǎo)性Cre重組酶，利用此基因重組小鼠可以譜系示蹤C(jī)CSP+細(xì)胞）中，Rawlins等[11]發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)態(tài)或高氧損傷后的肺泡內(nèi)，CCSP+細(xì)胞并沒(méi)有增加，提示這種細(xì)胞不分化為肺泡上皮細(xì)胞；然而Rock等[26]報(bào)道當(dāng)此種小鼠被博來(lái)霉素肺損傷后，CCSP+細(xì)胞分化為ATI和ATII兩種細(xì)胞，提示CCSP+細(xì)胞如BASCs或Clara細(xì)胞，參與肺泡萘損傷后的修復(fù)。這兩種不同的結(jié)論支持了前述觀點(diǎn)，即不同類型或程度的損傷啟動(dòng)不同的肺上皮干/祖細(xì)胞參與修復(fù)。Chapman等[27]的研究表明在博來(lái)霉素肺損傷后再生的ATII細(xì)胞大部分是來(lái)源于肺泡上皮細(xì)胞的一種新亞群，這種新的祖細(xì)胞表達(dá)層粘連蛋白受體4（α6+β4+），但pro-SPC表達(dá)量很少或缺失，在體外克隆實(shí)驗(yàn)中可分化為pro-SPC+細(xì)胞，并在移植實(shí)驗(yàn)中能形成氣道和肺泡結(jié)構(gòu)。這種α6+β4+細(xì)胞可能與McQualter等[18]發(fā)現(xiàn)的CD45-CD31-EpCAMhiCD49f+CD104+CD24lo細(xì)胞相交叉。

以上實(shí)驗(yàn)表明，許多新發(fā)現(xiàn)的推定的肺上皮干/祖細(xì)胞具有異質(zhì)性或處于爭(zhēng)論狀態(tài)，尚需多種體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)方法來(lái)進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證，也提示我們不僅需要在表型上深入了解特異的細(xì)胞表面標(biāo)記以利于分選和鑒定肺上皮干/祖細(xì)胞，還需要完善包括譜系示蹤在內(nèi)的功能性實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖分化能力。

1.4 人肺上皮干/祖細(xì)胞 鼠類的肺臟與人類之間有相同的形態(tài)和功能，但也存在一些差異，如基底細(xì)胞僅分布于小鼠氣管和主支氣管上皮，而在人體可分布至細(xì)支氣管；呼吸性細(xì)支氣管在小鼠中缺如。目前關(guān)于人肺上皮干/祖細(xì)胞所知甚少。Fujino等[28]獲得了人肺泡上皮祖細(xì)胞（alveolar epithelial progenitor cells, AEPCs），這些細(xì)胞擁有ATII細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的一些基因，提示他們?cè)诜闻萆掀ぜ?xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞之間的表型重疊。實(shí)事上，AEPCs能夠在間質(zhì)和上皮之間表型轉(zhuǎn)換，說(shuō)明他們?cè)诜谓M織修復(fù)中的潛在能力。多參數(shù)流式細(xì)胞分析顯示那些推測(cè)的人氣道上皮干/祖細(xì)胞具有一些與鼠類對(duì)應(yīng)干/祖細(xì)胞相似的表達(dá)譜，如人NGFR+α6+Trp63+基底細(xì)胞可分化形成由Krt14+Trp63+基底細(xì)胞、Krt8+管腔細(xì)胞和纖毛細(xì)胞組成的囊性類器官結(jié)構(gòu)[29]。Kajstura等[30]報(bào)道c-kit+細(xì)胞在組織培養(yǎng)時(shí)可分化為內(nèi)胚層和中胚層兩種細(xì)胞系，并且人c-kit+細(xì)胞在注入經(jīng)低溫冷凍后的小鼠肺內(nèi)后參與氣道、肺泡和肺血管的修復(fù)。此研究結(jié)果還有待在穩(wěn)態(tài)和損傷的情況下利用轉(zhuǎn)基因小鼠和譜系示蹤等多種方法行進(jìn)一步驗(yàn)證。若以上得到證實(shí)，則推翻了目前被普遍接受的觀點(diǎn)，即在肺內(nèi)不存在一種單一的可分化形成平滑肌、血管、氣道和肺泡的肺多能干/祖細(xì)胞。Oeztuerk-Winder等[31]也可能分離出一種新的人肺上皮干細(xì)胞即E-Cad/Lgr6+細(xì)胞，這種細(xì)胞在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中具自我更新和分化特性，并且將單個(gè)E-Cad/Lgr6+細(xì)胞移植入腎囊后形成分化的支氣管肺泡組織并保留自我更新的能力。

2 肺上皮干/祖細(xì)胞的研究方法

由于肺臟復(fù)雜的內(nèi)在結(jié)構(gòu)以及尚未發(fā)現(xiàn)肺上皮干細(xì)胞特異的表面標(biāo)記等原因，肺上皮干/祖細(xì)胞的分選和鑒定相比其他組織干細(xì)胞更具挑戰(zhàn)性。目前肺上皮干/祖細(xì)胞的研究方法主要包括肺損傷模型、譜系示蹤技術(shù)、三維培養(yǎng)體系、移植、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析等，這些方法在分離和鑒定肺上皮干/祖細(xì)胞的應(yīng)用中并不是孤立存在，而是相互結(jié)合，相互驗(yàn)證的。

2.1 肺損傷模型 因?yàn)榉紊掀じ戮徛^大多數(shù)肺上皮干/祖細(xì)胞處于靜息狀態(tài)G0期，所以通過(guò)建立不同的肺損傷模型來(lái)激活肺上皮干/祖細(xì)胞。每種模型引發(fā)特定的損傷修復(fù)過(guò)程從而顯露出存活細(xì)胞的增殖分化潛能，同時(shí)也有助于了解肺上皮干/祖細(xì)胞在各損傷模型所代表的肺疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。萘可特異性殺傷大多數(shù)Clara細(xì)胞，繼而對(duì)萘耐受的vClara細(xì)胞通過(guò)增殖、分化和自我更新恢復(fù)這些Clara細(xì)胞群。vClara細(xì)胞對(duì)萘耐受的原因是他們不表達(dá)可將萘代謝為毒性產(chǎn)物的細(xì)胞色素P450 Cyp2f2[32]。然而，關(guān)于在萘損傷后遠(yuǎn)端肺內(nèi)vClara細(xì)胞是否是唯一能自我更新并參與修復(fù)的細(xì)胞群的問(wèn)題尚待解決，于是Reynolds等[33]建立了肺內(nèi)Clara細(xì)胞表達(dá)單純皰疹病毒胸苷激酶的轉(zhuǎn)基因CCtK小鼠品系，通過(guò)給予更昔洛韋可清除所有Clara細(xì)胞而不受Cyp2f2表達(dá)的影響，研究顯示在所有Clara細(xì)胞被去除后，氣道上皮不能修復(fù)再生。Hong等[4]利用CCtK小鼠結(jié)合后述的[3H]胸腺嘧啶標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)PNECs也能自我更新，但尚不足以修復(fù)氣道上皮。這些結(jié)果提示vClara細(xì)胞是氣道上皮干/祖細(xì)胞或?qū)Ω?祖細(xì)胞的維持至關(guān)重要。博來(lái)霉素可致小鼠ATII和ATI細(xì)胞損傷，用于研究肺泡上皮細(xì)胞的干/祖細(xì)胞[16,27]。Ding等[34]采用單側(cè)肺切除術(shù)首次證明了上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用啟動(dòng)和維持肺損傷后的肺泡再生。亞致死劑量的H1N1流感病毒感染小鼠后引起廣泛的細(xì)支氣管和肺泡損傷，導(dǎo)致Clara細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和ATII細(xì)胞的損失，在隨后的肺再生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)Trp63+Krt5+細(xì)胞可能是遠(yuǎn)端氣道干細(xì)胞[19]。

2.2 譜系示蹤 譜系示蹤是基于特定類型細(xì)胞和他的任一子代細(xì)胞持續(xù)表達(dá)可通過(guò)組織學(xué)或活體影像學(xué)方法檢測(cè)的報(bào)告蛋白的一種技術(shù)[35]。此方法有雙重目的：①在不同條件下（穩(wěn)態(tài)或損傷）追蹤被標(biāo)記細(xì)胞及其子代細(xì)胞的命運(yùn)，這就可能明確特定細(xì)胞或細(xì)胞群在相應(yīng)條件下的發(fā)育潛能和命運(yùn)；②檢測(cè)隨著時(shí)間推移，在這些標(biāo)記的細(xì)胞群中有多少比例的細(xì)胞被維持或被稀釋，由此可判斷一個(gè)細(xì)胞群隨著時(shí)間推移是自我維持還是更新于另外一種未被標(biāo)記的細(xì)胞群。譜系示蹤方法是目前追蹤一種細(xì)胞及其子代細(xì)胞的最佳手段，可以評(píng)判一種細(xì)胞的功能到底是干細(xì)胞、短暫擴(kuò)充細(xì)胞、祖細(xì)胞、自我更新的未分化細(xì)胞還是終末分化細(xì)胞。Rawlins等[11]在運(yùn)用此方法追蹤推定的可分化為Clara細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的BASCs的子代細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞無(wú)論是在肺損傷后還是在正常胚胎肺發(fā)育過(guò)程中都只產(chǎn)生傳導(dǎo)氣道上皮而無(wú)肺泡上皮。這在很大程度上削弱了可分化為所有肺細(xì)胞類型的“單一肺多能干細(xì)胞”的概念。

2.3 三維培養(yǎng)體系 三維培養(yǎng)體系指將不同類型的細(xì)胞、不同三維結(jié)構(gòu)的載體如基質(zhì)膠和生長(zhǎng)因子同時(shí)在體外培養(yǎng)，使細(xì)胞能在類似于機(jī)體內(nèi)環(huán)境的三維空間結(jié)構(gòu)中遷移、分化和生長(zhǎng)，形成三維復(fù)合物。此方法已成為鑒定肺干/祖細(xì)胞的增殖、分化和自我更新特性及研究上皮細(xì)胞和基質(zhì)間的細(xì)胞和分子交互作用機(jī)制等的一種重要工具[36]。深入了解干/祖細(xì)胞龕位和關(guān)鍵信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子的作用有助于探索出最優(yōu)載體，從而使此體系不斷完善。將永生的人支氣管上皮細(xì)胞[37]或新鮮分離的人近端氣道上皮細(xì)胞[38]在基質(zhì)膠中行三維培養(yǎng)時(shí)都可形成由分化的氣道上皮細(xì)胞組成的三維復(fù)合類器官結(jié)構(gòu)。目前應(yīng)用較多的是球體培養(yǎng)體系（spheroid culture system）。Chimenti等[39]報(bào)道這種球體培養(yǎng)體系可以形成對(duì)人肺祖細(xì)胞具有類似于龕位功能的微環(huán)境，能夠影響成熟肺祖細(xì)胞的表型，并且還能分泌特定的旁分泌因子。

2.4 移植 腎囊移植模型用于在體內(nèi)檢測(cè)干細(xì)胞自主特性[30]。評(píng)估祖細(xì)胞潛能的新方法還有用基質(zhì)膠皮下注射肺多能干細(xì)胞[40]和體外去細(xì)胞和再細(xì)胞化（decellularization and recellularization）肺模型[41]。后者指去除肺內(nèi)所有細(xì)胞成分，僅留下細(xì)胞外基質(zhì)的全肺支架作為平臺(tái)再結(jié)合三維培養(yǎng)研究肺干/祖細(xì)胞的再細(xì)胞化[42]。近年，Kajstura等[30]首次成功將人肺上皮細(xì)胞移植入經(jīng)低溫冷凍的小鼠肺內(nèi)。Hajj等[43]將分離出的囊性纖維化（cystic fibrosis, CF）患者和非CF患者的氣道上皮細(xì)胞，分別接種至去除上皮的氣管移植物中，再種植到裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)相比于非CF患者，CF患者的氣道上皮細(xì)胞存在分化延遲、增殖活躍及基底細(xì)胞增生的現(xiàn)象。

2.5 慢性標(biāo)記細(xì)胞法 慢性標(biāo)記細(xì)胞法的理論是干細(xì)胞在自我更新分裂過(guò)程中不對(duì)稱性分離染色體，引起老的（“永生”） DNA雙鏈保留于子代干細(xì)胞而新合成的DNA雙鏈被隔離到正在分化的細(xì)胞，從而干細(xì)胞通過(guò)不對(duì)稱性染色體分離或因?yàn)榉至丫徛軌虮Ａ翡迕撗跄蜍眨╞romodeoxyuridine, BrdU）或[3H]胸腺嘧啶等DNA標(biāo)記物[44]。Borthwick等[9]用BrdU標(biāo)記小鼠肺損傷模型，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物主要位于氣管和近端支氣管的SMGs導(dǎo)管處，推斷該處可能存在具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞類型。然而，將此方法用于鑒定干細(xì)胞在近年出現(xiàn)了爭(zhēng)議。Kiel等[44]對(duì)新生小鼠、經(jīng)環(huán)磷酰胺和粒細(xì)胞集落刺激因子處理的小鼠和成年小鼠給予BrdU 4天-10天，然后停用70天。通過(guò)特征性的表面標(biāo)記高度分離、純化造血干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)僅不足6%的造血干細(xì)胞保留BrdU，而在BrdU標(biāo)記的骨髓細(xì)胞中造血干細(xì)胞少于0.5%，這說(shuō)明將BrdU作為造血干細(xì)胞標(biāo)記的特異性和敏感性均很低。因此，將BrdU應(yīng)用于標(biāo)記氣管干細(xì)胞尚須進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.6 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析是近年逐漸發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，旨在研究不同的時(shí)間點(diǎn)單個(gè)細(xì)胞的增殖、分化、功能及細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用等。此方法不需事先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行提純或?qū)撛诘募?xì)胞有一定的了解就可直接檢測(cè)不同的細(xì)胞類型和細(xì)胞譜系，能用于在分子水平勾畫特定細(xì)胞類型、鑒定祖細(xì)胞和其譜系子細(xì)胞以及研究譜系特異的調(diào)節(jié)因子[45-47]。Watson等[6]采用單細(xì)胞基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)基底細(xì)胞具有異質(zhì)性，主要由BSCs和BLPCs組成。

3 肺上皮干/祖細(xì)胞與肺癌

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的致死病因之一，主要根據(jù)他的表型和在氣道中的不同解剖來(lái)源而分為兩大類：小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），其中NSCLC占所有肺癌患者近85%，主要分為肺鱗癌、肺腺癌和大細(xì)胞肺癌。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為肺癌干細(xì)胞具有自我更新和分化為腫瘤內(nèi)所有細(xì)胞的能力，是肺癌的發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥等的“根源”[48]。Gu的團(tuán)隊(duì)[49]首次采用經(jīng)FACS分離出的小鼠肺干/祖細(xì)胞而不是腫瘤細(xì)胞系或已形成的腫瘤來(lái)研究肺癌干細(xì)胞。他們發(fā)現(xiàn)多能轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的過(guò)表達(dá)足以誘導(dǎo)小鼠肺干/祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不僅具有腫瘤發(fā)生和耐藥潛能，還顯著表達(dá)一些促血管生成因子，參與腫瘤血管生成。

大量來(lái)自基因工程小鼠模型的數(shù)據(jù)提示各肺癌亞型可能起源于不同的肺上皮干/祖細(xì)胞群。比如，具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的SCLC很可能起源于神經(jīng)內(nèi)分泌小體內(nèi)的CGRP+PNECs[12,50,51]。對(duì)于肺腺癌，研究報(bào)道SPC+CCSP+BASCs是在腫瘤基因Kras活化后最早增殖的細(xì)胞群[16]。但是，譜系示蹤研究結(jié)果卻表明Kras+肺腺癌可能起源于ATII細(xì)胞[52]。Desai等[24]也觀察到EGFR/KRAS信號(hào)通路選擇性刺激ATII細(xì)胞增殖，將ATII細(xì)胞轉(zhuǎn)化為快速生長(zhǎng)的單克隆腫瘤，他們推測(cè)人肺腺癌主要來(lái)源于ATII細(xì)胞。肺鱗癌具鱗狀分化的特性，并常表達(dá)基底細(xì)胞的表型p63、CK5和轉(zhuǎn)錄因子Sox2，提示肺鱗癌可能起源于基底細(xì)胞[53]，但這尚需基因工程小鼠等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

肺癌干細(xì)胞的深入研究有助于開(kāi)發(fā)出特異性針對(duì)肺癌干細(xì)胞的藥物，如拮抗表面分子標(biāo)記、去除干細(xì)胞的龕位、抑制發(fā)展干細(xì)胞的信號(hào)通路等[54]，且逐漸從基礎(chǔ)走向臨床。已發(fā)現(xiàn)的用于分離和研究肺癌干細(xì)胞的表面分子標(biāo)記主要有CD133、CD166、CD44、CD90、乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）和轉(zhuǎn)錄因子Nanog。Alamgeer等[55]報(bào)道CD133和ALDH1A1的共表達(dá)與已行外科切除的早期NSCLC患者的不良預(yù)后強(qiáng)相關(guān)，這也符合干細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)水平與復(fù)發(fā)相關(guān)的假設(shè)，因他們可間接反映干細(xì)胞的自我更新能力。Yeh等[56]將抗精神病藥甲哌氯丙嗪聯(lián)合吉非替尼或順鉑對(duì)富集的CD133+/CD44+肺癌干細(xì)胞進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)、Wnt信號(hào)通路受到抑制以及化療敏感性增加。戒酒硫（disulfiram）之前一直被用于治療酒精中毒，最近作為ALDH抑制劑在腫瘤治療領(lǐng)域受到關(guān)注。戒酒硫已被報(bào)道在多種實(shí)體瘤中具有抗腫瘤特性，包括肺癌。Nechushtan等[57]進(jìn)行了一項(xiàng)II期臨床試驗(yàn)評(píng)估在順鉑和長(zhǎng)春瑞濱化療基礎(chǔ)上加用戒酒硫治療晚期NSCLC患者的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組患者的生存期延長(zhǎng)。有意思的是，在所有試驗(yàn)者中有兩例長(zhǎng)期存活者，且這兩例均位于戒酒硫試驗(yàn)組。一些高度保守的信號(hào)通路主要包括Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Sonic hedgehog信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路，對(duì)于維持正常干細(xì)胞的功能至關(guān)重要，而腫瘤干細(xì)胞常表現(xiàn)出上述一條或多條信號(hào)通路的持續(xù)活化[58]。目前已研制出多種針對(duì)這些信號(hào)通路的單克隆抗體、siRNA或小分子抑制劑，具有抗腫瘤作用或增強(qiáng)腫瘤對(duì)現(xiàn)有治療的敏感性。一項(xiàng)關(guān)于DKN-01在復(fù)發(fā)或難治性NSCLC患者中的抗腫瘤活性的I期臨床研究（NCT01457417）已完成。DKN-01是細(xì)胞外dickkopf-1（DKK-1）的高親和力中和單克隆抗體，而DKK-1是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑。NCT01457417的臨床研究結(jié)果[59]表明這些NSCLC患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期為2.2個(gè)月，總生存期為6.6個(gè)月，其中一個(gè)患者得到疾病的完全控制。SMO是細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體，Sonic hedgehog信號(hào)通路通過(guò)SMO的激活啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。今年，一些新研發(fā)的小分子SMO拮抗劑，比如LDE-225（NCT01579929）、GDC-0449（NCT00887159）及BMS-833923/XL139（NCT 00927875），已經(jīng)進(jìn)入治療廣泛期SCLC患者的臨床試驗(yàn)。Notch信號(hào)通路抑制劑的研究主要集中于γ-分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitors,GSIs）。γ-分泌酶可將Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域從細(xì)胞膜上釋放出來(lái)，使之進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)參與Notch靶基因的表達(dá)。GSI不僅具有直接的抗腫瘤活性，還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)現(xiàn)有治療的敏感性。GSI可以阻止放療誘導(dǎo)的Notch通路的活化，提示GSI的應(yīng)用可能阻止Notch誘導(dǎo)的放療耐受[60]。Arasada等[61]發(fā)現(xiàn)EGFR突變的肺癌細(xì)胞系（HCC4006, HCC827）在接受厄洛替尼處理后，通過(guò)EGFR依賴的Notch3活化富集了ALDH+干細(xì)胞樣細(xì)胞，而GSI可逆轉(zhuǎn)這種表型。

4 展望

肺上皮干/祖細(xì)胞的研究可能將會(huì)集中在鑒定特異的細(xì)胞表面標(biāo)記以富集同質(zhì)性肺上皮干/祖細(xì)胞群，以及采用各種體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)或發(fā)展新的功能性分析方法全方位驗(yàn)證各上皮干/祖細(xì)胞群的自我更新和分化潛能。同時(shí)，明確肺癌干細(xì)胞、肺上皮干/祖細(xì)胞、肺上皮干/祖細(xì)胞龕位之間的關(guān)系及相關(guān)的信號(hào)通路也至關(guān)重要。肺上皮干/祖細(xì)的深入研究不僅對(duì)于明確肺癌在內(nèi)的肺部疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程有重要意義，而且在再生醫(yī)學(xué)、靶向治療等領(lǐng)域?qū)τ诜伟┰趦?nèi)的難治性肺部疾病的治療提供了一種新的方向。