李慧 劉巖 柳影 柳菁菁 趙丹丹 王瑩 程穎

肺癌是影響國(guó)民健康的頭號(hào)殺手，發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的首位，其中小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC ）約占肺癌總數(shù)的10%-15%。可進(jìn)行手術(shù)切除的小細(xì)胞肺癌患者比例低，大部分患者需接受藥物治療，化療為主要治療藥物[1]。盡管SCLC患者對(duì)初始化療敏感，但易復(fù)發(fā)，可選擇的二線治療藥物較少，其耐藥機(jī)制不明。SCLC的疾病發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制復(fù)雜，盡管普遍存在Tp53和RB基因等缺失，但缺少有效的靶向藥物。近20年來(lái)SCLC的臨床治療缺乏突破，急需尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物來(lái)改善SCLC的治療現(xiàn)狀[2]。

腫瘤免疫治療成為腫瘤治療的一個(gè)重要研究領(lǐng)域，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4）、程序壞死因子（programmed death 1, PD-1）和程序壞死因子配體（programmed death ligand 1, PD-L1）的單藥或聯(lián)合用藥已經(jīng)獲批用于臨床治療黑色素瘤、腎癌及非小細(xì)胞肺癌。在小細(xì)胞肺癌中，也有眾多免疫靶向治療臨床研究正在進(jìn)行。然而免疫靶向藥物至今缺少療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，因此難以挑選適合靶向治療的人群，導(dǎo)致治療缺乏針對(duì)性，總體療效差[3,4]。

CTLA-4、PD-1和PD-L1高表達(dá)于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞或腫瘤中[5-11]，眾多研究將其作為腫瘤免疫靶向的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，但研究結(jié)果受標(biāo)本、檢測(cè)方法、結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)的限制，目前缺乏統(tǒng)一共識(shí)。SCLC組織標(biāo)本獲取困難，液態(tài)標(biāo)本具有實(shí)時(shí)無(wú)創(chuàng)的特點(diǎn)，可作為SCLC生物標(biāo)志物檢測(cè)的有效替代標(biāo)本，本研究擬檢測(cè)SCLC患者外周血中PD-1、PD-L1及CTLA-4在淋巴細(xì)胞中的分布情況，探討其致病機(jī)制，分析上述生物標(biāo)志物的臨床價(jià)值，為SCLC免疫靶向藥物的臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 招募吉林省腫瘤醫(yī)院2014年1月-2016年1月住院并確診為SCLC患者290例，其中男性176例，女性114例；廣泛期114例，局限期176例；年齡39歲-71歲，中位年齡51歲。所有患者均未進(jìn)行放化療或免疫治療，另外，選取60名健康志愿者作為對(duì)照組，男性33例，女性27例，年齡范圍30歲-60歲，中位年齡47歲。本研究已通過(guò)吉林省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集 所有SCLC患者（采血點(diǎn)：化療前及化療2周期末）和健康志愿者均分別抽取外周靜脈血2 mL，4oC保存，2 h內(nèi)檢測(cè)。

1.3 試劑與儀器 人SCLC細(xì)胞系H446和前列腺癌細(xì)胞系PC-3購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液和胰酶均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；鼠抗人PE標(biāo)記的PD-1/PD-L1單克隆抗體（CD279-PE/CD274-PE）、APC標(biāo)記的CTLA-4單克隆抗體（CD152-PerCP）及鼠抗人CD3、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4和CD25、PerCP標(biāo)記的鼠抗人CD8單克隆抗體（CD8-PerCP）及流式細(xì)胞儀均購(gòu)自BD公司。免疫化學(xué)染色試劑均購(gòu)自中杉公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 采用DMEM（含10% FBS）培養(yǎng)H446細(xì)胞和PC-3細(xì)胞，在37oC、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到90%覆蓋率時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 100 μL抗凝血中分別加入5 μL抗體，室溫孵育30 min；應(yīng)用200 μL紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，渦旋振蕩30 s，待抗凝血顏色澄清后立即以2,000 rpm速度離心10 min，去除上清液，加入500 μL PBS重懸細(xì)胞沉淀，使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)蛋白表達(dá) 對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞消化后爬片培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，滴加一抗（1：200）濕盒中4oC冰箱孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次后，滴加反應(yīng)液（第二抗體），室溫下溫育30 min，DAB試劑盒顯色5 min-10 min或顯微鏡下觀察棕黃色反應(yīng)后終止。流水沖洗后蘇木素復(fù)染，常規(guī)樹(shù)脂封片。PC-3細(xì)胞做陰性對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間差異比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCLC外周血中CTLA-4在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中高表達(dá) 在淋巴細(xì)胞、成熟T淋巴細(xì)胞（CD3陽(yáng)性）和輔助性T淋巴細(xì)胞（CD4陽(yáng)性）中，CTLA-4陽(yáng)性細(xì)胞分別為（1.56±1.24）%、（4.87±5.18）%和（3.85±2.60）%，與健康對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4和CD25陽(yáng)性）中，CTLA-4陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于健康對(duì)照組（7.09±5.09）% vs（1.91±1.27）%，P＜0.001，提示SCLC免疫系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能通過(guò)高表達(dá)CTLA-4進(jìn)一步發(fā)揮免疫抑制功能，從而幫助腫瘤實(shí)現(xiàn)免疫逃逸（圖1）。

2.2 PD-1在外周血效應(yīng)性T細(xì)胞（CD8+T）中的分布表達(dá) 我們首先檢測(cè)了SCLC患者外周血中總淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞（PD-1+和CD3+PD-1+）中陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，分別為（8.07±3.97）%和（26.63±9.04）%，對(duì)比健康對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步檢測(cè)輔助性T細(xì)胞（CD4）和效應(yīng)性T細(xì)胞（CD8）中PD-1的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，PD-1在效應(yīng)性T細(xì)胞中表達(dá)水平明顯降低，分別為（22.56±4.21%） vs （11.47±5.85）%，P＜0.001，但在輔助性T細(xì)胞中無(wú)顯著差別，提示PD-1信號(hào)通路主要抑制效應(yīng)性T細(xì)胞而不是輔助性T細(xì)胞（圖2）。

2.3 SCLC外周血中PD-1及CTLA4與臨床病理因素的關(guān)系CD4+CD25+CTLA-4+細(xì)胞和CD8+PD-1+細(xì)胞水平與患者的年齡、性別、吸煙狀況、臨床分期以及是否轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)（P＞0.05）（表1）。但經(jīng)2周期化療后CD4+CD25+CTLA-4+及CD8+PD-1+的表達(dá)水平比治療前降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為（6.94±4.91）% vs（5.11±2.60）% 和（11.48±5.91）% vs（8.74±3.39）%，P均＜0.000,1（表2）。

2.4 PD-L1在SCLC外周血及細(xì)胞中的分布情況 本研究在SCLC外周血單個(gè)核細(xì)胞中（圖3A）及T淋巴細(xì)胞中（圖3B）均檢測(cè)到PD-L1極低水平的表達(dá)（0.01±0.001）%，但在SCLC細(xì)胞系H446細(xì)胞中PD-L1高表達(dá)（圖3C），并定位在細(xì)胞漿及細(xì)胞膜中（圖3D）。

表 1 SCLC患者外周血中CD8+PD-1+及CD4+CD25+CTLA-4+與臨床病理因素的關(guān)系Table 1 The relationship between CD8+PD-1+ and CD4+CD25+CTLA-4+ level and clinicopathologic parameters in the patients with SCLC

3 討論

免疫靶向藥物單藥或聯(lián)合用藥已經(jīng)在美國(guó)和歐盟批準(zhǔn)用于治療多種晚期實(shí)體腫瘤，包括晚期非小細(xì)胞肺鱗癌和廣泛期小細(xì)胞肺癌[12-14]，但缺少公認(rèn)的療效預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，因此難以在治療前對(duì)患者進(jìn)行篩選和分層進(jìn)行更精準(zhǔn)的治療[15]。

腫瘤組織是進(jìn)行生物標(biāo)志物研究和檢測(cè)的可靠標(biāo)本來(lái)源，但組織活檢由于取材創(chuàng)傷性和對(duì)活檢技術(shù)及操作人員要求高，組織存在異質(zhì)性等，在實(shí)際臨床診療中具有局限性。以血液為代表的液態(tài)標(biāo)本，具有取材便捷無(wú)創(chuàng)、不存在異質(zhì)性、可多次取樣以實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，滿足了臨床實(shí)踐需求，因此是臨床轉(zhuǎn)化性研究，尤其是肺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在非小細(xì)胞肺癌的治療中使用液態(tài)標(biāo)本進(jìn)行分子病理診斷得到廣泛認(rèn)可，2016年《中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)原發(fā)性肺癌診療指南》首次將液態(tài)標(biāo)本（循環(huán)游離DNA）和液體活檢納入指南中[16]?？墒中g(shù)的SCLC患者僅占發(fā)病人數(shù)的5%左右，腫瘤標(biāo)本獲取更加困難，因此采用血液標(biāo)本發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物指導(dǎo)SCLC的診療更為迫切。

表 2 化療前后CD4+CD25+CTLA4及 CD8+PD-1的表達(dá)水平表 2 The level of CD4+CD25+CTLA4 and CD8+PD-1 prior to chemotherapy (baseline) and after the second cycle of chemotherapy (2nd cycle)

Erfani等[17]發(fā)現(xiàn)喉鱗狀細(xì)胞癌CTLA4既高表達(dá)在CD8+淋巴細(xì)胞中，也高表達(dá)在CD4+和CD19+淋巴細(xì)胞中，我們的結(jié)果顯示SCLC患者CD4+細(xì)胞表達(dá)CTLA-4，但CD4、CTLA-4雙陽(yáng)性細(xì)胞在SCLC和健康人中表達(dá)水平無(wú)差異。我們對(duì)于CD4細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)SCLC CD4+CD25+陽(yáng)性細(xì)胞與健康人無(wú)差別，但CD4+CD25+CTLA-4+三陽(yáng)性細(xì)胞水平明顯高于健康人，平均水平約為3倍，因此我們認(rèn)為SCLC中CTLA-4可能通過(guò)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能，這與龐春等[18]在肝癌中的研究結(jié)論一致，該研究認(rèn)為CD4+CD25+CTLA-4+細(xì)胞是一群重要細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞數(shù)量的增多可以作為判斷侵襲性、進(jìn)展的一個(gè)潛在重要指標(biāo)。

有關(guān)外周血中PD-1在淋巴細(xì)胞中的分布及臨床意義尚無(wú)定論。Waki等[19]認(rèn)為晚期或復(fù)發(fā)的NSCLC接種合成肽疫苗前后患者外周血中CD4+PD-1+細(xì)胞的含量均與總生存相關(guān)，而CD8+PD-1+細(xì)胞在接種疫苗后含量下降與預(yù)后總生存延長(zhǎng)有關(guān)。Kamphorst等[20]發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗PD-1治療后70%的患者Ki-67+PD-1+CD8 T數(shù)量升高，該應(yīng)答是腫瘤特異性的，增殖的CD8+T細(xì)胞共表達(dá)高水平的PD-1和CTLA-4。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SCLC患者CD4和CD8細(xì)胞均表達(dá)PD-1，但只有CD8細(xì)胞中的PD-1水平比健康人低，而CD4細(xì)胞中的PD-1水平在兩組之間無(wú)顯著差異，我們認(rèn)為SCLC外周血中CD8+PD-1+細(xì)胞水平對(duì)于預(yù)測(cè)PD-1免疫靶向治療可能具有臨床價(jià)值，該研究與Malaspina等[21]在口腔鱗狀細(xì)胞癌外周血中的發(fā)現(xiàn)不一致，她們認(rèn)為PD-1+CD4+表達(dá)無(wú)差異，而CD8+PD-1+細(xì)胞比健康對(duì)照組高表達(dá)。

圖 1 CTLA-4在外周血淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+上的分布。A：健康對(duì)照組；B：SCLC組。Fig 1 Distribution of CTLA-4 in CD4+CD25+ T cells in peripheral blood specimens. A: Healthy control group; B: SCLC group.

圖 2 PD-1在CD8+ T細(xì)胞中的分布情況。A：健康對(duì)照組；B：SCLC組。Fig 2 Distribution of PD-1 in CD8+ T cells in peripheral blood. A:Healthy group；B: SCLC patients.

圖 3 PD-L1在SCLC外周血和H446細(xì)胞中的表達(dá)及分布。A：左圖，外周血單個(gè)核細(xì)胞群（R1門(mén)）；右圖，R1門(mén)中PD-L1水平；B：左圖，CD3+ T細(xì)胞群（R2門(mén)）；右圖，R2門(mén)中PD-L1水平；C：PD-L1在H446表達(dá)（FACS法）；D：PD-L1在H446細(xì)胞中表達(dá)（ICC法）。PC-3細(xì)胞為陰性對(duì)照。FACS：流式細(xì)胞術(shù)；ICC：免疫細(xì)胞化學(xué)法。Fig 3 Distribution and expression of PD-L1 in peripheral blood of SCLC patients and H446 cells. A: Left, mononuclear cells in peripheral blood (Gate R1); Right, Level of PD-L1 in Gate R1; B: Left, CD3+ T cells(Gate R2); Right, PD-L1 in Gate R2; C: The expression of PD-L1 in H446 cells (FACS); D: PD-L1 expression in H446 cells (ICC) with PC-3 cell as negative control. FACS: flow cytometry; ICC: immunocytochemical method.

本項(xiàng)目還對(duì)比了SCLC患者化療前后CD4+CD25+CTLA-4+和CD8+PD-1+水平的變化，用以觀察治療療效與免疫關(guān)卡點(diǎn)蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示化療后SCLC CD4+CD25+CTLA-4+細(xì)胞和CD8+PD-1+細(xì)胞水平相比治療前下降，說(shuō)明該水平可能與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，該結(jié)論與Wang等[22]的研究結(jié)果一致。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)放療和免疫調(diào)節(jié)治療后癌癥患者外周血中PD-1的mRNA水平明顯升高，聯(lián)合分析外周血中PD-1、CTLA-4和其他免疫分子可以為抗PD-1或抗PD-L1治療提供線索。

文獻(xiàn)報(bào)道PD-L1高表達(dá)于SCLC腫瘤組織，我們?cè)赟CLC腫瘤組織（免疫組化法）和SCLC細(xì)胞系H446（細(xì)胞免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)）中均檢測(cè)到高水平的PD-L1表達(dá)。我們采用Cellsearch法在循環(huán)腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到PD-L1表達(dá)（數(shù)據(jù)未列），但采用流式細(xì)胞術(shù)未發(fā)現(xiàn)外周血中有PD-L1的表達(dá)。這可能是由于外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目稀少，需要采用比流式細(xì)胞術(shù)更敏感的方法進(jìn)行檢測(cè)，或先需要富集陽(yáng)性細(xì)胞再進(jìn)行檢測(cè)。有關(guān)PD-L1在外周血中的表達(dá)研究報(bào)道較少，但Kronig等[23]發(fā)現(xiàn)III期和IV期黑色素瘤患者外周血Melan-A+CD8+PD1+T細(xì)胞與預(yù)后總生存無(wú)關(guān)，但Melan-A+CD8+PD-L1+的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)。

本研究具有一定的局限性，我們僅檢測(cè)了外周血標(biāo)本中免疫關(guān)卡點(diǎn)蛋白的表達(dá)，未檢測(cè)相應(yīng)的配對(duì)組織標(biāo)本；患者主要采用化療，治療方法單一；本研究為非干預(yù)性，臨床觀察研究，影響因素較多，后續(xù)還需要更多隨機(jī)對(duì)照研究進(jìn)一步證實(shí)和驗(yàn)證本研究的結(jié)論和發(fā)現(xiàn)。