乳源酪蛋白糖巨肽對(duì)NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的調(diào)控作用

王 泳，龔建苗，賈 彥，趙 培，龐廣昌，閻亞麗*，陳慶森*

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

乳源酪蛋白糖巨肽對(duì)NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的調(diào)控作用

王 泳，龔建苗，賈 彥，趙 培，龐廣昌，閻亞麗*，陳慶森*

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

以結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29為細(xì)胞系，在確定乳源性酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）對(duì)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）亞單位p65蛋白影響的基礎(chǔ)上，在最適作用時(shí)間條件下，利用Western blotting技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)乳源CGMP對(duì)NF-κB信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白IκBα、p-IκBα、E3RSIκB、UBC5表達(dá)水平的影響，以闡述乳源CGMP調(diào)控NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的作用機(jī)制。結(jié)果表明：乳源CGMP組的3 種質(zhì)量濃度（0.001、0.010、0.100 μg/mL）均可在一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路上IκBα蛋白的降解，0.100 μg/mL作用較為明顯，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。研究明確地證實(shí)了乳源CGMP可通過抑制p-IκBα、E3RSIκB、UBC5蛋白的表達(dá)來抑制IκBα蛋白的降解，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路的激 活。結(jié)論：乳源CGMP可顯著降低NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白IκBα的降解，其機(jī)制是抑制了IκBα的磷酸化和泛素化，使p-IκBα和泛素化關(guān)鍵蛋白E3RSIκB和UBC5的表達(dá)均有所下降，進(jìn)而減少了IκBα的降解，增加了IκBα-p65-p 50蛋白三聚體的數(shù)量，使p65蛋白核移位效應(yīng)降低，進(jìn)而減少下游基因的表達(dá)。因此，研究結(jié)果科學(xué)地闡釋了乳源CGMP是通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎的作用。

酪蛋白糖巨肽；結(jié)腸癌細(xì)胞；核因子-κB；磷酸化核因子-κB抑制因子α；泛素-蛋白連接酶亞單位

王泳, 龔建苗, 賈彥, 等. 乳源酪蛋白糖巨肽對(duì)NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的調(diào)控作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 26-31. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717005. http://www.spkx.net.cn

WANG Yong, GONG Jianmiao, JIA Yan, et al. Regulatory effect of milk-derived casein glycomacropeptide on key enzymes involved in NF-κB signaling pathway[J]. Food Science, 2017, 38(17): 26-31. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717005. http://www.spkx.net.cn

Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子（janus kinasesignal transduction and transcription activator，JAK-STAT）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）是細(xì)胞內(nèi)3 條重要信號(hào)通路，對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義[1-2]。其中NF-κB廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，是與炎癥反應(yīng)、免疫、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)以及胚胎發(fā)育等相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的樞紐，是一種密切聯(lián)系這些信號(hào)途徑的重要核轉(zhuǎn)錄因子[3-4]。

NF-κB/Rel蛋白屬于Rel蛋白家族，以一定的方式兩兩結(jié)合成同源二聚體或異源二聚體[3,5-6]。據(jù)研究證明，所有的NF-κB復(fù)合物均與抑制因子IκB結(jié)合，在激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]和在終止NF-κB信號(hào)中起著非常重要的作用[8]。在經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路中，IKK是由IKKα、IKKβ和IKKγ組成的三亞基蛋白復(fù)合物，其中IKKγ是IKK復(fù)合物最后一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)亞基 （也被稱作NEMO，NF-κB essential modulator）；有研究指出，NEMO（48 kD）的結(jié)構(gòu)含有一定的螺旋結(jié)構(gòu)，C-末端也具有LZ，但NEMO序列的前50 個(gè)氨基酸殘基和后50 個(gè)氨基酸殘基并無二級(jí)結(jié)構(gòu)。IKKα和IKKβ首先借助于分子中的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域形成二聚體，再分別通過C-末端一段短的結(jié)構(gòu)域與NEMO結(jié)合形成穩(wěn)定的三聚體[9-10]。研究顯示，NF-κB通過促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄而廣泛參與調(diào)控細(xì)胞凋亡[11-12]、細(xì)胞黏附[13]、細(xì)胞增殖、天然以及適應(yīng)性免疫應(yīng)答、炎癥[3,14-15]、胞內(nèi)脅迫應(yīng)答和組織重塑等過程。在諸如炎癥、腫瘤[16]、眼部疾病、神經(jīng)損傷[17-18]、糖尿病[19]等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

乳源性酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）源于牛乳中酪蛋白，是奶酪加工過程中釋放的一種由64 個(gè)氨基酸殘基組成的肽，該肽一半以上被糖基化修飾，故稱為“酪蛋白糖巨肽”[4,20-25]。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過多年的研究，揭示了乳源CGMP是一種重要的乳源生物活性肽，并圍繞該肽開展了較為系統(tǒng)的研究工作取得了一些成果[26-31]。但乳源CGMP明確的調(diào)控NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究采用結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29為細(xì)胞系，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激干預(yù)，利用Western blotting測(cè)定乳源CGMP對(duì)腸上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響，確定相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，以探討并闡述乳源CGMP調(diào)控NF-κB的分子機(jī)制，為確定乳源CGMP的抗炎分子機(jī)制以及維護(hù)相關(guān)腸黏膜內(nèi)環(huán)境生物學(xué)活性功能提供科學(xué)依據(jù)，為乳源CGMP作為功能性食品用于炎癥性腸病的生物免疫治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CGMP成品 新西蘭Tatua公司；人類結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞 江蘇齊氏生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置顯微鏡 日本 Nikon 公司；CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；多功能讀板機(jī) 美國(guó)Molecular Devices公司；迷你雙垂直電泳槽、迷你轉(zhuǎn)印電泳槽、電泳儀 北京六一儀器廠；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分組及總蛋白質(zhì)提取

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[4]方法。

用無血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)6 h后，將細(xì)胞分為5 組：空白對(duì)照組（N組）、LPS組（1 μg/mL，L組）、LPS（1 μg/mL）和乳源CGMP組（設(shè)計(jì)低（0.001 μg/mL，C1）、中（0.010 μg/mL，C2）、高（0.100 μg/mL，C3）3 個(gè)劑量）。各組處理參考文獻(xiàn)[3]方法及CGMP、LPS作用細(xì)胞的方法。按照107個(gè)細(xì)胞加入1 mL細(xì)胞總蛋白抽提試劑（含有蛋白酶、磷酸酶抑制劑），置于4 ℃搖床中速振蕩10 min，4 ℃條件下14 000 r/min離心15 min，收集上清液。并利用BCA方法定量測(cè)定總蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 Western blotting分析

乳源CGMP對(duì)LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白IκBα、p-IκBα、E3RSIκB和UBC5的Western blotting分析方法為：1）制備凝膠UBC5用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%聚丙烯酰胺分離膠；2）濕法轉(zhuǎn)膜：UBC5用迷你濕式轉(zhuǎn)印電泳槽200 mA恒流轉(zhuǎn)移1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜；3）封閉：取下聚偏二氟乙烯膜，切掉右下角作標(biāo)記后p-IκBα置于2%牛血清白蛋白中，室溫條件下?lián)u床封閉1 h，主要封閉膜上的非特異結(jié)合部位。其他蛋白操作參考文獻(xiàn)[3]方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均做平行實(shí)驗(yàn)，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，處理結(jié)果以±s表示，定義P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳源CGMP對(duì)LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞IκBα蛋白及其磷酸化的影響

IκBα分子中均含有6 個(gè)錨蛋白（ankyrin）的重復(fù)序列，而這些重疊螺旋結(jié)構(gòu)與p65分子中的RHR（rel homology region，RHR）區(qū)域結(jié)合，與p65的核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）結(jié)合，使p65鈍化而滯留在胞質(zhì)中。Arenzana-Seisdedos等[8]的研究證實(shí)了IκBα在終止p65活性的過程，確定了該活化的關(guān)鍵步驟是分子IκBα的磷酸化及降解。因此本研究選擇IκBα作為其中靶點(diǎn)之一，對(duì)其磷酸化前后蛋白含量變化進(jìn)行觀測(cè)。

采用LPS激活打通結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的NF-κB信號(hào)通路后，接著給予乳源CGMP對(duì)LPS激活的HT-29細(xì)胞進(jìn)行研究，探討對(duì)IκBα、p-IκBα蛋白的影響。較適劑量乳源CGMP作用48 h后，IκBα、p-IκBα蛋白的表達(dá)量見圖1、2。

圖 1 乳源CGMP作用下IκBα蛋白的表達(dá)量變化Fig. 1 Effect of CGMP on the expression of IκBα

由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，LPS組IκBα蛋白含量極顯著降低（P＜0.01），降解極為明顯，LPS和乳源CGMP組IκBα蛋白表達(dá)先增加后降低，其中1 μg/mL LPS＋ 0.010 μg/mL乳源CGMP抑制HT-29細(xì)胞IκBα蛋白的降解極為顯著（P＜0.01），0.001、0.100 μg/mL乳源CGMP較0.010 μg/mL乳源CGMP抑制效果降低，但也極顯著抑制了IκBα蛋白的降解（P＜0.01）；與LPS組相比，1 μg/mL LPS分別與0.001、0.010、0.100 μg/mL乳源CGMP結(jié)合均極顯著增加了LPS刺激下IκBα蛋白的表達(dá)（P＜0.01），其表達(dá)量極顯著高于空白對(duì)照組。

圖 2 乳源CGMP作用下p-IκBα蛋白的表達(dá)量變化Fig. 2 Effect of CGMP on the expression of p-IκBα

由圖2可知，與空白對(duì)照組相比，LPS組p-IκBα蛋白含量極顯著增加（P＜0.01），1 μg/mL LPS＋0.100 μg/mL乳源CGMP抑制HT-29細(xì)胞p-IκBα蛋白的表達(dá)極為顯著（P＜0.01），較0.001、0.010 μg/mL乳源CGMP抑制效果好，但0.001、0.010 μg/mL乳源CGMP也極顯著抑制了p-IκBα蛋白的表達(dá)（P＜0.01）；與LPS組相比，0.001、0.010、0.100 μg/mL乳源CGMP均極顯著抑制了LPS刺激下p-IκBα蛋白的表達(dá)（P＜0.01），其表達(dá)量極顯著低于空白對(duì)照組。

2.2 乳源CGMP對(duì)LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞IκBα降解泛素蛋白E3RSIκB和UBC5的影響

目前，研究揭示了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitinproteasome pathway，UPP）[32-33]主要作用于細(xì)胞內(nèi)一些半衰期短、結(jié)構(gòu)異常、錯(cuò)構(gòu)或受損傷的蛋白，所以在調(diào)節(jié)信號(hào)通路中蛋白質(zhì)降解與功能的作用越來越受到關(guān)注。因此，研究該通路途徑中泛素蛋白與乳源CGMP相互作用及其含量變化具有重要的意義，即泛素蛋白體系中相關(guān)蛋白表達(dá)水平成為人們研究NF-κB途徑的另一重要靶點(diǎn)。

采用LPS激活打通結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的NF-κB信號(hào)通路后，接著給予乳源CGMP對(duì)LPS激活的HT-29細(xì)胞進(jìn)行研究，探討對(duì)E3RSIκB、UBC5蛋白的影響。較適劑量乳源CGMP作用48 h條件下，E3RSIκB和UBC5蛋白的表達(dá)量見圖3、4。

圖 3 乳源CGMP作用下E3RSIκB蛋白的表達(dá)量變化Fig. 3 Effect of CGMP on the expression of E3RSIκB

由圖3可知，與空白對(duì)照組相比，LPS組E3RSIκB蛋白表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），LPS和乳源CGMP組E3RSIκB蛋白的表達(dá)量逐漸降低，且呈劑量依賴性，以1 μg/mL LPS＋0.100 μg/mL乳源CGMP抑制E3RSIκB蛋白的表達(dá)最為顯著（P＜0.01），C1抑制效果較低，仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），C2抑制效果也不明顯（P＞0.05）；與LPS組相比，C1、C2和C3顯著抑制了LPS刺激下E3RSIκB蛋白的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），其中0.010、0.100 μg/mL乳源CGMP抑制效果較好（P＜0.01）。

圖 4 乳源CGMP作用下UBC5蛋白的表達(dá)量變化Fig. 4 Effect of CGMP on the expression of UBC5

由圖4可知，與空白對(duì)照組相比，LPS組UBC5蛋白表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），LPS和乳源CGMP組UBC5蛋白的表達(dá)量逐漸增加，且呈劑量依賴性，以0.001 μg/mL乳源CGMP抑制效果最為顯著（P＜0.01），0.010、0.100 μg/mL乳源CGMP抑制效果不具顯著性（P＞0.05）；與LPS組相比，C1、C2和C3極顯著抑制了LPS刺激下UBC5蛋白的表達(dá)（P＜0.01），其表達(dá)量極顯著低于LPS組。

3 討 論

當(dāng)今，現(xiàn)代代謝綜合征的發(fā)展和蔓延，已成為嚴(yán)重的社會(huì)問題，越來越引起社會(huì)特別是科技界的重視，使人們談糖色變、談脂色變，而生物活性肽具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收；已有眾多的研究報(bào)道公布，由營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)釋放的生物活性肽可表現(xiàn)出多種生物學(xué)活性，如緩解和治療慢性炎癥、調(diào)節(jié)脂代謝、抵抗和排斥有害菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用；且食用安全性極高，重要的是在微量的狀態(tài)下就能發(fā)揮強(qiáng)大的生理活性，因此，是目前國(guó)際食品界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子，從食源性的生物活性物質(zhì)研究的角度，解決在相關(guān)疾病的預(yù)防及治療取得功效更是一條可行的途徑，乳源CGMP就是其中一個(gè)[34]。近期的研究已經(jīng)揭示，生物活性肽發(fā)揮生理作用主要是通過和腸道內(nèi)復(fù)雜的受體系統(tǒng)、微生物系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)相互作用，通過改變自己的信號(hào)系統(tǒng)對(duì)機(jī)體發(fā)揮各種生理功能[35]。廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路途徑能迅速對(duì)外界刺激產(chǎn)生反應(yīng)，參與細(xì)胞凋亡、炎癥等生理?xiàng)l件下的基因調(diào)控而受到了越來越多的重視。此外，無論是非特異性免疫還是特異性免疫的應(yīng)答均是通過各種各樣的信號(hào)傳遞實(shí)現(xiàn)的，因此，要研究乳源CGMP調(diào)控免疫發(fā)揮生理作用的機(jī)制，其干預(yù)免疫信號(hào)通路的研究是必不可少的。

科學(xué)研究表明NF-κB已成為疾病治療中的一個(gè)重要靶點(diǎn)，其激活依靠通路上的關(guān)鍵蛋白，倘若抑制某些必不可少的蛋白的活性，也會(huì)間接地抑制NF-κB的激活。因此，越來越多的研究選取NF-κB經(jīng)典通路中必不可少的蛋白IκBα，對(duì)其磷酸化、泛素化相關(guān)蛋白進(jìn)行測(cè)定。Rahman[36]發(fā)現(xiàn)具生物活性的谷胱甘肽可通過抑制IκB磷酸化而減少NF-κB活化，進(jìn)而抑制相關(guān)細(xì)胞因子如TNF-α、細(xì)胞間黏附分子等的合成，而達(dá)到減少對(duì)細(xì)胞蛋白作用，緩解細(xì)胞炎癥狀態(tài)，或減少細(xì)胞凋亡。Fraternal等[37]的研究表明GSH-C4（巰基進(jìn)行修飾）略微減少了p-IκBα和p65的表達(dá)。Gao等[38]用免疫共沉淀技術(shù)研究證實(shí)抗菌肽PR39（antibacterial peptide PR39）能可逆地結(jié)合到26S蛋白酶體的α7亞基上而抑制IκBα的降解，并沒有抑制IκBα的磷酸化和泛素化，且通過Western bloting技術(shù)證實(shí)這一結(jié)論。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29為細(xì)胞系，30 min的LPS刺激可以使IκBα的含量急劇下降，而乳源CGMP各組細(xì)胞IκBα含量均增加，且隨著乳源CGMP質(zhì)量濃度的升高先升高后降低，但均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），以0.010 μg/mL作用效果最好，那么乳源CGMP阻止細(xì)胞IκBα的含量下降是通過刺激IκBα蛋白表達(dá)增加來實(shí)現(xiàn)的，亦或是通過抑制其磷酸化泛素化實(shí)現(xiàn)。p-IκBα蛋白表達(dá)的結(jié)果表明，LPS極顯著增加了p-IκBα蛋白的表達(dá)（P＜0.01），而乳源CGMP的3 個(gè)質(zhì)量濃度組均極顯著地抑制LPS刺激后的HT-29細(xì)胞p-IκBα蛋白的表達(dá)（P＜0.01），作用效果明顯，不僅極顯著低于LPS組（P＜0.01），更使p-IκBα蛋白的表達(dá)極顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），且以0.100 μg/mL的CGMP作用效果最好。因此，在某種程度上講，乳源CGMP減少了IκBα磷酸化也就是減少IκBα的降解，而是否促進(jìn)IκBα的表達(dá)，還有待從基因表達(dá)水平上進(jìn)行研究。

大量研究已證實(shí)，UPP在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，并且UPP對(duì)NF-κB通路的調(diào)控是在多個(gè)不同水平上進(jìn)行的[33-34,39]，也對(duì)各種疾?。ㄈ缪装Y）的發(fā)生發(fā)展調(diào)控表現(xiàn)出該途徑的重要地位。因此，本研究中，為了證實(shí)乳源CGMP減少IκBα磷酸化而抑制IκBα的降解，這種抑制IκBα降解的作用是單純IκBα磷酸化減少的結(jié)果，還是也抑制了后續(xù)的泛素化？本研究測(cè)定了IκBα泛素化關(guān)鍵蛋白E3RSIκB和UBC5的表達(dá)。E3RSIκB分子中的WD40重復(fù)區(qū)域，是其與IκBα的結(jié)合位點(diǎn)，而E3RSIκB分子中的F-box負(fù)責(zé)誘導(dǎo)IκBα的泛素化[40]。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激的HT-29細(xì)胞中E3RSIκB蛋白與空白對(duì)照組相比表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），乳源CGMP降低了LPS刺激后E3RSIκB蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴關(guān)系，隨乳源CGMP劑量增加，抑制強(qiáng)度逐漸增大，以0.100 μg/mL的乳源CGMP作用效果最好（P＜0.01），0.001 μg/mL的乳源CGMP雖然顯著降低了LPS刺激后E3RSIκB蛋白的表達(dá)，但仍顯著高于空白對(duì)照組，0.010 μg/mL乳源CGMP極顯著降低了LPS刺激后E3RSIκB蛋白的表達(dá)，但與空白對(duì)照組相比，不具有顯著性。在UBC5蛋白的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，LPS組UBC5蛋白與空白對(duì)照組相比表達(dá)量增加非常明顯，有極顯著差異（P＜0.01），乳源CGMP同樣降低了LPS刺激后UBC5蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴關(guān)系，隨乳源CGMP劑量增加，抑制強(qiáng)度逐漸降低，以0.001 μg/mL的乳源CGMP作用效果最好，0.100、0.010 μg/mL的乳源CGMP雖然極顯著降低了LPS刺激后UBC5蛋白的表達(dá)，但與空白對(duì)照組相比，不具有顯著性。這些結(jié)果說明乳源CGMP可以通過UPP中關(guān)鍵酶的作用，抑制IκBα降解調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，以發(fā)揮抗炎活性。

4 結(jié) 論

本研究指出，乳源CGMP具有顯著調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，改善炎癥性腸病引發(fā)的結(jié)直腸癌的作用，其機(jī)制是通過顯著降低NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白IκBα的降解，抑制了IκBα的磷酸化和泛素化，使p-IκBα和泛素化關(guān)鍵蛋白E3RSIκB和UBC5的表達(dá)均有所下降，進(jìn)而減少了IκBα的降解，增加了IκBα-p65-p50蛋白三聚體的數(shù)量，使p65蛋白核移位效應(yīng)降低，進(jìn)而減少下游基因的表達(dá)。研究結(jié)果較明確地闡釋了乳源CGMP是通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路以發(fā)揮抗炎活性的。

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Regulatory Effect of Milk-Derived Casein Glycomacropeptide on Key Enzymes Involved in NF-κB Signaling Pathway

WANG Yong, GONG Jianmiao, JIA Yan, ZHAO Pei, PANG Guangchang, YAN Yali*, CHEN Qingsen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin Un iversity of Commerce, Tianjin 300134, China)

This study was undertaken to determine the effect of casein glycomacropeptide (CGMP) on the p65 subunit of nuclear factor-κB (NF-κB) of HT-29 human colon cancer cells challenged with lipopolysaccharide (LPS). Furthermore, Western blotting technology was used to detect and compared the expression levels of the key proteins involved in the NF-κB signaling pathway such as IκBα, p-IκBα, E3RSIκB and UBC5 in the control group, milk-derived CGMP group and LPS group to uncover the molecular mechanism of CGMP in regulating the NF-κB signaling pathway. The results showed that all three doses of CGMP (0.001, 0.010 and 0.100 μg/mL) could suppress the degradation of IκBα in some degree, which is involved in the NF-κB signaling pathway of HT-29 cells challenged with LPS and this effect was more significant at the dose of 0.100 μg/mL, which was significantly different when compared with the control group (P ＜ 0.01). Therefore, it was confi rmed that CGMP could suppress the degradation of IκBα by repressing the expression of p-IκBα, E3RSIκB and UBC5, thereby inhibiting the activation of the NF-κB signaling pathway. As a result, CGMP can signifi cantly reduce the degradation of IκBα in the NF-κB signal pathway, increase the amount of protein trimer-IκBα-p65-p50 and decrease nuclear translocation of p65 and downstream gene expression by inhibiting the phosphorylation and ubiquitination of IκBα and reducing the expression of p-IκBα and key ubiquitin proteins (E3RSIκB and UBC5). This study illustrates that milk-derived CGMP plays an anti-infi ammatory role by regulating the NF-κB signal pathway.

casein glycomacropeptide; colon cancer cells (HT-29); nuclear factor-κB; IκBα; ubiquitin-protein ligase subunit

10.7506/spkx1002-6630-201717005

R151

A

1002-6630（2017）17-0026-06引文格式：

2016-09-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31071522）

王泳（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵生物技術(shù)、功能成分與腸道健康的關(guān)系。E-mail：15620616749@163.com *通信作者：閻亞麗（1962—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵生物技術(shù)、微生物學(xué)。E-mail：yyali@tjcu.edu.cn陳慶森（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵生物技術(shù)、功能成分與腸道健康的關(guān)系。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn