錢(qián) 瑋，朱艷霞，邱業(yè)先

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州215009）

環(huán)境因子對(duì)太湖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

錢(qián) 瑋，朱艷霞，邱業(yè)先*

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州215009）

以太湖底泥為研究對(duì)象，測(cè)定樣品中的總氮（TN）、總磷（TP）、總有機(jī)碳（TOC），采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）研究底泥細(xì)菌多樣性。此外，還采用冗余分析（RDA）的方法研究了底泥中一些環(huán)境因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：TN、TP、TOC變化能解釋大部分細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異（54.27%），其中TN對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大，其次是TP，再次是TOC。該研究對(duì)太湖地區(qū)微生物資源的調(diào)查及環(huán)境監(jiān)測(cè)具有重要意義。

太湖底泥；變性梯度凝膠電泳；冗余分析

太湖是中國(guó)第二大淡水湖，位于長(zhǎng)江三角洲地區(qū)腹地，總面積2 425 km2，平均水深2.1 m，貯水量44.4億m3。太湖流域是我國(guó)經(jīng)濟(jì)最發(fā)達(dá)、最具活力的地區(qū)之一。然而，隨著流域內(nèi)工業(yè)化、城市化進(jìn)程的加快和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，大量未處理達(dá)標(biāo)的工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活污水排入，太湖水質(zhì)不斷惡化，富營(yíng)養(yǎng)化程度加劇。2000年太湖水質(zhì)平均為Ⅳ類(lèi)，其中1/3湖區(qū)為Ⅴ類(lèi)或劣Ⅴ類(lèi)水體，約70%的水體處于富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)[1]。底泥是湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其中棲息著大量的能為水體自?xún)籼峁?qū)動(dòng)力的微生物，它們是底泥生物活性的源泉。微生物可以通過(guò)同化、異化等生化活動(dòng)以及改變環(huán)境條件來(lái)影響底泥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分布、轉(zhuǎn)化，而水質(zhì)變化如污染和富營(yíng)養(yǎng)化反過(guò)來(lái)也會(huì)引起底泥中微生物群落的改變。底泥微生物群落變化的研究有助于從側(cè)面了解上覆水水質(zhì)、推測(cè)其污染及演化歷史；底泥中微生物物種、基因等資源的鑒定和獲得有助于豐富當(dāng)前對(duì)微生物資源的認(rèn)識(shí)。因此，湖泊底泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)及作用成為新興的研究熱點(diǎn)之一[2]。

20世紀(jì)90年代以來(lái)，微生物生態(tài)學(xué)已經(jīng)從宏觀水平發(fā)展到微觀和分子水平，很多新興的分子生物學(xué)技術(shù)如分子雜交、克隆文庫(kù)、熒光原位雜交、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳（DGGE）等技術(shù)都被應(yīng)用在基因水平上估計(jì)微生物物種的個(gè)體豐度、均度，尋找物種的變異情況以及探尋群落中微生物間的相互關(guān)系，從而更加客觀地認(rèn)識(shí)環(huán)境中微生物真實(shí)的生態(tài)狀況。DGGE相比其他技術(shù)具有快速（少于一天）、全面（能檢測(cè)豐度大于1%的微生物）等優(yōu)勢(shì)，能夠比較真實(shí)反映環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)，非常適用于湖泊底泥微生物群落多樣性分析研究[3]。筆者以典型的富營(yíng)養(yǎng)化湖泊——太湖中不同區(qū)域底泥作為研究對(duì)象，首先，分析底泥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分布特征；然后，采用宏基因組學(xué)策略和PCR、DGGE、克隆測(cè)序等分子生態(tài)學(xué)方法，對(duì)太湖底泥中的微生物多樣性進(jìn)行研究，比較分析不同采樣點(diǎn)微生物群落結(jié)構(gòu)特征和差異。筆者旨在探究太湖底泥微生物的群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)也為以微生物為基礎(chǔ)的環(huán)境生態(tài)監(jiān)測(cè)方法的建立提供理論依據(jù)[4]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

底泥樣品于2012年5月29日在西太湖的梅梁湖和竺山湖區(qū)域采集，共設(shè)有5個(gè)采樣點(diǎn)，分別如圖1所示。1號(hào)點(diǎn)位于梅梁湖湖心；2號(hào)點(diǎn)位于分水口，主要污染源是上游分水、漕橋等處的農(nóng)村面源污染；3號(hào)點(diǎn)位于浯溪口，主要污染源是浯溪、殷村港等處的工業(yè)廢水排放；4號(hào)點(diǎn)大平場(chǎng)位于連接竺山湖和梅梁湖的馬山水道西側(cè)；5號(hào)點(diǎn)位于梅梁湖灣。用沉積物柱狀采樣器采集約50 cm的柱狀泥樣，每個(gè)采樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取上層10 cm混勻后分成2份，置于冷藏箱中帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存，1份用于測(cè)定理化指標(biāo)，1份用于微生物多樣性分析[5]。

圖1 采樣點(diǎn)分布示意圖

1.1.2 試劑

PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR引物、溶菌酶、水飽和酚等均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；氯仿、異戊醇、異丙醇、乙酸鈉等購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器

高速冷凍離心機(jī)（GL-20G-Ⅱ，上海安亭），小型臺(tái)式高速離心機(jī)（5417R，德國(guó)Eppendorf），凝膠成像分析儀（Universal Hood II，美國(guó) Bio－Rad），PCR 擴(kuò)增儀（5332，德國(guó) Eppendorf），恒溫水浴鍋（HH·S21-4-S，上海精宏），高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50SII，上海博訊），DCode 突變檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 底泥理化性質(zhì)測(cè)定

底泥樣品的理化性質(zhì)參照《土壤農(nóng)化分析》，含水率采用烘干恒重法測(cè)量，總有機(jī)質(zhì)含量采用灼燒法測(cè)量，總氮采用半微量凱氏定氮法測(cè)量，總磷采用HClO4-H2SO4消解鉬銻抗比色法測(cè)定[6]。

1.2.2 底泥DNA提取

底泥總DNA提取參照朱艷霞等[7]的方法，略有改動(dòng)。稱(chēng)取3 g底泥樣品于10 mL離心管中，加入6 mL DNA提取液，渦旋混勻5 min。加入溶菌酶至終濃度為2 mg·mL-1，搖床上37℃，225 r·min-1振蕩1 h。加入0.1倍體積20%SDS，混勻后65℃水浴2 h，期間每15 min輕輕顛倒混勻。室溫8 000 r·min-1離心10 min收集上清，上清中加0.5倍體積的40%PEG-8000混勻，4℃沉淀過(guò)夜。4℃ 12 000 r·min-1離心20 min，收集沉淀。 沉淀用 600 μL TE 溶解，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1），4 ℃ 12 000 r·min-1離心 10 min 收集上清。 加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），4℃ 12 000 r·min-1離心15 min，收集上清。 加入0.1倍體積的5 mol·L-1的乙酸鈉和0.6倍體積-20℃預(yù)冷的異丙醇室溫沉淀4 h，4℃ 12 000 r·min-1離心15 min棄上清。沉淀用-20℃預(yù)冷的70%乙醇2次洗滌，沉淀晾干后加200 μL TE緩沖液溶解，收集于1.5 mL離心管中。

1.2.3PCR-DGGE

PCR引物為

GC-341F（5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）下劃線為 GC 夾子，518R （5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）[8]。PCR 反應(yīng)為 20 μL 體系，10 μL 2×premix，上下游引物各1μL，1μL模板DNA，7 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性3 min，94℃變性 1 min，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

DGGE 使用 DCode突變檢測(cè)系統(tǒng)，參考 Zhou等[9]的方法，使用 8%聚丙烯酰胺（Acr∶Bis=37.5∶1），變形梯度范圍為40%～60%，電泳條件為80 V，12 h。然后銀染，掃描成像。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

DGGE圖譜分析采用Quantity One 4.62軟件，經(jīng)過(guò)去除背景、泳道識(shí)別、條帶識(shí)別和配對(duì)得到數(shù)字化的圖譜，分別計(jì)算樣本的物種豐富度（S），香農(nóng)多樣性指數(shù)（H）和Pielou均勻度指數(shù)（J），然后計(jì)算不同泳道的Dice相似性系數(shù)，用非加權(quán)組平均法（Unweighted Pair Grouping Method with Arithmetical Averages，UPGMA）進(jìn)行了聚類(lèi)分析（Cluster analysis）并構(gòu)建聚類(lèi)圖。理化因子等數(shù)據(jù)分析采用SPSS15.0軟件，樣本均值的顯著性分析采用單因素方差分析（ANOVA），并進(jìn)行Tukey驗(yàn)后檢驗(yàn)。冗余分析（RDA）采用R語(yǔ)言3.2 vegan軟件包[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 底泥理化性質(zhì)

底泥的理化性質(zhì)見(jiàn)表1，5個(gè)采樣點(diǎn)底泥中總氮含量沒(méi)有顯著差異，而含水率、有機(jī)質(zhì)、總磷含量則有顯著差異。 從有機(jī)質(zhì)含量來(lái)看，分水口（2號(hào)）底泥中含量最高（P＜0.01），為（5.76±0.08）%，梅梁湖灣（5 號(hào)）底泥中有機(jī)質(zhì)最少。就總磷含量來(lái)看，分水口（2號(hào)）和浯溪口（3號(hào)）底泥中含量最高，梅梁湖心（1號(hào)）和大平場(chǎng)（4號(hào)）底泥含量次之，梅梁湖灣（5號(hào)）底泥含量最低（P＜0.01）。

表1 底泥理化性質(zhì)分析

2.2 DGGE圖譜分析

底泥樣品總DNA經(jīng)PCR-DGGE后得到的指紋圖譜如圖2所示，5個(gè)采樣點(diǎn)間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有比較大的差異，采用Quantity One軟件對(duì)圖譜進(jìn)行數(shù)字化識(shí)別，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖3），發(fā)現(xiàn)梅梁湖心（1號(hào)）與其他樣品的差異比較大，單獨(dú)聚成一支，分水口（2號(hào)）、浯溪口（3號(hào)）底泥中細(xì)菌組成比較相近，而大平場(chǎng)（4號(hào)）與梅梁湖灣（5號(hào)）相似度較高。

根據(jù)公式計(jì)算出各個(gè)樣品的基因型豐富度（Genotypic Richness，S）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener diversity index，H）和 Pielou 均勻度指數(shù)（Pielou evenness index，J）（見(jiàn)表 2），結(jié)果顯示5 號(hào)樣品具有最高的豐富度（34）、多樣性（3.44）和均勻度（0.98），而浯溪口（3號(hào)）各項(xiàng)指標(biāo)均為最低。

2.3 理化因子與群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

圖2 底泥DNA細(xì)菌V3區(qū)DGGE圖譜

根據(jù)DGGE圖譜得到的條帶組成矩陣 （共57個(gè)條帶），選取5個(gè)樣品中平均豐度前20的條帶，以及與條帶組成相關(guān)性較高的3個(gè)環(huán)境變量（總磷、總氮、總有機(jī)質(zhì)），各組變量經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后應(yīng)用軟件包對(duì)條帶組成和環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析(RDA）（圖4）。總體來(lái)看，第一軸（RDA1）能解釋底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的32.80%，第二軸（RDA2）能解釋21.47%的差異，總體能解釋樣本間差異的54.27%。總氮和總有機(jī)質(zhì)與第一軸的夾角較小，說(shuō)明這2個(gè)變量是各個(gè)樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在第一軸上的排布的主要影響因素?？偭缀康牟煌堑诙S差異的主要因素。環(huán)境因子中總氮的箭頭最長(zhǎng)，說(shuō)明總氮對(duì)各樣本細(xì)菌組成的影響最大，其次是總磷，然后是總有機(jī)質(zhì)[11]。

根據(jù)采樣點(diǎn)在RDA排序圖的中分布來(lái)看，分水口（2號(hào)）和浯溪口（3號(hào)）細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較接近，這與聚類(lèi)分析結(jié)果一致，而且在環(huán)境變量箭頭上的排序靠前，說(shuō)明高負(fù)荷的碳、氮、磷等富營(yíng)養(yǎng)元素污染是此類(lèi)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)形成的動(dòng)因。

圖3 DGGE條帶識(shí)別和聚類(lèi)分析

表2 樣品的多樣性指數(shù)

圖4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的冗余分析

3 結(jié)語(yǔ)

采用PCR-DGGE方法對(duì)太湖底泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同位置底泥中的細(xì)菌組成有較大差別，結(jié)合底泥理化性質(zhì)進(jìn)行RDA分析，發(fā)現(xiàn)底泥中總氮、總磷和總有機(jī)質(zhì)含量的變化能解釋大部分群落結(jié)構(gòu)的差異。分水口（2號(hào)）和浯溪口（3號(hào)）底泥的細(xì)菌組成是由高濃度的碳、氮、磷污染造成的，其中總氮對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大。后續(xù)研究可以擴(kuò)大樣本量，通過(guò)相關(guān)性分析找出高度富營(yíng)養(yǎng)化底泥中的特征微生物，作為指示微生物應(yīng)用到環(huán)境監(jiān)測(cè)和預(yù)警中。

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Influence of environmental factors on bacterial community structures in sediments of Lake Tai

QIAN Wei，ZHU Yanxia， QIU Yexian*
（School of Chemistry，Biology and Material Engineering，SUST，Suzhou 215009，China）

Denatured gradient gel electrophoresis （DGGE） was used to study the diversity of bacteria in sediments of Lake Tai.Total nitrogen （TN），total phosphorus （TP） and total organic Carbon （TOC） were quantified.Then，Redundancy Analysis （RDA） was carried out to explore the influence of environmental factors on bacterial community structures in sediments of Lake Tai.Results show that the gradient of TN，TP and TOC can explain 54.27%variations of bacterial community structures.TN was the most important impact factor，followed by TP and TOC.This study has provided valuable data for microbial resources investigation and environmental monitoring of Lake Tai.

sediments of Lake Tai；denatured gradient gel electrophoresis(DGGE)；Redundancy Analysis(RDA)

Q33

A

2096－3289（2017）03－0050－05

責(zé)任編輯：李文杰

2015－12－22

蘇州科技學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目（XKQ201313）

錢(qián) 瑋（1983-），男，江蘇泰州人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：環(huán)境微生物學(xué)。

*通信作者：邱業(yè)先（1954-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：qyx542@163.com。