劉亞秋李新輝王志堅(jiān)

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 廣州 510380; 2. 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715)

大鱗副泥鰍腸道黏液細(xì)胞及消化酶活性分布特征研究

劉亞秋1,2李新輝1王志堅(jiān)2

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 廣州 510380; 2. 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715)

采用阿利新蘭-碘酸雪夫氏反應(yīng)(AB-PAS)染色法及酶學(xué)方法研究了大鱗副泥鰍成熟個(gè)體腸道各段黏液細(xì)胞分布及消化酶活性。結(jié)果表明, 大鱗副泥鰍腸道黏液細(xì)胞分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4種類型。前腸至后腸,黏液細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。前腸主要分布Ⅲ和Ⅳ混合型黏液細(xì)胞, 后腸則以Ⅱ和Ⅳ型酸性黏液細(xì)胞為主。腸道胰蛋白酶活性顯著高于淀粉酶和脂肪酶。且后腸消化酶活性顯著低于前腸和中腸。根據(jù)黏液細(xì)胞及消化酶活性分布特點(diǎn), 表明大鱗副泥鰍屬于雜食性魚(yú)類, 前腸為其主要的消化吸收?qǐng)鏊? 后腸中性黏液細(xì)胞的數(shù)量較少以及消化酶活性較低, 表明其對(duì)食物的消化吸收功能較弱, 與其為輔助呼吸功能的特點(diǎn)相關(guān)。

黏液細(xì)胞; 消化酶; 大鱗副泥鰍; 腸道

大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus), 隸屬于鯉形目, 花鰍科, 副泥鰍屬, 是一種底棲生活的小型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。目前廣泛分布于東南亞等地區(qū), 在中國(guó)主要分布在長(zhǎng)江中下游以及珠江流域[1]。其肉質(zhì)鮮美, 營(yíng)養(yǎng)豐富, 常出沒(méi)于沼澤, 水田, 池塘等低氧環(huán)境。大鱗副泥鰍、泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)等, 在低氧的情況下, 喜歡吞食氣泡, 存在腸道輔助呼吸的特點(diǎn)。劉亞秋等[2]研究表明, 大鱗副泥鰍前中后部腸道組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)差異顯著, 后腸為其主要進(jìn)行輔助呼吸的部位。目前關(guān)于大鱗副泥鰍的研究在生長(zhǎng)與年齡、遺傳多樣性以及雜交育種等方面已有文獻(xiàn)報(bào)道[3—6]。而對(duì)于其兼具消化與呼吸功能的腸道黏液細(xì)胞及消化酶活性分布特點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此, 本研究通過(guò)對(duì)大鱗副泥鰍腸道各段黏液細(xì)胞類型、分布密度、黏蛋白分布特點(diǎn)及消化酶活性分布差異進(jìn)行研究, 結(jié)合其生存環(huán)境特點(diǎn), 對(duì)其腸道各部組織化學(xué)及消化生理特點(diǎn)進(jìn)行初步探討, 以期對(duì)其腸道各區(qū)域結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

大鱗副泥鰍成熟個(gè)體來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室大棚養(yǎng)殖池塘, 暫養(yǎng)魚(yú)實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水缸內(nèi)馴養(yǎng)2周, 自然光照,不間斷充氣, 水質(zhì)參數(shù)如下: 21—23℃, 溶氧: (7.15± 0.58) mg/L, pH 7.1—7.8。取大鱗副泥鰍性成熟個(gè)體30尾雌雄各半, 測(cè)量體長(zhǎng)、體重、腸長(zhǎng)及腸重。隨機(jī)選取其中15大鱗副泥鰍, 雌雄根據(jù)其特征進(jìn)行分類(雌雄比例為6:9)。雌雄各隨機(jī)取3尾, 進(jìn)行切片觀察; 其余15尾中, 隨機(jī)選取6尾用于腸道各部消化酶活性測(cè)定。

1.2 方法

樣本制備與顯微觀察 成魚(yú)腸道的組織學(xué)材料用Bouin’s試液固定, 保存于70%酒精。酒精梯度脫水, 常規(guī)石蠟包埋, 切片5—7 μm, 分別以橫向方式進(jìn)行切片, 采用阿利新藍(lán)(Alcian blue, AB)、過(guò)碘酸-雪夫(Periodicacid-Schiff, PAS)以及阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫(AB-PAS)方法染色, 中性樹(shù)膠封片。

阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫(AB-PAS)染色, 將大鱗副泥鰍黏液細(xì)胞分為4種類型: Ⅰ型為紅色, 阿利新藍(lán)(AB)反應(yīng)陰性, 過(guò)碘酸-雪夫(PAS)反應(yīng)陽(yáng)性, 含有中性黏多糖; Ⅱ型為藍(lán)色, 阿利新藍(lán)(AB)反應(yīng)陽(yáng)性, 過(guò)碘酸-雪夫(PAS)反應(yīng)陰性, 含有酸性黏多糖;Ⅲ型為紫紅色, 阿利新藍(lán)(AB)與過(guò)碘酸-雪夫(PAS)反應(yīng)均為陽(yáng)性, 主要含有過(guò)碘酸-雪夫(PAS)反應(yīng)陽(yáng)性的中性黏多糖; Ⅳ型為藍(lán)紫色, 阿利新藍(lán)(AB)與過(guò)碘酸-雪夫(PAS)反應(yīng)均為陽(yáng)性, 主要含有阿利新藍(lán)(AB)反應(yīng)陽(yáng)性的酸性黏多糖[7]。根據(jù)阿利新藍(lán)(AB)(pH 2.5和1.0)、過(guò)碘酸-雪夫(PAS)染色的深淺表示其黏蛋白組織化學(xué)反應(yīng)的強(qiáng)弱[8]。

制片后采用NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng)觀察、照相。腸道各段隨機(jī)取3張切片進(jìn)行指標(biāo)測(cè)量, 每張切片隨機(jī)選10個(gè)視野, 分別計(jì)數(shù)每一視野中100 μm×100 μm范圍內(nèi)各類型黏液細(xì)胞的總數(shù), 作為該類型黏液細(xì)胞的密度; 每項(xiàng)指標(biāo)采用Image-Pro Plus (IPP)圖像分析軟件進(jìn)行測(cè)量。

樣品采集與酶活性測(cè)定 魚(yú)體置于冰盤(pán)上,以免消化酶失活。用重物猛擊其頭部, 迅速處死魚(yú),分別剪取其前腸、中腸、后腸和肝胰臟等組織塊,快速置于液氮固定并置于–80℃超低溫冰箱保存,用于進(jìn)一步消化酶測(cè)定。

從冰箱中取出待測(cè)樣品, 置于冰上解凍。解凍完成后將樣品稱重, 按質(zhì)量: 體積為1∶4加入勻漿稀釋液, 分別對(duì)每尾魚(yú)肝胰臟、前腸、中腸、后腸以勻漿器進(jìn)行勻漿。所得勻漿液用低溫超速離心機(jī)4℃, 3000 r/min轉(zhuǎn)速離心20min后取上清液用于消化酶活力測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中的消化酶及可溶性蛋白均使用南京建成公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)。在pH 8.0, 37℃條件下, 每毫克蛋白質(zhì)中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003定義為1個(gè)胰蛋白酶活力單位。在37℃條件下, 每克組織蛋白在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1min, 每消耗1 umol底物定義為1個(gè)脂肪酶活力單位。組織中每毫克蛋白在37℃與底物作用30min, 水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位。本實(shí)驗(yàn)使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo)和紫外分光光度計(jì)(UV-2450)測(cè)定吸光度。

數(shù)據(jù)分析 采用單因子方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)?zāi)c道各部黏液細(xì)胞分布密度、肝胰臟以及腸道各部消化酶活性差異顯著性。如差異顯著, 則采用多重比較方法比較平均數(shù)之間的差異。顯著性水平為0.05。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 大鱗副泥鰍腸道形態(tài)及腸道系數(shù)

大鱗副泥鰍無(wú)胃, 食道較短緊接腸道, 腸道始端膨大, 呈長(zhǎng)管狀。大鱗副泥鰍腸道整體位于腹腔底部, 頭部背肝臟覆蓋。腸道可劃分為前腸、中腸和后腸三部分, 腸道螺旋彎曲前部稱為前腸, 向后至第二處輕微彎曲為中腸, 彎曲至肛門(mén)段為后腸。后腸管腔狹窄, 腸壁薄而透明, 且布滿血管(圖 1)。腸道系數(shù)如表 1所示。

2.2 腸道黏液細(xì)胞分布情況

腸道各部黏液細(xì)胞的分布特點(diǎn)及密度 大鱗副泥鰍腸道上皮為單層柱狀上皮, 上皮細(xì)胞之間含有豐富黏液細(xì)胞。AB-PAS染色結(jié)果顯示, 腸道黏液細(xì)胞形狀各異, 呈杯狀、囊狀、圓球狀等不同形態(tài), 有Ⅰ- Ⅳ型4種黏液細(xì)胞(圖 2)。前腸黏液細(xì)胞豐富多為Ⅲ和Ⅳ型黏液細(xì)胞, 多呈杯狀和囊狀,后腸腸壁很薄, 多為Ⅱ型黏液細(xì)胞。腸道各段黏液分布密度如表 2所示, 前腸Ⅰ、Ⅲ、 Ⅳ型黏液細(xì)胞數(shù)量顯著多于中腸和后腸(P＜0.05), 中腸次之, 后腸缺乏Ⅰ和Ⅲ型黏液細(xì)胞。相較之下, 后腸Ⅱ型黏液細(xì)胞數(shù)量要顯著多于前腸和中腸(P＜0.05)。

腸道黏蛋白的分布特點(diǎn) 后腸的阿利新藍(lán)(AB) (pH 0.5、1.0和2.5)反應(yīng)強(qiáng)度高, 表明該部位硫酸基(-SO3H)和羧基(-COOH)的酸性黏液物質(zhì)豐富。前腸道上皮黏蛋白過(guò)碘酸-雪夫(PAS)反應(yīng)強(qiáng)度高于中腸和后腸, 表明腸道前部?jī)?nèi)中性黏液物質(zhì)分泌能力強(qiáng)。且前腸和后腸阿利新藍(lán)(AB)(pH 2.5和1.0)反應(yīng)強(qiáng)度高于中腸(表 3)。

圖 1 大鱗副泥鰍腸道

表 1 大鱗副泥鰍腸道形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)參數(shù)Tab. 1 Basic intestinal tract morphological parameters in P. dabryanus

圖 2 大鱗副泥鰍腸道黏液細(xì)胞

表 2 大鱗副泥鰍腸道黏液細(xì)胞的分布密度(細(xì)胞數(shù)個(gè)/mm2)Tab. 2 Mucous cells distribution density of in the intestine of P. dabryanus (cell/mm2)

表 3 大鱗副泥鰍腸道黏蛋白組織化學(xué)反應(yīng)情況Tab. 3 Mucin histochemistry reaction in the intestinal tract of P. dabryanus

2.3 消化酶活性分布情況

大鱗副泥鰍腸道消化酶活性分布如圖 3所示,中腸淀粉酶活性相對(duì)最高為(0.45±0.05) U/mg protein, 腸道各段淀粉酶活性差異不顯著(P＞0.05), 但均顯著高于肝胰臟(P＜0.05)。大鱗副泥鰍肝胰臟脂肪酶活性相對(duì)最低(0.17±0.02) U/mg protein, 顯著低于腸道各部(P＜0.05)。后腸脂肪酶活性顯著低于前腸和中腸(P＜0.05), 而前腸與中腸脂肪酶活性差異不顯著(P＞0.05)。前腸胰蛋白酶活性最高(5089.06± 295.94) U/mg protein, 顯著高于肝胰臟以及腸道其他各部(P＜0.05)。中腸次之, 其次為肝胰臟。后腸為大鱗副泥鰍胰蛋白酶活性最低的部位。堿性磷酸酶活性在前腸的活性最高(36.13±4.36) U/mg protein (P＜0.05), 其次是中腸, 在肝臟以及后腸的活性較低。

3 討論

組織化學(xué)觀察發(fā)現(xiàn), 大鱗副泥鰍前腸黏液細(xì)胞數(shù)量顯著多于中后腸, 且含有豐富的I和III型黏液細(xì)胞。豐富的黏液物質(zhì)可以潤(rùn)滑食物, 減少食物對(duì)腸黏膜的機(jī)械損傷[9]。中性黏液物質(zhì)可以和堿性磷酸酶共存, 并且具有調(diào)節(jié)消化道pH以及輔助消化功能[10]。后腸中黏液細(xì)胞基本為酸性, 中性黏液細(xì)胞顯著減少, 導(dǎo)致后腸喪失了吸收部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能。有學(xué)者對(duì)岡特似鱗頭鰍(Lepidocephalichthys guntea)[11]和側(cè)斑兵鲇(Corydoras aeneus)[12]的研究發(fā)現(xiàn), 其腸道后部分泌大量硫酸基(-SO3H) 和羧基(-COOH)的酸性黏液物質(zhì)的特點(diǎn)與其特殊的腸道輔助呼吸功能相關(guān)。Leknes[13]則認(rèn)為, 呼吸上皮酸性黏液物質(zhì)更多是對(duì)保護(hù)頻繁充入外界干燥空氣的脆弱呼吸上皮的一種保護(hù)。覓食期間, 腸呼吸魚(yú)類的腸道處于食物高度充塞情況下, 氣體如何到達(dá)呼吸上皮進(jìn)行氣體交換生理機(jī)制還不明確。有研究表明, 腸輔助呼吸時(shí), 大量空氣的吞入促進(jìn)未消化的食物排出體外[13,14]。Moitra等[11]研究表明分泌的酸性黏液物質(zhì)起到一定潤(rùn)滑作用, 并能保持呼吸上皮區(qū)域的干凈。且進(jìn)行氣呼吸時(shí)氣體交換保持了穩(wěn)定的酸性環(huán)境, 這也是多數(shù)具有輔助呼吸功能的魚(yú)類氣呼吸器官的共有特征[15—17]。

圖 3 大鱗副泥鰍腸道消化酶活性分布

研究結(jié)果表明, 大鱗副泥鰍前腸和中腸的胰蛋白酶活性較高, 后腸胰蛋白酶活性較低, 這與肉食的歐鲇(Silurus glanis)和雜食性的尼羅羅非魚(yú)(Nile tilapia)類似[18,19]。前腸和中腸的胰蛋白酶高于肝胰臟, 這與鯉形目的草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)、鯉(Cyprinus carpio)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)等相似[20]。這可能是由于肝胰臟主要分泌蛋白酶原, 這種酶原的蛋白酶活性微弱, 當(dāng)?shù)鞍酌冈M(jìn)入腸道前部后受到腸道分泌的腸激酶的激活才有較強(qiáng)活性, 所以導(dǎo)致腸道的胰蛋白酶的活性要顯著高于肝胰臟[21—23]。淀粉酶以及脂肪酶也檢測(cè)出類似情況。相較而言, 大鱗副泥鰍腸道胰蛋白酶活性顯著高于淀粉酶和脂肪酶, 這與大鱗副泥鰍食物餌料來(lái)源的成分相關(guān)。后腸堿性磷酸酶活性顯著低于腸道其他各部。有研究表明, 堿性磷酸酶主要存在于魚(yú)類腸道上皮細(xì)胞的淺部和紋狀緣上, 是一種可幫助腸上皮細(xì)胞吸收的金屬酶, 與多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收存在正相關(guān)性,是消化生理的研究的重要指標(biāo)[19,24,25]。比較腸道各段消化酶活性, 大鱗副泥鰍后腸消化酶要低于腸道其他各部?？赡苁怯捎谇澳c、中腸為其主要的消化與吸收?qǐng)鏊? 而后腸對(duì)于食物的消化能力很弱,這也與其后腸黏液細(xì)胞分布特點(diǎn)一致。

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STUDY ON DISTRIBUTION CHARACTERISTICS OF INTESTINAL MUCOUS CELLS AND DIGESTIVE ENZYME ACTIVITIES IN PARAMISGURNUS DABRYANUS

LIU Ya-Qiu1,2, LI Xin-Hui1and WANG Zhi-Jian2
(1. Pearl River Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2. Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, the Key Laboratory of Aquatic Science of Chongqing, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Distribution of mucous cells and digestive enzyme activities in the intestinal tract of Paramisgurnus dabryanus were analyzed by AB-PAS histochemical staining and enzymatic testing techniques. The results showed that there were four types of P. dabryanus intestinal tract mucous cells (Ⅰ–Ⅳ). The number of mucous cells decreased from the anterior to posterior intestinal tract. The types of mucous cells in anterior intestinal tract were mainly mixed Ⅲ and Ⅳtypes. The mucous cells, however, consisted of mainly Ⅱ and Ⅳ acidic types in the posterior intestine. Trypsin activity was significantly higher than amylase and lipase activities. Digestive enzyme activities in the posterior intestine were lower than that in the anterior and middle intestine. According to distribution characteristics of the intestinal mucous cells and digestive enzyme activities, P. dabryanus appears to be a type of polyphagic fish. Its intestinal tract has digestion and respiratory functions. Digestion and absorption occur in the anterior intestine. In the posterior intestine, the lack of neutral mucus cells and low digestive enzyme activities indicate that its digestive and absorptive abilities are weak. It may be related to its assistive respiratory function.

Mucous cell; Digestive enzyme; Paramisgurnus dabryanus; Intestine

Q954.6

A

1000-3207(2017)05-1048-06

10.7541/2017.131

2016-11-15;

2017-02-18

公益性行業(yè)專項(xiàng)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203086)資助 [Supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (201203086)]

劉亞秋(1990—), 男, 湖北武漢人; 碩士; 主要研究方向?yàn)闈O業(yè)生態(tài)與環(huán)境。 E-mail: liuyq1990@foxmail.com

王志堅(jiān)(1969—), 男, E-mail: wangzj1969@126.com