高效液相色譜-光電二極管陣列-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用鑒定馬鞭草提取物中的化學(xué)成分

孫玉明, 王月月, 蔡 蕊, 張 華, 王玉林

(1. 大連理工大學(xué)化工學(xué)院, 遼寧 大連 116024; 2. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 遼寧 大連 116044)

研究論文

高效液相色譜-光電二極管陣列-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用鑒定馬鞭草提取物中的化學(xué)成分

孫玉明1, 王月月1, 蔡 蕊1, 張 華1, 王玉林2*

(1. 大連理工大學(xué)化工學(xué)院, 遼寧 大連 116024; 2. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 遼寧 大連 116044)

采用高效液相色譜-光電二極管陣列-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-PDA-HRMS)技術(shù)對(duì)馬鞭草中的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析和鑒定。通過(guò)綜合分析所檢測(cè)到化合物的色譜、一級(jí)和多級(jí)全掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù),對(duì)馬鞭草提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定。馬鞭草提取物中檢測(cè)到環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、三萜類、苯乙醇苷類和二萜酚類化合物等共21種化學(xué)成分,其中鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、異迷迭香酚、迷迭香酸以及金合歡素-7-O-蕓香糖苷6種化合物并未在其他有關(guān)馬鞭草提取物鑒定的文獻(xiàn)中出現(xiàn)。該方法簡(jiǎn)單快速,準(zhǔn)確度高,為鑒定中藥材真?zhèn)魏推焚|(zhì)提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

高效液相色譜;光電二極管陣列檢測(cè)；高分辨質(zhì)譜;質(zhì)譜裂解;結(jié)構(gòu)鑒定;馬鞭草;提取物

馬鞭草(VerbenaofficinalisL.)為馬鞭草科植物馬鞭草的干燥地上部分,馬鞭草以全草入藥,始載于《名醫(yī)別錄》,具有活血化瘀、清熱解毒、截瘧、利水消腫的作用[1]。研究[2-4]表明,馬鞭草還具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)神經(jīng)、抗真菌、抗氧化和抗早孕等作用。

由于馬鞭草中的活性成分具有臨床治療意義,其提取物中的化學(xué)成分得到了深入的研究[1,4-9]。文獻(xiàn)[1,5,6,9]中多采用傳統(tǒng)方法將大量藥材進(jìn)行提取分離得到純品,再對(duì)化合物進(jìn)行光譜鑒定。據(jù)報(bào)道[5-10],馬鞭草提取物含有環(huán)烯醚萜苷、黃酮類、苯乙醇苷類、三萜類及揮發(fā)油類化合物,其中環(huán)烯醚萜苷是馬鞭草的特征性成分,也是有效成分之一。近年來(lái),HPLC-MS技術(shù)因其高效的分離能力和較強(qiáng)的鑒別能力而被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)組分的鑒別中[11-13]。

本文旨在采用高效液相色譜-光電二極管陣列-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-PDA-HRMS)技術(shù)對(duì)馬鞭草中的化學(xué)成分進(jìn)行分離檢測(cè),通過(guò)綜合分析色譜及一級(jí)和多級(jí)全掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)各化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗(yàn)證,為進(jìn)一步分離馬鞭草中的活性成分提供前期依據(jù),為中藥材鑒定真?zhèn)魏推焚|(zhì)提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

LTQ Orbitrap XL配Thermo Xcalibur 2.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Accela液相色譜系統(tǒng)(包括Accela1250四元梯度泵、Accela AS自動(dòng)進(jìn)樣器、Accela PDA檢測(cè)器)、Hypersil Gold C18柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)(美國(guó)賽默飛世爾公司); BS124S萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司); KQ-200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司); RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪予華儀器廠); AK-1000A搖擺式中藥粉碎機(jī)(溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司)。

甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司);乙酸(色譜純,北京Dikma公司);無(wú)水乙醇(分析純,天津富宇精細(xì)化工有限公司);馬鞭草(安徽德昌藥業(yè)飲片有限公司,由大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥劑科李永杰鑒定并確認(rèn));木犀草素原料藥(純度>98%,西安沃森生物科技有限公司);鼠尾草酸(純度>60%,上海源葉生物科技有限公司);齊墩果酸(純度>95%,西安小草植物科技有限責(zé)任公司);迷迭香酸、蒙花苷(純度均不小于98%,上海源葉生物科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2樣品處理

將馬鞭草粉碎得粗粉,取適量馬鞭草粗粉和無(wú)水乙醇，以1 g馬鞭草粗粉中加入10 mL無(wú)水乙醇的比例混勻，于20 ℃超聲(50 Hz)提取2 h,靜置過(guò)夜。真空抽濾后于55 ℃減壓濃縮得到馬鞭草提取物浸膏。

稱取適量馬鞭草提取物浸膏,加入無(wú)水乙醇超聲溶解,配制成200 g/L的溶液,用甲醇-水(1∶1, v/v)溶液將上述溶液稀釋至5 g/L,經(jīng)0.22 μm的微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.3色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱為Hypersil Gold C18柱;柱溫為室溫;進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為0.3%的冰醋酸水溶液;流速為0.2 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)?0～20 min, 20%A～40%A; 20～30 min, 40%A～100%A; 30～40 min, 100%A。PDA檢測(cè)器波長(zhǎng)范圍:200～400 nm。

質(zhì)譜條件:ESI源,分別采用正、負(fù)兩種模式進(jìn)行檢測(cè);源噴射電壓在正、負(fù)模式下分別為3.5和3.0 kV;鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?流速分別為15和5 L/min;加熱毛細(xì)管溫度為350 ℃;掃描方式為一級(jí)和多級(jí)全掃描;分辨率為30 000;最大允許偏差為±5×10-6。

2 結(jié)果與討論

本文采用HPLC-PDA-HRMS技術(shù)對(duì)馬鞭草提取物的化學(xué)組分進(jìn)行了分析和鑒定。通過(guò)綜合分析化合物的色譜(見圖1)及一級(jí)和多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù),分別采用ESI+和ESI-模式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)到21種化合物,各化合物相關(guān)數(shù)據(jù)見表1和圖2。

化合物1和2為環(huán)烯醚萜苷類化合物,分別為戟葉馬鞭草苷和馬鞭草苷。該類化合物在ESI+和ESI-模式下均有質(zhì)譜響應(yīng),且在ESI+模式下易形成[M+Na]+峰(m/z427.120 8和411.125 9)和[2M+Na]+峰(m/z831.253 6和799.263 5),而在ESI-模式下易形成甲酸加合峰[M-H+CH3COOH]-(m/z463.145 2和447.150 3)。為進(jìn)一步確定化合物結(jié)構(gòu),在ESI+模式下對(duì)化合物的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析,通過(guò)綜合分析化合物的元素組成和碎片信息,確證化合物結(jié)構(gòu)。如化合物1的[M+H]+峰(m/z405)產(chǎn)生的主要碎片離子m/z為243、225、207和193,與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致。其中m/z243比m/z405少162,推測(cè)為糖苷鍵斷裂脫掉1分子葡萄糖產(chǎn)生的碎片離子[M+H-C6H10O5]+;m/z225為m/z243脫掉1分子水形成的碎片離子[M+H-C6H12O6]+;m/z207為m/z225脫掉1分子水形成的碎片離子[M+H-C6H12O6-H2O]+,說(shuō)明化合物1的苷元部分含有游離的羥基;m/z193為m/z225脫掉1分子甲醇形成的碎片離子[M+H-C6H12O6-CH3OH]+,說(shuō)明苷元結(jié)構(gòu)中含有甲氧基的結(jié)構(gòu)單元。綜上,確定化合物1為戟葉馬鞭草苷。同理確定化合物2為馬鞭草苷。

圖 1 高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)馬鞭草提取物的典型色譜圖Fig. 1 Typical chromatograms of Verbena officinalis L. extract detected by HPLC-high resolution mass spectrometry (HRMS) a. detected by photodiode array (PDA) detector; b. detected by MS in ESI+mode; c. detected by MS in ESI- mode. Peak Nos.: 1. hastatoside; 2. verbenalin; 3. quercetin-3-O-glucoside; 4. verbascoside; 5. luteolin-7-O-glucoside; 6. isoverbascoside; 7. pedalitin-6-O-glucoside; 8. rosmarinic acid; 9. apigenin-7-O-glucoside; 10. 4′-hydroxyl wogonoside; 11. acacetin-7-O-rutinoside; 12. luteolin; 13. isorosmanol; 14. rosmanol; 15. 4′- hydroxyl wogonin; 16. apigenin; 17. carnosol; 18. barbinervic acid; 19. carnosic acid; 20. ursolic acid; 21. oleanolic acid.

No.Retentiontime/minMolecularformula[M+H]+/[M-H]-(m/z)Error/(ppm,10-6)Fragmentions(m/z)17.15C17H24O11405.1392/#+0.25243,225,207,19328.06C17H24O10389.1441/#-0.26357,227,195311.37C21H20O12465.1026/463.0875-0.43/+0.86303,285,257412.53C29H36O15625.2127/623.1976+0.32/-0.80607,479,471,325513.47C21H20O11449.1075/447.0925-0.67/-1.79287614.28C29H36O15625.2127/623.1976+0.32/-0.80607,479,471,325714.57C22H22O12479.1182/477.1035-0.42/-0.84317,302,274,168815.06C18H16O8#/359.0769+2.20223,197,179,161915.86C21H20O10433.1127/431.0976-0.46/-1.862711016.71C22H22O11463.1230/461.1086-1.08/-1.733011119.66C28H32O14593.1872/591.1718+1.18/-0.22447,285,270,2421219.87C15H10O6287.0549/285.0400-0.35/-1.75245,241,1531320.71C20H26O5347.1843/345.1702-2.89/-1.45301,2831421.71C20H26O5347.1846/345.1702-2.02/-1.45301,2831522.16C16H12O6301.0708/299.0558+0.33/-1.00286,258,1681622.33C15H10O5271.0600/269.0452-0.37/-1.12243,229,225,1531728.30C20H26O4331.1901/329.1755-2.42/-0.912851829.26C30H48O5489.3569/487.3426-1.23/-1.64471,407,453,435,4251931.29C20H28O4#/331.1914-0.302872032.23C30H48O3#/455.3525-1.32409,407,3912133.22C30H48O3#/455.3524-1.54407

# not detected.

圖 2 21種馬鞭草提取物化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式Fig. 2 Structural formulas of the 21 chemical compositions of Verbena officinalis L. extract 1-21 are the same as those in Fig. 1.

化合物3、5、7、9～12、15、16均為黃酮類化合物,其中化合物3、5、7、9～11均為黃酮苷類化合物,分別為槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、胡麻黃素-6-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、4′-羥基漢黃芩苷和金合歡素-7-O-蕓香糖苷;化合物12、15和16為黃酮苷元類化合物,分別為木犀草素、4′-羥基漢黃芩素和芹菜素。本文所檢測(cè)到的9種黃酮類化合物在ESI+和ESI-模式下均有質(zhì)譜響應(yīng),其中化合物11(金合歡素-7-O-蕓香糖苷也稱蒙花苷)在有關(guān)馬鞭草提取物化學(xué)成分鑒定的文獻(xiàn)中未見報(bào)道,因此本文將以化合物11為例闡述黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)推測(cè)過(guò)程。

圖 3 化合物11的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of compound 11

圖 4 化合物11的質(zhì)譜裂解途徑Fig. 4 Mass spectral fragmentation pathways of compound 11

圖 5 化合物13和14的質(zhì)譜圖Fig. 5 Mass spectra of compounds 13 and 14

圖 6 齊墩果酸對(duì)照品和化合物21的質(zhì)譜圖Fig. 6 Mass spectra of the oleanolic acid reference substance and compound 21

其余化合物的結(jié)構(gòu)推測(cè)過(guò)程見補(bǔ)充材料(http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/170 5010-S1.pdf)。

綜上,本研究采用HPLC-HRMS技術(shù)分別在ESI+和ESI-模式下對(duì)馬鞭草提取物的化學(xué)組分進(jìn)行了分析和鑒定。在ESI+模式下檢測(cè)到17種化合物,在ESI-模式下檢測(cè)到19種化合物,其中15種化合物在ESI+和ESI-兩種模式下均有質(zhì)譜響應(yīng)。綜合ESI+和ESI-兩種檢測(cè)模式下的結(jié)果,在馬鞭草提取物中共檢測(cè)到21種化合物:2種環(huán)烯醚萜苷類分別馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷;9種黃酮類化合物分別為木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、4′-羥基漢黃芩素、4′-羥基漢黃芩苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、胡麻黃素-6-O-葡萄糖苷和金合歡素-7-O-蕓香糖苷;3種三萜類化合物分別為熊果酸、齊墩果酸和馬尾柴酸;2種苯乙醇苷類分別為毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷;5種二萜酚類分別為鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酚、異迷迭香酚和迷迭香酸。其中6種化合物并未在其他有關(guān)馬鞭草提取物鑒定的文獻(xiàn)中出現(xiàn),分別為鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酚、異迷迭香酚、迷迭香酸和金合歡素-7-O-蕓香糖苷。

3 結(jié)論

采用HPLC-PDA-HRMS技術(shù)鑒定馬鞭草提取物中的化學(xué)成分,既利用了色譜的分離技術(shù)又結(jié)合了質(zhì)譜的高選擇性和較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)鑒別能力,具有分離速度快、檢測(cè)效率高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。用該方法共檢測(cè)出馬鞭草提取物中的21種化合物,并對(duì)每種化合物進(jìn)行多級(jí)全掃描質(zhì)譜分析,使所推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)得到了進(jìn)一步的確證。該方法操作簡(jiǎn)便、快速高效、準(zhǔn)確可靠,可作為馬鞭草藥材鑒別和質(zhì)量控制的有效方法。

致謝

感謝大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥劑科李永杰對(duì)本研究中所使用的中藥材馬鞭草的鑒定。

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Identification of the chemical compositionsofVerbenaofficinalisL. extract by high performance liquid chromatography-photodiode array-high resolution mass spectrometry

SUN Yuming1, WANG Yueyue1, CAI Rui1, ZHANG Hua1, WANG Yulin2*

(1. School of Chemical Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China;2. Basic Medical College, Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

To investigate the main chemical compositions ofVerbenaofficinalsL. extract, a qualitative high performance liquid chromatography-photodiode array-high resolution mass spectrometry (HPLC-PDA-HRMS) method was established. The structures of the compounds detected were identified by analyzing the chromatographic profiles and the corresponding mass spectra obtained by full scan and MSnfull scan. Twenty one compounds including iridoid glycosides, flavonoids, triterpenoids, phenylpropanoids and phenolic diterpenoids were identified, and six of them were not reported in other literatures aboutVerbenaofficinalisL. extract, such as carnosic acid, carnosol, rosmanol, isorosmanol, rosmarinic acid and acacetin-7-O-rutinoside. This method is simple, rapid, accurate and sensitive. It provides a reliable scientific basis for the identification of the authenticity and quality control of Chinese medicinal materials.

high performance liquid chromatography (HPLC); photodiode array detection; high resolution mass spectrometry (HRMS); mass fragmentation; structure identification;VerbenaofficinalisL.; extract

10.3724/SP.J.1123.2017.05010

2017-05-19

.E-mail:wangyulin1971@126.com.

O658

A

1000-8713(2017)09-0987-08

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