董月濤

（文安縣畜牧獸醫(yī)局，河北文安065800）

性控精液在畜牧業(yè)中的應(yīng)用與使用方法

董月濤

（文安縣畜牧獸醫(yī)局，河北文安065800）

1 XY精子分離技術(shù)簡(jiǎn)介

性控精液的生產(chǎn)就是將XY精子分離的過(guò)程，在哺乳動(dòng)物中，決定動(dòng)物性別的關(guān)鍵是其所攜帶不同的性染色體。當(dāng)經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成單倍體的配子后，X精子攜帶X染色體，它與卵子受精后產(chǎn)生雌性后代，Y精子攜帶Y染色體，它與卵子受精后產(chǎn)生雄性后代。

在哺乳動(dòng)物（家畜）中，通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%～4.5%。分離精子時(shí)首先用Hoechst33342（一種相對(duì)安全的活細(xì)胞熒光染料，以非嵌入方式特異地結(jié)合到DNA雙鏈小溝的腺嘌呤和胸腺嘧啶密集區(qū)域）給精子染色，染色后精子通過(guò)流式細(xì)胞儀時(shí)，精子上的熒光染料Hoechst33342被氬離子紫外激光（～350 nm）激發(fā)，產(chǎn)生藍(lán)色激發(fā)光（～460 nm）。由于X精子所含有DNA比Y精子多，結(jié)合上比較多的Hoechst33342，所激發(fā)出的熒光就比Y精子強(qiáng)。流式細(xì)胞儀根據(jù)熒光強(qiáng)度的差別分辨出哪個(gè)是X精子，哪個(gè)是Y精子。同時(shí)，由于噴嘴產(chǎn)生高頻率震動(dòng)，高速噴射出的液流形成了包含單個(gè)X精子或者Y精子的微小液滴。因此包含精子的小液滴就被充上正電荷（X精子）或者負(fù)電荷（Y精子）。

染色的精子通過(guò)流束形成含有精子的帶電液滴，在流動(dòng)室的噴嘴上裝備有一個(gè)超聲振蕩壓晶體片，這個(gè)振蕩裝置使自噴嘴射出的液束破碎成千萬(wàn)個(gè)小滴，流動(dòng)的精子就被分散在這些小水滴中。由于XY精子的熒光強(qiáng)度的不同，計(jì)算機(jī)就根據(jù)熒光量不同給小液滴帶上不同電荷。當(dāng)帶有不同電荷的精子液流經(jīng)一對(duì)帶正、負(fù)幾千伏恒定靜電電場(chǎng)的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，帶電的小水滴就根據(jù)自身所帶的電荷性質(zhì)產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不帶電荷的水滴就進(jìn)入中間的廢液容器中，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的分選。

2 性控精液的應(yīng)用及其優(yōu)勢(shì)

性別控制一直是生物科學(xué)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題，對(duì)畜牧業(yè)（尤其是養(yǎng)牛業(yè)）有著非常重要的意義，它可以按照生產(chǎn)需求控制仔畜性別，以提高畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效率。在育種方面，通過(guò)性別控制可以增加選擇家畜遺傳和表型性別的強(qiáng)度，加速育種進(jìn)程。在生產(chǎn)實(shí)踐中，X精子冷凍精液可用于直接給發(fā)情牛授精生產(chǎn)體內(nèi)性控胚胎或者對(duì)供體超排后輸精生產(chǎn)性控胚胎，再將胚胎收集并用于移植。

2.1 具有節(jié)省成本，提高經(jīng)濟(jì)效益的優(yōu)勢(shì)

若受性別限制的生產(chǎn)性狀（如泌乳等）和受性別影響的生產(chǎn)性狀（如生長(zhǎng)速度等）的生產(chǎn)能力得到充分發(fā)揮，就能獲得很大的經(jīng)濟(jì)效益?，F(xiàn)有的胚胎性別控制技術(shù)，是將制作好的胚胎進(jìn)行切割取樣，再采用分子生物學(xué)手段進(jìn)行胚胎的性別鑒定，按照目前的市場(chǎng)價(jià)格生產(chǎn)一枚胚胎需要1 500元左右，且只有50%的機(jī)率是雌性胚胎，而性控凍精的價(jià)格為每支200元，資源和成本的優(yōu)勢(shì)相當(dāng)明顯。Cran等、Seidel等用Y精子產(chǎn)下的公牛為90%，而用X精子則產(chǎn)下83%的母犢。而且Seidel等經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)（使用1 370頭青年母牛，22頭公牛，進(jìn)行11個(gè)試驗(yàn)）還發(fā)現(xiàn):冷凍分離精子與新鮮分離精子授精后的懷孕率沒(méi)有明顯差異，分離冷凍精子授精劑量100萬(wàn)～150萬(wàn)個(gè)與300萬(wàn)個(gè)精子懷孕率沒(méi)有差異，將冷凍的分離精子輸入子宮角與輸入子宮體的懷孕率沒(méi)有差異。盧克煥的研究表明:用性別分離精子進(jìn)行體外受精產(chǎn)生的胚胎，移植后產(chǎn)出表現(xiàn)正常的后代，而且性別決定準(zhǔn)確率達(dá)到90%。據(jù)美國(guó)XY公司報(bào)道，奶牛性控凍精配種產(chǎn)母率在90%以上。10 787頭青年母牛人工授精的受胎率為53%。據(jù)國(guó)內(nèi)報(bào)道，產(chǎn)母率達(dá)到92%，受胎率達(dá)到49%～68%，平均達(dá)到50%以上。因此，從分離準(zhǔn)確率及受胎率的影響考慮，性控凍精完全可以商業(yè)應(yīng)用。

2.2 具有快速繁育的優(yōu)勢(shì)

按照傳統(tǒng)的繁育方法，母牛的繁殖比例一般是每?jī)赡攴庇活^母犢，而一頭成年牛一生只能繁育3～4頭母犢。而使用XY分離精液就可以打破傳統(tǒng)的繁殖規(guī)律。據(jù)羅應(yīng)榮等應(yīng)用分離X精子冷凍精液對(duì)12頭供體母牛進(jìn)行輸精，獲得與未分離冷凍精液輸精后相近的超排母牛采集胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。對(duì)采集到的61枚胚胎進(jìn)行性別鑒定后，確定雌性胚胎的比例為100%，頭均獲得了可用胚胎5.5枚，11枚性控冷凍胚胎移植后，40 d以上的未返情率為63.6%。使用分選的X精子，結(jié)合人工授精技術(shù)就可以實(shí)現(xiàn)一頭母牛每年產(chǎn)一頭母犢，即一頭母牛一生生產(chǎn)6～8頭母犢。如果同時(shí)結(jié)合超數(shù)排卵技術(shù)與胚胎移植技術(shù)，生產(chǎn)體內(nèi)性控胚胎，理論上它的效率將是超數(shù)排卵、性別鑒定和胚胎移植效率的一倍，而且可以省去性別鑒定的過(guò)程，從而降低成本，并且可以減少在性別鑒定中對(duì)胚胎造成的損傷，提高胚胎移植成功率。

2.3 具有加快種群改良的優(yōu)勢(shì)

在育種工作中，種公牛的選擇強(qiáng)度遠(yuǎn)大于母牛的選擇強(qiáng)度，如果采用目前市場(chǎng)上所用的人工授精方法，選擇優(yōu)質(zhì)公牛精液，至少五代才能培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)奶牛。而應(yīng)用精子分選技術(shù)，在現(xiàn)有的條件下就可以加大母牛的選擇強(qiáng)度，加快遺傳進(jìn)展，根據(jù)上述的擴(kuò)增繁育方式，培育優(yōu)良種群的時(shí)間將可縮短到3年以下。這將極大地提高育種工作效率。

3 性控凍精人工授精技術(shù)要點(diǎn)

性控精液經(jīng)過(guò)XY精子的染色，多次篩選后對(duì)精子具有不同程度的損傷。性控凍精在制作時(shí)，分離時(shí)間延長(zhǎng)，從采精到冷凍要比常規(guī)凍精時(shí)間長(zhǎng)，因而精子的存活時(shí)間、受精能力會(huì)受到影響，比常規(guī)凍精受精能力稍低。Sartori等研究了用不同劑量的性控冷凍精液對(duì)超排青年母牛受精率和胚胎質(zhì)量的影響，結(jié)果不同劑量的X冷凍精子（2×107個(gè)/支∶1×107個(gè)/支）獲得可用胚胎數(shù)無(wú)明顯差異，但明顯低于常規(guī)精液的可用胚胎數(shù)。另外，使用X精子的青年母牛的受精率明顯低于常規(guī)精液組。表明X精子經(jīng)分離后受到一定程度的損傷，并影響超排青年母牛的受精率和胚胎的發(fā)育。因此性控凍精比常規(guī)凍精人工授精時(shí)間的把握要更加準(zhǔn)確，技術(shù)要求更加嚴(yán)格，具體規(guī)程如下。

3.1 參配牛必須健康

要求無(wú)生殖系統(tǒng)疾病及其他疾病，營(yíng)養(yǎng)均衡，體況適中，以青年牛為主，其次是健康經(jīng)產(chǎn)牛。

3.2 輸精時(shí)間更準(zhǔn)確

根據(jù)奶牛的年齡、營(yíng)養(yǎng)、體況、季節(jié)、發(fā)情持續(xù)期、卵泡發(fā)育程度掌握。排卵前3～5 h，發(fā)情結(jié)束后5～8 h，卵泡發(fā)育到有一觸即破時(shí)為最佳輸精時(shí)間。

3.3 輸精位置更確切

一般輸精位置在優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育側(cè)子宮角基部前2～3 cm處輸精，如果確定不準(zhǔn)就輸在子宮體內(nèi)，但不要輸在子宮頸內(nèi)3～5 cm處。

3.4 每個(gè)情期只輸精一次

由于性控凍精價(jià)格較高，兩次輸精是一種浪費(fèi)，同時(shí)也不利于適時(shí)輸精的掌握。牛只排一個(gè)卵，適時(shí)一次輸精完全可以找準(zhǔn)精卵結(jié)合的最佳時(shí)間。配種后返情的牛，要仔細(xì)分析情況，檢查是否有生殖疾病，如各種子宮炎癥，并及時(shí)治療，一般每頭牛最多做兩個(gè)情期輸精，以后結(jié)合治療再用常規(guī)凍精輸精。

3.5 輸精后發(fā)現(xiàn)炎癥及時(shí)治療

如果配種后發(fā)現(xiàn)有炎性分泌物，可以在輸精后1～6 h宮注抗生素，以提高受胎率（注意抗奶的處理）。

3.6 結(jié)合促排卵保胎激素藥物

可肌肉注射促排3號(hào)、絨毛膜促性腺激素、促黃體生成素等，促進(jìn)卵泡成熟排卵，縮短輸精后精卵結(jié)合時(shí)間。

3.7 做好配種記錄

每次輸精完畢，繁育員應(yīng)詳細(xì)填寫(xiě)配種繁殖記錄，內(nèi)容包括：母牛號(hào)、年齡、體況、胎次、發(fā)情時(shí)間、與配公牛號(hào)、輸精時(shí)間、輸精位置、產(chǎn)犢情況、繁育員簽字等。記錄詳細(xì)，真實(shí)可靠。

3.8 技術(shù)水平和責(zé)任心

要求人工授精員有較高的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，能通過(guò)外部觀察及直腸檢查準(zhǔn)確判斷發(fā)情牛所處的發(fā)情階段，能判斷卵巢上的優(yōu)勢(shì)卵泡，能掌握正確的輸精部位且適時(shí)輸精。能準(zhǔn)確判斷子宮炎癥并及時(shí)治療，會(huì)合理應(yīng)用激素類(lèi)藥物。

4 性控精液存在的問(wèn)題及應(yīng)用前景展望

人們對(duì)性別控制精液在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用期盼已久，近年來(lái)熒光活性細(xì)胞的分類(lèi)將該技術(shù)帶到了商業(yè)應(yīng)用的邊緣。但兩種限制因素依然存在，即分選的速度（可用性和價(jià)格）和受精率，還不能滿足國(guó)內(nèi)奶牛繁殖的需要。此外，性控精液的受孕率（含青年牛）約為35%～40%，而常規(guī)精液為55%～60%，限制了生產(chǎn)者應(yīng)用性控精液的積極性。到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞檢索儀分離精子對(duì)DNA等有明顯影響:Catt等研究發(fā)現(xiàn)，未見(jiàn)高濃度H33342和紫外線對(duì)DNA的內(nèi)源性缺口有影響；Seidel等認(rèn)為，染色與未染色精子在通過(guò)檢索儀后在運(yùn)動(dòng)性和DNA完整性方面無(wú)差異，使用流式細(xì)胞檢索儀進(jìn)行精子性別分離后產(chǎn)下的后代沒(méi)有明顯的表型或基因型變化。但一些試驗(yàn)報(bào)道表明，使用性別分離精子比非分離者授精后懷孕率低，其原因還不很清楚。還有學(xué)者認(rèn)為在精子分選過(guò)程中對(duì)精子細(xì)胞核的染色及紫外線的照射可能引起遺傳學(xué)損傷，因有研究表明，紫外線照射可引起小鼠精子異常率增加，低濃度的Hoechst33342可使金黃地鼠產(chǎn)生突變。因此對(duì)于性控精液安全性還需進(jìn)行深入研究。隨著研究的深入和相關(guān)生物技術(shù)的不斷發(fā)展，效果更穩(wěn)定的性別控制技術(shù)將成為現(xiàn)實(shí)，從而推動(dòng)我國(guó)畜牧業(yè)的前進(jìn)。□