侯文思，李玉潔，王媛媛，陶 虎

(1.西北農(nóng)林科技大學 理學院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100)

東方粘蟲中腸V-ATP酶A亞基突變體TSCA的原核表達及復性純化

侯文思1，李玉潔1，王媛媛2，陶 虎1

(1.西北農(nóng)林科技大學 理學院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100)

根據(jù)得到的東方粘蟲[Mythimnaseparate(Walker)]中腸V-ATPase A亞基(VHA-A)基因(VATPA)，預測其三維結構，構建定點突變并復性。利用Swiss-Model在線預測VHA-A三維結構，確定突變位點，通過重折疊PCR(Overlap-PCR)技術構建突變基因并將其整合到pET-22b(+)載體上，得到重組質粒pET-22b(+)-TSCA，轉入大腸桿菌BL21中表達，最后通過親和層析純化包涵體蛋白質并進行透析復性。結果表明，成功構建突變基因和融合表達載體，融合蛋白質以包涵體形式表達，并得到大量純化的可溶性蛋白。

V-ATP酶A亞基；定點突變；原核表達；包涵體復性

液泡型ATP酶(V-ATPase)是由14個不同亞基組成的復合體，作為持家基因廣泛分布于細胞膜系統(tǒng)中[1]。V-ATPase利用水解ATP釋放能量將H+轉運到囊泡或胞外，從而維持胞質pH的平衡，形成跨膜電化學勢梯度，為細胞活動的正常進行及各種離子和代謝物的轉運提供必不可少的條件[2]。在昆蟲中腸，V-ATPase存在于上皮杯狀柱細胞，是唯一的離子運輸啟動器，嚴格調控昆蟲中腸的離子運輸[3]。V-ATPase的缺失會導致昆蟲出現(xiàn)病理變化甚至死亡[4]。近年來越來越多的學者將V-ATP酶作為藥物靶標來研究[5]。已有學者利用Western雜交和質譜等方法鑒定出多種昆蟲中腸的V-ATP酶A亞基可以和蘇云金芽孢桿菌[Bacillusthuringiensis(Bt)]毒素結合。徐麗娜[6]通過雙向凝膠電泳、配體雜交等方法發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]幼蟲刷狀緣膜囊(Brush border membrane vesicles，BBMV )的V-ATP酶A亞基是Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah、Cry1Ie蛋白的結合位點。V-ATPase A 亞基是高度保守的催化亞基[7]，研究表明A亞基上walker A motif (GXXXXGKT) 特定殘基具有重要作用：將極端嗜熱桿菌V-ATPase A亞基第232位絲氨酸突變?yōu)楸彼?，?35位蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸能夠降低ADP反饋抑制，提高全酶催化活性[8]。目前，V-ATPase A亞基的重組表達已有文獻報道，如靳婷婷等[9]構建原核表達載體在大腸桿菌中表達玉米螟幼蟲中腸A亞基。已有的文獻[10-11]均顯示，原核表達的V-ATPase A亞基在大腸桿菌中均以包涵體形式存在，而利用真核系統(tǒng)表達蛋白質代價昂貴。本研究通過分析東方粘蟲[Mythimnaseparata(Walker)]中腸V-ATP酶A亞基核酸結合區(qū)域，篩選可能提高酶活力的氨基酸位點，進行基因定點突變，通過原核表達、包涵體復性等方法獲得大量可溶性蛋白質，為進一步研究東方粘蟲A亞基的結構與功能奠定基礎，也為相關抑制劑的開發(fā)和篩選新農(nóng)藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質粒 表達載體pET-22b(+)和大腸桿菌Turbo、BL21(DE3) 為西北農(nóng)林科技大學理學院蛋白質結構研究實驗室保存；克隆載體pMD 19-T-Simple購自TaKaRa公司；質粒pET-22b(+)-VATPA由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)藥所提供。

1.1.2 主要生化試劑TaqDNA Polymerase、T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ、DNA Marker、核酸酶均購于TaKaRa公司；Pfu DNA Polymerase、蛋白質Markers購于Thermo公司；膠回收試劑盒、廣譜蛋白Markers購于康為世紀公司；Bradford試劑盒購于天根生化科技有限公司；Ni-NTA agarose柱購于GE公司；其他相關試劑均為國產(chǎn)分析純，購自楊凌三力化玻站。

1.2 方 法

1.2.1 原核表達載體的構建與鑒定 以嗜熱桿菌(Thermusthermophiles,PDB:3GQ)A亞基氨基酸序列及其突變體TSSA為模板，利用NCBI Blast軟件，與東方粘蟲中腸V-ATPase酶A亞基序列比較，確定東方粘蟲中腸V-ATPase A亞基突變位點。根據(jù)選定的突變點C254突變?yōu)锳254，T257突變?yōu)镾257，設計引物(小寫部分為突變位點氨基酸對應密碼子)(表1)。

表1 重折疊PCR引物序列Table 1 Primers for Overlap-PCR

利用overlap PCR方法構建定點突變基因[12]，以pET-22b(+)-VATPA質粒為模板，引物F、RM，F(xiàn)M、R進行PCR擴增，分別擴增出上下游片段A、B；以等量的A、B基因為模板，引物F、R進行PCR擴增并回收。將回收的PCR產(chǎn)物加A尾后與pMD19-T-Simple連接，轉化至E.coliTurbo，提取質粒，將重組質粒與pET-22b(+)載體均進行NdeⅠ、HindⅢ雙酶切并連接，得到表達載體pET-22b(+)-TSCA，轉入E.coliTurbo，挑取單克隆進行PCR驗證后測序。

1.2.2 目的蛋白的誘導表達 將測序結果正確的表達載體轉化至E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞，并將其涂布于含氨芐青霉(Amp)的LB平板，過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆于5 mL含100 mg/L Amp的新鮮LB培養(yǎng)液中37 ℃過夜培養(yǎng)。次日以1% 接種量接種至50 mL含100 mg/L Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600≈ 0.6時，將培養(yǎng)物以每管5 mL分裝于4個無菌15 mL EP管中，分別加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1、0.2、0.5和1 mmol/L，于37 ℃誘導表達4 h。 6 000 r/min、4 ℃離心5 min 收集菌體，用PBS緩沖液重懸，超聲破碎，于12 000 r/min、4 ℃離心30 min，分別取37 ℃誘導上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 蛋白質復性與純化 參照文獻[13]，在37 ℃ 條件下以0.2 mmol/L的IPTG終濃度大量誘導(1 L液體LB培養(yǎng)基) pET-22b(+)-TSCA在大腸桿菌BL21中表達5 h，離心取菌體，用Lysis buffer(20 mmol/L Tris-HCl , 150 mmol/L NaCl pH 7.0)重懸，加溶菌酶至150 μg/mL，冰浴30 min，超聲破碎，加入0.5倍體積含15 g/L Triton X-100的洗滌液(100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.0)攪拌混勻，12 000 r/min、4 ℃ 離心30 min，棄上清。將沉淀用35 mL含5 g/L Triton X-100的洗滌液重懸，再用勻漿器研磨15 min，12 000 r/min、4 ℃ 離心30 min，棄上清。用不含Triton X-100的洗滌液重復上述步驟2次。洗滌后將包涵體溶解于35 mL溶解液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH 8.0)中，室溫攪拌2～3 h，12 000 r/min，4 ℃離心30 min，取上清，用0.22 μm濾膜過濾后溶液即為包涵體蛋白液。pET-22b(+)表達的融合蛋白C端含有一個His-tag，可使用Ni-NTA親和層析純化變性后包涵體蛋白。用結合緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH 8.0)平衡Ni-NTA層析柱，調節(jié)蛋白質樣品pH至8.0，以1.5 mL/min流速上樣，用洗滌緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH=6.3)洗去雜蛋白，用洗脫緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH 4.5)洗脫目的蛋白。收集的洗脫液用Bradford試劑盒測蛋白質質量濃度后于-80 ℃ 凍存。取適當體積Ni-NTA純化后蛋白質樣品用新鮮溶解液稀釋至終體積100 mL，終質量濃度0.1～0.2 mg/mL。稀釋后的蛋白質樣品于復性緩沖液Ⅰ(1 mol/L L-精氨酸，1 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)4 ℃透析24 h，12 000 r/min，4 ℃離心30 min，上清繼續(xù)用復性緩沖液Ⅱ (20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L 苯甲脒，pH 7.3)透析12 h，換新鮮溶液Ⅱ繼續(xù)透析，12 000 r/min，4 ℃離心 30 min，上清為復性成功的蛋白質。

2 結果與分析

2.1 同源建模和突變位點的選擇

選用與蛋白一級序列相似度最高(一致性65.24%)且已獲得3D蛋白結構的酵母V-ATP酶A亞基( PBD:3J9T )為模板，利用Swiss-Model( http://swissmodel.expasy.org/interactive )軟件進行同源建模，獲得東方粘蟲中腸V-ATPase A亞基三維結構模型(圖1)。

圖1 東方粘蟲中腸V-ATPase A亞基三維結構模擬圖Fig.1 Simulative tertiary structure ofMythimna separata subunit A

2.2 原核表達載體的構建與鑒定

提取重組質粒pET-22b(+)-TSCA轉入E.coliTurbo后，挑取陽性克隆并提取質粒，進行PCR驗證，電泳條帶與預期大小一致(圖2)，且質粒測序結果正確，重組質粒pET-22b(+)-TSCA構建成功。

M. DM 2000 DNA marker；1. pET-22b(+)-TSCA的PCR結果 Result of pET-22b(+)-TSCA gene by PCR

圖2 PCR驗證pET-22b(+)-TSCA表達載體

Fig.2 Identification of pET-22b(+)-TSCA expression vector by PCR

2.3 融合蛋白的表達

將測序驗證正確的pET-22b(+)-TSCA表達載體轉入BL21(DE3)表達菌株中，在37 ℃不同IPTG終濃度誘導該蛋白質表達。融合蛋白分子質量理論值約為69.7 ku，目的蛋白與廣譜蛋白標準比對條帶位置正確(圖3)。且不同誘導劑濃度下，菌體超聲破碎后的上清液中均沒有明顯的目的條帶，沉淀中有明顯的目的蛋白條帶。這表明絕大多數(shù)的蛋白以包涵體形式存在，且IPTG終濃度為0.2 mmol/L時沉淀中目的蛋白含量最大。

M. 蛋白質標準分子質量 Protein molecular weight marker; 1. 未經(jīng)IPTG誘導的細胞總蛋白質 Total cell proteins without induced by IPTG；2-9:不同濃度IPTG誘導后的上清液和沉淀，IPTG濃度分別為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L和1 mmol/L Supernatant and pellet induced by IPTG，and the inducer concentrations were 0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.5 mmol/L and 1 mmol/L

圖3 37 ℃下不同濃度IPTG表達蛋白的鑒定

Fig.3 Identification of TSCA expression at 37 ℃ under different IPTG concentration

2.4 包涵體的純化與復性

細胞裂解后的包涵體蛋白質用Triton X-100處理，再利用Ni-NTA層析柱純化，上樣后用洗雜蛋白液洗去部分雜蛋白(圖4-A、4-B)。透析液Ⅱ透析后的蛋白質為復性好的可溶性蛋白質，經(jīng)10% SDS-PAGE檢測為一條帶，且條帶位置與理論分子質量一致(圖4-C)。包涵體用8 mmol/L尿素溶解后，用bradford試劑盒測粗蛋白質樣品，其質量濃度為4.13 mg/mL，體積約為35 mL。復性好的蛋白質經(jīng)Bradford蛋白質點定量試劑盒測得質量濃度約為48 μg/mL，體積約為110 mL，一次復性效率約53%。培養(yǎng)1 L菌體最終可獲得純蛋白質約67 mg。

A. pET-22b(+)-TSCA融合蛋白表達分析 Analysis of the expression of pET-22b(+)-TSCA (M.蛋白質標準分子量 Protein molecular weight marker ; 1.未經(jīng)IPTG誘導的細胞總蛋白質 Total cell proteins without induced by IPTG ; 2.IPTG誘導的細胞總蛋白質 Total cell proteins induced by IPTG ; 3.細胞裂解后上清 Supernatant proteins of cell disruption ; 4.細胞裂解后沉淀 Pellet of cell disruption；5.洗滌后包涵體 Washed inclusion bodies); B.目的蛋白的純化檢測 SDS-PAGE of the purified proteins (M.蛋白質標準分子量 Protein molecular weight marker ; 1.Ni-NTA純化后蛋白質 Recombinant protein purified by Ni-NTA ); C.復性蛋白質的檢測 Analysis of the refolded proteins (M.蛋白質標準分子量 Protein molecular weight marker ; 1.重折疊蛋白質 Refolded proteins)

圖4 TSCA誘導表達與純化檢測

Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression and the purification of recombinant proteins

3 結論與討論

V-ATPase廣泛存在于真核細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)上，由胞內(nèi)的V1結構域和鑲嵌在膜上的V0結構域組成[14]。V 1由A～H 8個亞基組成，具有ATP水解作用；V0由a、d、e、c和c′′亞基組成，負責質子運輸。酵母包含1個額外的亞基c′[15]，更高級的真核生物則有額外的蛋白質Ac45[16]。V-ATPase A亞基是催化亞基[17]，由4個結構域組成：N端的β桶狀結構域，包含凸起的非同源結構域；中心的α/β結構域和C端結構域[18]。C端結構域包含Walker A motif、Walker B motif。Walker A motif與核酸結合有關，而Walker B motif與天冬氨酸介導的Mg2+反應有關[19-20]。

本試驗通過預測V-ATPase A亞基蛋白質三維結構，同源比對確定突變位點，利用over-lap PCR等分子生物學技術構建突變工程菌。在前期，對誘導溫度、時間和IPTG濃度進行摸索，期望能得到更多的可溶性蛋白質，但結果目的蛋白質絕大多數(shù)以包涵體形式存在?？赡苁且驗樵吮磉_系統(tǒng)缺乏引導多肽正確折疊的分子伴侶或者調解機制，使得蛋白質無法正確折疊，失去原有特性和功能，最終以包涵體形式存在。本試驗最終決定通過復性獲得可溶性目的蛋白，考慮到純化方法和復性步驟，選用pET-22b(+)構建表達載體，采取一步透析法，在透析液pH 8.0，添加終濃度為1 mol/L的L-精氨酸，獲得高收率的可溶性蛋白質。本試驗1 L菌體最終可得到67 mg左右較純的可溶性蛋白質，復性效率為53%，為后續(xù)研究V-ATP酶活性，A亞基的功能和結構，利用突變體TSCA篩選ATP酶抑制劑提供條件。

Reference：

[1] BEYENBACH K W,WIECZOREK H.The V-type H+ATPase:molecular structure and function,physiological roles and regulation[J].JournalofExperimentalBiology,2006,209(4):577-589.

[2] BRETON S,BROWN D.Regulation of luminal acidification by the V-ATPase[J].Physiology,2013,28(5):318-329.

[3] WIECZOREK H,GRUBER G,HARVEY W R,etal.Structure and regulation of insect plasma membrane H+-V-ATPase[J].JournalofExperimentalBiology,2000,203 (1):127-135.

[4] WIECZOREK H,BEYENBACH K W,HUSS M,etal.Vacuolar-type proton pumps in insect epithelia[J].JournalofExperimentalBiology,2009,212 (11):1611-1619.

[5] KARTNER N,MANOLSON M F.V-ATPase subunit interactions:the long road to therapeutic targeting[J].CurrentProtein&PeptideScience,2012,13(2):164-179.

[6] 徐麗娜.Cry1Ab抗性亞洲玉米螟對不同Bt毒素的交互抗性及其產(chǎn)生的分子機理[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學院,2010:34-58

XU L N.Cross-resistance and molecular mechanism of Cry1Ab-selectedOstriniafurnacalisto other Bt toxins[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2010:34-58( in Chinese with English abstract ).

[7] MA B Y,YUN X,LI Z A.Structural bases of physiological functions and roles of the vacuolar H+-ATPase[J].CellularSignalling,2011,23(8):1244-1256.

[8] IMAMURA H,FUNAMOTO S,YOSHIDA M,etal.Reconstitution in vitro of V1 complex ofThermusthermophilusV-ATPase revealed that ATP binding to the A subunit is crucial for V1 formation[J].JournalofBiologicalChemistry,2006,281(50):38582-38591.

[9] 靳婷婷,李 寧,王振營,等.亞洲玉米螟中腸Cry1Ac毒素結合蛋白V-ATP酶A亞基的研究[J].中國生物防治學報,2015,31(2):208-215.

JIN T T,LI N,W ZH Y,etal.Cloning and characterization of the CrylAc-binding V-ATPase subunit A in the Asian corn borer[J].ChineseJournalofBiologicalControl,2015,31(2):208-215(in Chinese with English abstract).

[10] 毛毅輝,李會勇,王天宇,等.玉米液泡ATP酶亞基A基因的克隆及表達分析[J].作物學報,2008,34(1):31-36.

MAO Y H,LI H Y,WANG T Y,etal.Cloning and expression analysis of a vacuolar ATPase subunit A gene in maize[J].ActaAgronomicaSinica,2008,34(1):31-36(in Chinese with English abstract ).

[11] HUNKE C,CHEN W J,SCHAFER H J,etal.Cloning,purification,and nucleotide-binding traits of the catalytic subunit A of the V1V0 ATPase fromAedesalbopictus[J].ProteinExpressionandPurification,2007,53(2):378-383.

[12] HECKMAN K L,PEASE L R.Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension[J].NatureProtocols,2007,2(4):924-32.

[13] 沈 琴,鄧漢卿,侯文思,等.人降鈣素受體胞外域的復性及新的體外活性測定方法[J].中國生物化學與分子生物學報,2014,30(9):942-947.

SHEN Q,DENG H Q,HOU W S,etal.Method of in vitro bioactivity assay for refolded human ectodomain of calcitonin receptor[J].ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology,2014,30(9):942-947(in Chinese with English abstract).

[14] FORGAC M.Vacuolar ATPases:rotary proton pumps in physiology and pathophysiology[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2007,8(11):917-929.

[15] ZHAO J H,BENLEKBIR S,RUBINSTEIN J L,etal.Electron cryomicroscopy observation of rotational states in a eukaryotic V-ATPase[J].Nature,2015,521(7551):241.

[16] COTTER K,STRANSKY L,MCGUIRE C,etal.Recent insights into the structure,regulation,and function of the V-ATPases[J].TrendsinBiochemicalSciences,2015,40 (10),611-622.

[17] CROSS R L,MULLER V.The evolution of A-,F-,and V-type ATP synthases and ATPascs:reversals in function and changes in the H+/ATP coupling ratio[J].FebsLetters,2004,576(1/2):1-4.

[18] MAHER M J,AKIMOTO S,IWATA M,etal.Crystal structure of A3B3 complex of V-ATPase fromThermusthermophilus[J].EmboJournal,2009,28(23):3771-3779.

[19] MARSHANSKY V,RUBINSTEIN J L,GRUBER G.Eukaryotic V-ATPase:Novel structural findings and functional insights[J].BiochimicaEtBiophysicaActa-Bioenergetics,2014.1837(6):857-879.

[20] MAEGAWA Y,MORITA H,IYAGUCHI D,etal.Structure of the catalytic nucleotide-binding subunit A of A-type ATP synthase from Pyrococcus horikoshii reveals a novel domain related to the peripheral stalk[J].ActaCrystallographica,2010,62(5):483-488.

(責任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Prokaryotic Expression, Refolding and Purification of V-ATPase Subunit A Mutant TSCA in the Midgut ofMythimnaseparate

HOU Wensi1, LI Yujie1, WANG Yuanyuan2and TAO Hu1

(1.College of Science, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China;2.College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100,China)

Based on V-ATPase A subunit gene(VATPA) in the midgut ofMythimnaseparate, three-dimensional structure was predicted, site-directed mutant was built and recombinant protein was obtained after renaturing.The protein structure of VHA-A was analyzed, three-dimensional structure was predicted by Swiss-Model online,and the mutation site was designed.The mutant gene was constructed with overlap PCR, and inserted into pET-22b(+) vector. The recombinant plasmid pET-22b(+)-TSCA was transformed intoE.coliBL21(DE3) for expression. After purified by Ni-NTA column, the inclusion body was renatured. The results showed the recombinant plasmid was successfully built, the fusion proteins were expressed as inclusion bodies, and the soluble proteins were successfully obtained in large scale.The study will facilitate the investigation of structure and function of V-ATPase subunit A and creation of environmental friendly pesticides.

V-ATPase subunit A; Designated mutation; Protein prokaryotic expression; Refolding of inclusion body

2016-05-29 Returned 2016-06-15

Special Talent Recruitment Fund of Northwest A&F University(No.Z111021101); the National Natural Science Foundation of China(No.21403168 )

HOU Wensi, female, master student. Research area:protein expression and purification. E-mail:956850986@qq.com

TAO Hu, male, professor, master supervisor.Research area:protein-protein interaction and structural resolution. E-mail:taohu@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-08-18

2016-05-29

2016-06-15

西北農(nóng)林科技大學引進人才專項資金(Z111021101 )；國家自然科學基金(21403168)。 第一作者：侯文思，女，碩士研究生，從事蛋白質表達和純化研究。E-mail:956850986@qq.com

陶 虎，男，教授，碩士生導師，從事蛋白質三維結構研究。E-mail：taohu@nwsuaf.edu.cn

Q786

A

1004-1389(2017)08-1248-05

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170818.0939.040.html