吳 陽，武 培，賴 珅，張九鋒，張小紅

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2．天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

硫酸二乙酯誘變螺旋霉素高產(chǎn)菌株的選育

吳 陽1,2，武 培2，賴 珅2，張九鋒2，張小紅1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2．天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

以一株螺旋霉素生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，使用硫酸二乙酯(DES)處理進(jìn)行誘變，獲得四株效價(jià)較高的突變株，其中有一株經(jīng)過5代后遺傳性狀穩(wěn)定。該菌株在搖瓶試驗(yàn)中能提高效價(jià)約6.5%左右，發(fā)酵生產(chǎn)中能提高放罐效價(jià)6%左右，該高產(chǎn)菌株的獲得對提高螺旋霉素發(fā)酵生產(chǎn)效率有著重要的意義。

螺旋霉素；DES；誘變

螺旋霉素(Spiramycin)為16元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，于1954年由法國Rhone-Poulenc實(shí)驗(yàn)室從Streptomces ambofaciens的代謝產(chǎn)物中分離而得[1]。為白色或微黃色粉末，微有味；微吸濕；易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，難溶于水。螺旋霉素具有強(qiáng)大的體內(nèi)抗菌作用和抗菌后效應(yīng)(PAE)，能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，其在組織細(xì)胞內(nèi)濃度較紅霉素高，而副作用小于紅霉素?？捎糜谥委熡筛锾m陽性菌和某些革蘭陰性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。螺旋霉素對耐青霉素的致病菌也具有較好的療效，在現(xiàn)代生活中有著廣泛的用途。本實(shí)驗(yàn)以一株螺旋霉素生產(chǎn)菌高產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，使用硫酸二乙酯(DES)進(jìn)行誘變處理，通過搖瓶和放罐培養(yǎng)中的效價(jià)檢測，以期篩選獲得高產(chǎn)菌株，為進(jìn)一步提高螺旋霉素的發(fā)酵生產(chǎn)效率提供菌株。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備

回轉(zhuǎn)式搖床機(jī)、1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、EclipseE200光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)。

螺旋霉素鏈霉菌G215，由天方藥業(yè)有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(%)：淀粉4.0，黃豆餅粉2，氯化鈉0.2,玉米漿0.7，碳酸鈣0.6，瓊脂2.0；121～123℃滅菌30min。

搖瓶種子培養(yǎng)基(%)：淀粉4.0，黃豆餅粉2，氯化鈉0.2,玉米漿0.7，碳酸鈣0.6；121～123℃滅菌30min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：淀粉5.0，黃豆餅粉2.5，氯化鈉0.6玉米漿1.2，碳酸鈣1.0；121～123℃滅菌30min。

15 L發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：淀粉5.0，黃豆餅粉2.5，氯化鈉0.6玉米漿1.2，碳酸鈣1.0；121～123℃滅菌30min。

2 方法

2.1 搖瓶種子培養(yǎng)

至2017我省栽培面積為50余萬畝，產(chǎn)量約17萬噸，種植面積居全國第4位。其中修文縣、水城縣、大方縣、福泉市等獼猴桃商品生產(chǎn)基地。目前，我省主栽紅肉品種（“紅陽”獼猴桃）和綠肉品種（“貴長”獼猴桃），此外，還有新種植的黃肉品種（“金圓”獼猴桃）等。獼猴桃的成熟期因其特性而異和地域存在差異，早熟的品種如紅陽獼猴桃一般集中在8月底成熟，中晚熟的品種如“貴長”和“米良一號”均在10月上旬成熟。

溫度(27.5±0.5)℃、時(shí)間46 h，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，濕度45%～60%。

2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

溫度(27.5±0.5)℃、時(shí)間120 h，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，濕度45%～60%。

2.3 15 L發(fā)酵培養(yǎng)

溫度(27.5±0.5)℃、時(shí)間120 h，起始轉(zhuǎn)速220 r/min，溶氧≥30%，根據(jù)溶氧調(diào)整轉(zhuǎn)速。

2.4 效價(jià)檢測方法

采用高效液相色譜法[2],螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品鑒定所。

2.5 DES的誘導(dǎo)過程[3]

(1)取DES原液0.4 mL于無菌試管中，加入少量乙醇使其溶解，再加入0.1 mol/L、pH值7.2的磷酸緩沖液19.6 mL，配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的溶液。

(2)用0.1 mol/L、pH值7.2的磷酸緩沖液將G215的新鮮斜面洗下，制成菌懸液，取等體積的2%DES溶液和菌懸液混合。

(3)在27～29℃下振蕩處理20～40min。

(4)誘變處理后加入2%的Na2S2O3溶液0.5 mL終止反應(yīng)。

(5)將菌懸液以生理鹽水至107/mL涂布平板，經(jīng)過培養(yǎng)后，挑取單菌落進(jìn)行篩選[4]。

3 結(jié)果與分析

3.1 突變菌株的平均效價(jià)

經(jīng)過搖瓶驗(yàn)證后共挑出四株效價(jià)較高的正突變株其分別為G21532(27℃，50min)，G21557(28℃40min)，G21579(28℃30min)，G21596(29℃30min)其平均效價(jià)與對照效價(jià)相比結(jié)果如表1。

表1 突變菌株的平均效價(jià)Table 1 The average titer of mutant strains

3.2 突變菌株經(jīng)過五代傳遞后的平均效價(jià)

將所得的4株正突變株經(jīng)過五代培養(yǎng)，其各代的平均效價(jià)見表2。從表2可以看出G21532和G21579菌株經(jīng)過三次傳代后遺傳性狀已不穩(wěn)定，G21596與對照菌相比已無優(yōu)勢，只有G21557突變株經(jīng)過五代傳遞后遺傳性況較為穩(wěn)定，但也略有下降，因此最終選定G21557為一較為穩(wěn)定的菌株。

表2 突變菌株經(jīng)過五代傳遞后平均效價(jià)對比Table 2 Average titer of the mutant strains after five generations of transmissio

3.3 突變株的穩(wěn)定性驗(yàn)證

利用15 L發(fā)酵罐對突變菌株G21557進(jìn)行放罐發(fā)酵試驗(yàn)，以驗(yàn)證其穩(wěn)定性，經(jīng)過三批次平行試驗(yàn)，其平均放罐效價(jià)見表3。從表3可以看出，G21557菌株在15 L發(fā)酵罐平均放罐效價(jià)較生產(chǎn)菌高出6%左右，且表現(xiàn)穩(wěn)定。

表3 15 L發(fā)酵罐穩(wěn)定性驗(yàn)證Table 3 Stability verification of 15L fermentor

4 結(jié)論

采用DES在28℃40min誘變，獲得4株效價(jià)較高的正突變株，進(jìn)一步篩選得到一株能夠穩(wěn)定傳代五代的正突變株G21557，其在15 L發(fā)酵罐中的平均放罐效價(jià)較生產(chǎn)菌高出6%左右，且表現(xiàn)穩(wěn)定。

從抗突變株的穩(wěn)定考察結(jié)果顯示，經(jīng)三代以后穩(wěn)定性有一定的退化。因此在以后的使用和菌種保藏過程中，要控制在傳代在三代以內(nèi)，及時(shí)做好菌種的分離純化工作，使菌株始終保持在穩(wěn)定的高產(chǎn)狀態(tài)。

[1] 羅 俊,高淑紅,陳長華,等.甲基化試劑對螺旋霉素發(fā)酵的影響[J].化學(xué)與生物工程,2011,28(5):46-50.

[2] 劉儉國,謝書琴,李翠萍,等.林可霉素發(fā)酵中生物氮素的替代作用[J]新課程學(xué)習(xí),2012(5):8-9.

[3] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].2005年版(二部).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：531.

[4] 何建勇. 發(fā)酵工藝學(xué)[M]. 2版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2009:25.

[5] 賴 珅,李維平,朱義斌,等.紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變吉他霉素高產(chǎn)菌株的選育[J].廣東化工,2015,42(7):13-14.

(本文文獻(xiàn)格式：吳 陽，武 培，賴 珅，等.硫酸二乙酯誘變螺旋霉素高產(chǎn)菌株的選育[J].山東化工,2017,46(11):49-50.)

山東化工在線投稿官網(wǎng) http://www.sdchem.net.cn

Breeding of DES Mutagenesis of Spiramycin Producing Strain

WuYang1,2,WuPei2,LaiShen2,ZhangJiufeng2,ZhangXiaohong1*

(1.Northwest A&F University, Yangling 712100,China; 2.Topfond Pharmaceutical Co.,Ltd., Zhumadian 463000,China)

A spiramycin-producing strain was mutated by dealing with diethyl sulfate (DES) in this study. Four hyper-producing mutants were obtained and one of them was still s
Table after five generation. The spiramycin titer produced by this mutant was increased approximate 6.5% in shaking flask cultivation and approximate 6.0% in scale-up fermentation,respectively.The obtained hyper-producing mutant is very significant for enhancing the spiramycin production.

spiramycin;DES;mutagenesis

2017-04-04

吳 陽(1981—)，男，河南駐馬店人，碩士研究生，工程師，主要從事抗生素發(fā)酵工作；*通訊作者：張小紅(1968—)，女，陜西商州人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，副研究員，主要研究方向：經(jīng)濟(jì)植物的組織培養(yǎng)及微體繁殖技術(shù)，植物細(xì)胞工程與作物遺傳改良。

TQ465.5

A

1008-021X(2017)11-0049-02