湯俊明， 劉奇， 王學(xué)才， 喬國洪

臨床與基礎(chǔ)研究

高分辨率熔解曲線分析技術(shù)檢測BRAF基因V600E突變方法的建立及初步臨床應(yīng)用

湯俊明， 劉奇， 王學(xué)才， 喬國洪

目的建立高分辨率熔解曲線分析技術(shù) (high resolution melting，HRM)檢測BRAF基因V600E突變的方法，并探討其在臨床檢測中的應(yīng)用價值。方法用所建方法檢測16例甲狀腺乳頭狀癌患者超聲引導(dǎo)下細針穿刺抽吸活檢標(biāo)本，并與測序法結(jié)果進行比較分析。結(jié)果所建HRM檢測方法Ct值與Tm的CV值均較小，重復(fù)性好。HRM法BRAF基因V600E突變檢測標(biāo)本的結(jié)果與測序法相比較，突變檢出率分別為43.75%和40.00%，敏感性為100.00%，特異性為90.00%。結(jié)論成功建立的HRM法檢測BRAF基因V600E突變敏感性高，特異性強，重復(fù)性好，操作簡便，節(jié)約時間，成本低，適合細針穿刺抽吸活檢標(biāo)本檢測BRAF基因V600E突變。

BRAF基因V600E； 癌, 乳頭狀 ； 甲狀腺乳頭狀癌； 高分辨率熔解曲線分析技術(shù)

甲狀腺乳頭狀癌(thyroidpapillary carcinoma，PTC)是甲狀腺癌中最常見的類型，占60%～80%[1]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌發(fā)病率增加的原因主要歸因于PTC 發(fā)病率的增加[2]。近年來，越來越多的學(xué)者深入研究PTC 分子機制認為，BRAF V600E 基因檢測聯(lián)合細針穿刺細胞學(xué)檢查(fineneedle aspiration cytology，F(xiàn)NAC)不僅能有效鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的良、惡性，而且對PTC 的診斷與預(yù)后具有較高的價值[3-5]。近年來興起的高分辨率熔解曲線分析技術(shù) (high resolution melting，HRM)是在實時熒光定量PCR 基礎(chǔ)上通過飽和熒光染料監(jiān)控核酸的熔解曲線變化進行分析的分子診斷技術(shù)[6]。我們采用HRM技術(shù)建立BRAF基因V600E突變的檢測方法，并用于檢測臨床標(biāo)本，探討其應(yīng)用價值。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本

2016年10月至2017年3月，宜興市人民醫(yī)院超聲引導(dǎo)下細針穿刺抽吸活檢標(biāo)本并經(jīng)病理確診PTC 16例，其中男7例，女9例，平均年齡57歲。穿刺標(biāo)本離心去上清，待用。用DNA FFPE 試劑盒 (德國Qiagen公司)提取離心后的穿刺標(biāo)本組織DNA，并保存于-20 °C備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物 設(shè)計適用于HRM技術(shù)檢測BRAF基因V600E突變的引物，引物序列如下：正向引物：5′-CTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3′，反向引物：5′-AGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGT-3′。

1.2.2 HRM反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 HRM技術(shù)檢測BRAF基因V600E突變反應(yīng)體系為：DNA模板，Light Cycler HRM Master Reaction Mix (瑞士Roche公司), 200 nM primers和3 mM MgCl2，總反應(yīng)體積20 μl。采用儀器為Roche Light Cycler 480 system。HRM技術(shù)檢測BRAF基因V600E突變擴增反應(yīng)條件為：先95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共45個循環(huán)(采用touchdown技術(shù)，前10個循環(huán)退火溫度從65 ℃降至55 ℃，每個循環(huán)降1 ℃)。擴增結(jié)束直接進行HRM分析，反應(yīng)條件為95 ℃1 min，40 ℃1 min，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從70 ℃到95 ℃，溫度上升速率為1 ℃/s。40 ℃冷卻。

1.2.3 檢測結(jié)果對比分析 HRM技術(shù)檢測BRAF基因V600E突變結(jié)果均與Sanger測序法檢測結(jié)果進行對比分析。分析其敏感性和特異性。

1.2.4 HRM檢測體系的重復(fù)性 選取經(jīng)Sanger測序法驗證的突變型和野生型標(biāo)本各1份，進行HRM檢測。每份突變型和野生型標(biāo)本各重復(fù)檢測3次，計算不同基因型標(biāo)本的Tm 與Ct值的CV值。

2 結(jié)果

2.1 HRM法和Sanger測序法檢測BRAF基因V600E突變

Sanger測序法檢測PTC標(biāo)本16例，其中1例標(biāo)本因提取的DNA質(zhì)量差而無法進行檢測，實際檢測15例，檢出BRAF基因V600E突變6例，檢出率40.00%。HRM法檢測PTC標(biāo)本16例，檢出BRAF基因V600E突變7例，檢出率43.75%。測序法無法進行檢測的標(biāo)本，HRM法可以進行檢測。HRM法突變檢出率略高于測序法。圖1和圖2為實驗中選取的HRM法與Sanger測序法檢測BRAF基因V600E突變示意圖。

圖1 HRM法檢測BRAF基因V600E突變示意圖

圖2 Sanger測序法檢測BRAF基因V600E突變示意圖

2.2 HRM法特異性和敏感性

HRM法檢測BRAF基因V600E突變與測序法相比，特異性為90%，敏感性為100%。其特異性和敏感性符合臨床檢測的要求。

2.3 重復(fù)性評價

野生型和突變型標(biāo)本經(jīng)HRM方法檢測后，其Tm 的CV值分別為0.03%和0.02%。Ct值的CV值分別為1.72%和1.46%，CV值均較小，可見HRM法檢測BRAF基因V600E突變穩(wěn)定性和重復(fù)性好。

3 討論

BRAF是重要的原癌基因之一。近年來，隨著有關(guān)PTC分子機制的研究深入，越來越多的研究表明，BRAF基因?qū)儆赗AF基因家族，其編碼的蛋白在RAS—RAF—MEK—ERK信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)途徑中起重要作用[7-8]。BRAF V600E 基因突變是PTC 形成與發(fā)展的重要分子改變。BRAF V600E 基因檢測聯(lián)合FNAC，不僅能有效鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的良、惡性，而且對PTC的診斷與預(yù)后具有較高的價值[5]。

目前臨床上進行BRAF基因V600E突變檢測多采用Sanger測序法、免疫組化法和ARMS法。作為金標(biāo)準(zhǔn)的測序法，其操作過程較繁瑣、耗時長、對操作技術(shù)要求較高。由于測序法本身的方法學(xué)限制，其檢測靈敏度有限，無法檢測DNA含量太低、基因突變比例太低的腫瘤樣本。免疫組化法同樣操作過程較繁瑣、耗時長,對標(biāo)本和操作技術(shù)要求較高。ARMS法操作簡便、靈敏，檢測周期短，但價格昂貴。因此，研究HRM技術(shù)檢測BRAF基因V600E突變很有必要。

HRM法的原理是在擴增含突變位點基因的過程中,由于突變位點不匹配會導(dǎo)致雙鏈 DNA在升溫過程中先解開,熒光染料從局部解鏈的 DNA分子上釋放, 從熒光強度與時間曲線上就可以判斷是否存在突變位點[9]。此法操作簡便，理論上靈敏度優(yōu)于Sanger測序法和免疫組化法，和ARMS法相當(dāng)，但價格低于ARMS法。

本研究中，HRM法檢測BRAF基因V600E突變檢出率達到43.75%，與其他學(xué)者報道一致[8, 10]。其中1例因提取的DNA質(zhì)量差而無法用Sanger測序法進行檢測的標(biāo)本，運用HRM法卻可以順利檢測，并且突變檢出率更高，初步顯示出HRM法的優(yōu)勢。實際臨床檢測工作中，對于細針穿刺抽吸活檢標(biāo)本造成DNA質(zhì)量不高的標(biāo)本，HRM法檢測BRAF基因V600E突變要優(yōu)于Sanger測序法和免疫組化法，同時相比ARMS法降低了成本。本研究因為樣本量小，HRM法的檢測靈敏度優(yōu)勢并不明顯，后續(xù)研究將加大樣本量。

綜上所述，HRM法具有敏感性高、特異性強、重復(fù)性好、操作簡便、節(jié)約時間及成本低的特點，適合細針穿刺抽吸活檢標(biāo)本檢測BRAF基因V600E突變。

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EstablishmentandprimaryclinicalapplicationofdetectingBRAFV600EmutationsbyHRManalysis

TANGJunming,LIUQi,WANGXuecai,QIAOGuohong.

(ClinicalLaboratory,YixingPeople’sHospital,Yixing214200,China)

QIAOGuohong,Email:staff1000@yxph.com

ObjectiveTo establish a method for detecting BRAF V600E mutations by high resolution melting (HRM) analysis and to evaluate its clinical application value.MethodsUltrasound guided fine-needle aspiration biopsy tissues of 16 patients with papillary thyroid carcinoma were detected by HRM. The results of HRM were compared with direct sequencing method.ResultsAccording to the repeatability analysis, the value of coefficient of variance (CV) of Tm and Ct was very small which with good repeatability. The total BRAF V600E mutation rate was 40.00% detected by direct sequencing and 43.75% detected by HRM. The sensitivity of HRM assay was 100.00%, the specificity of HRM assay was 90.00%.ConclusionsThe method for detection of BRAF V600E mutations by HRM analysis was established successfully. It is appropriate for detecting BRAF V600E mutations by HRM analysis. It possesses high specificity, good sensitivity, strong reproducibility, simple operation, saving time and low cost quality.

BRAF V600E; Carcinoma, papillary; Papillary thyroid carcinoma; High resolution melting analysis

無錫市衛(wèi)計委面上項目(No.MS201536)

214200 江蘇 宜興，宜興市人民醫(yī)院 檢驗科

喬國洪，Email：staff1000@yxph.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.04.010

1674-4136(2017)04-0243-03

2017-03-31] [本文編輯：欽嫣]