基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

牟永瑩顧培明馬博閆文秀王道平潘映紅

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京 100081；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150036）

技術(shù)與方法

基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

牟永瑩1，2顧培明1馬博1閆文秀1王道平1潘映紅1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京 100081；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150036）

蛋白質(zhì)組定量分析技術(shù)是支撐蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一，隨著蛋白質(zhì)組定量分析技術(shù)的發(fā)展，基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要分支。蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)可分為非靶向定量和靶向定量兩類，靶向定量技術(shù)有MRM和PRM模式，非靶向定量技術(shù)有非標(biāo)記定量和體內(nèi)外標(biāo)記定量模式，目前使用最多的同位素標(biāo)記試劑是iTRAQ和TMT。蛋白質(zhì)組定量技術(shù)按數(shù)據(jù)采集模式還可分DDA和DIA兩類。通過對國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)收集和分析，系統(tǒng)介紹了蛋白質(zhì)組質(zhì)譜定量技術(shù)的主要特點(diǎn)和發(fā)展現(xiàn)狀，旨在為生命科學(xué)研究者更好地應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)提供幫助。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)；靶向定量；穩(wěn)定同位素標(biāo)記；非標(biāo)記定量；翻譯后修飾定量

蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是一門在器官、組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上研究完整蛋白質(zhì)組表達(dá)、翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)間相互作用的新興學(xué)科。隨著人類及多種模式生物基因組全序列測定工作的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)在后基因組時(shí)代迅速興起［1-4］。早期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在定性分析方面，隨著研究的不斷深入，提供蛋白質(zhì)種類和修飾類型等定性信息的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)已經(jīng)不能滿足實(shí)際研究需求，因此基于不同原理的蛋白質(zhì)組定量技術(shù)被陸續(xù)開發(fā)［5-7］?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)組定量分析主要基于雙向電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）［8，9］和質(zhì)譜（Mass spectrometry，MS）［10，11］兩大類技術(shù)，近10年來隨著高精度生物質(zhì)譜技術(shù)和數(shù)據(jù)處理技術(shù)的快速發(fā)展，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組定量技術(shù)已成為主流的分析手段［12］。本文介紹了目前基于質(zhì)譜的主要蛋白質(zhì)組定量技術(shù)和一些常用的數(shù)據(jù)處理軟件，以及定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在翻譯后修飾蛋白質(zhì)定量中的應(yīng)用。

1 基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)概況

蛋白質(zhì)組定量分析在起步階段主要依賴2-DE技術(shù)，通過分析膠圖上分離到的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)則通過對酶切肽段的液相色譜分離和質(zhì)譜分析完成定量。根據(jù)是否對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)可分為非靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)（Untargeted quantitative proteomics）和靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)（Targeted quantitative proteomics），其中靶向定量技術(shù)包括多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（Multiple reaction monitoring，MRM）和平行反應(yīng)監(jiān)測（Parallel reaction monitoring，PRM），非靶向定量技術(shù)包括非標(biāo)記定量和穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量，穩(wěn)定同位素標(biāo)記又可分為多種模式，最值得關(guān)注的是等重同位素標(biāo)記相對和絕對定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）和串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（Tandem mass tags，TMT）技術(shù)（圖1）。涉及定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的文獻(xiàn)近年來顯著增長，以proteomics和PRM/MRM/iTRAQ/TMT/Label-free為關(guān)鍵詞，分別統(tǒng)計(jì)NCBI PubMed “Title/Abstract” 中包含各組關(guān)鍵詞的文獻(xiàn)數(shù)量，發(fā)現(xiàn)目前應(yīng)用最多的是iTRAQ定量和非標(biāo)定量技術(shù)，TMT標(biāo)記技術(shù)和靶向定量技術(shù)的應(yīng)用也快速增長，顯示了定量蛋白質(zhì)組學(xué)強(qiáng)勁的發(fā)展趨勢（圖2）。目前質(zhì)譜定量技術(shù)主要采取數(shù)據(jù)依賴采集模式（Data dependent analysis，DDA），新發(fā)展的數(shù)據(jù)非依賴采集模式（Data independent analysis，DIA）綜合了DDA和其他方法的優(yōu)勢，具有更好的分析準(zhǔn)確度和動(dòng)態(tài)范圍，也值得重點(diǎn)關(guān)注。

圖1 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分類圖

2 非靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

非靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種對樣品中所有蛋白進(jìn)行無差別分析的定量技術(shù)。根據(jù)是否對蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行標(biāo)記，非靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可分為非標(biāo)記（Label-free）和標(biāo)記（Stable isotope labeling）定量技術(shù)。

圖2 2004年-2016年基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量變化趨勢圖

2.1 非標(biāo)記定量技術(shù)

非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要通過計(jì)算蛋白肽段匹配的二級(jí)譜圖鑒定數(shù)目和一級(jí)質(zhì)譜峰面積進(jìn)行相對定量，使用該技術(shù)的優(yōu)勢在于成本低廉和樣品制備簡單。

2.1.1 基于二級(jí)譜圖的非標(biāo)記定量技術(shù) 基于二級(jí)譜圖的非標(biāo)記定量技術(shù)采用匹配肽段的譜圖計(jì)數(shù)（Spectrum counting）實(shí)現(xiàn)蛋白定量。質(zhì)譜分析肽段混合物樣品時(shí)，某一肽段被鑒定到的幾率與其在混合物中的豐度成正比，豐度高的蛋白質(zhì)被檢測到的肽段數(shù)和二級(jí)譜圖數(shù)會(huì)更多，基于這一原理的方法叫做譜圖計(jì)數(shù)法［13］。Gao等［14］早期發(fā)展的肽段鑒定數(shù)目技術(shù)（Peptide hits technology）即利用不同樣品中肽段數(shù)目的比值對蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量，后期Griffin等［15］整合肽段數(shù)目、譜圖數(shù)目及二級(jí)碎片離子強(qiáng)度這3種質(zhì)譜豐度特征，開發(fā)和測試了歸一化非標(biāo)記定量方法（Normalized spectral index）消除了質(zhì)譜重復(fù)測量之間的差異，提高了分析結(jié)果的重復(fù)性。傳統(tǒng)的譜圖計(jì)數(shù)法利用質(zhì)譜鑒定到的全部肽段進(jìn)行定量，而部分肽段可能屬于兩個(gè)或多個(gè)蛋白共有的非特異性肽段，因此定量的準(zhǔn)確性會(huì)受到影響。2015年，Zhang等［16］提出使用每個(gè)蛋白質(zhì)的特征肽段進(jìn)行定量，可有效提高非標(biāo)記定量的準(zhǔn)確性，在樣本中加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白還可以進(jìn)行絕對定量。2.1.2 基于一級(jí)譜圖的非標(biāo)記定量技術(shù) 基于一級(jí)質(zhì)譜的非標(biāo)記定量的依據(jù)是質(zhì)譜峰面積強(qiáng)度（Peak area intensity），其原理最早由Chelius等［17］提出并驗(yàn)證，即每條酶解多肽的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度與其濃度相關(guān)，因此比較一級(jí)譜圖中的離子信號(hào)強(qiáng)度或峰面積，就能確定不同樣品中對應(yīng)蛋白質(zhì)的相對含量，這類方法被稱為離子強(qiáng)度法或信號(hào)強(qiáng)度法。Silva等［18］最先發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)濃度與其所含的3個(gè)信號(hào)最強(qiáng)肽段的質(zhì)譜信號(hào)平均值呈線性相關(guān)，受到Silva的啟發(fā)，Grossmann等［19］根據(jù)類似原理拓展了T3PQ（Top 3 Protein Quantification）非標(biāo)記定量計(jì)算方法，并證明該方法適用于DDA所采集的數(shù)據(jù)，可用于蛋白質(zhì)的相對和絕對定量。伴隨著質(zhì)譜技術(shù)和軟件的發(fā)展，基于一級(jí)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)已得到較廣泛的應(yīng)用，近年來一系列配套的數(shù)據(jù)處理軟件和程序也應(yīng)運(yùn)而生，如SAINT-MS1［20］，QPROT［21］，RIPPER［22］等。

2.2 標(biāo)記定量技術(shù)

標(biāo)記定量的主要策略是向不同蛋白質(zhì)或多肽樣品中引入具有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的小分子，通過同位素標(biāo)記后所產(chǎn)生的質(zhì)量差來識(shí)別肽段的來源。在同一次質(zhì)譜掃描中化學(xué)性質(zhì)相同的標(biāo)記肽段離子化效率和碎裂模式也相同，因此比較不同的同位素標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)度就可以計(jì)算出不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量［23］。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于將不同樣本混勻后同時(shí)進(jìn)行質(zhì)譜檢測，可以避免樣品前處理所帶來的定量誤差。根據(jù)引入同位素標(biāo)記方式的不同，同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分為體內(nèi)標(biāo)記和體外標(biāo)記兩類。

2.2.1 體內(nèi)標(biāo)記定量技術(shù) 經(jīng)典的體內(nèi)標(biāo)記定量技術(shù)是穩(wěn)定同位素氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）［24］，該技術(shù)的基本原理是將輕、重同位素標(biāo)記的必需氨基酸（通常為賴氨酸和精氨酸）分別加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，經(jīng)過5-6個(gè)倍增周期，細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)氨基酸幾乎完全被穩(wěn)定同位素標(biāo)記，根據(jù)混合樣品中兩種同位素標(biāo)記肽段呈現(xiàn)的峰強(qiáng)度或面積比例即可實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的精確定量。SILAC技術(shù)在蛋白層次對樣本進(jìn)行混勻，可以有效避免后續(xù)酶解等操作所帶來的定量誤差，具有標(biāo)記效率高和定量準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，主要缺點(diǎn)是存在同位素標(biāo)記的精氨酸代謝轉(zhuǎn)換成脯氨酸的現(xiàn)象［25］，導(dǎo)致標(biāo)記效率偏低，定量準(zhǔn)確性下降，同時(shí)該技術(shù)早期只適用于活體培養(yǎng)的細(xì)胞，對于醫(yī)學(xué)研究常用的組織、體液等樣品則無法應(yīng)用。為了克服上述缺點(diǎn)，在SILAC的基礎(chǔ)上發(fā)展出了一些新的技術(shù)。Super-SILAC技術(shù)［26］將SILAC標(biāo)記方法培養(yǎng)的細(xì)胞作為內(nèi)標(biāo)加入到人組織樣品中，實(shí)現(xiàn)對臨床組織樣品的定量分析，擴(kuò)大了SILAC技術(shù)的應(yīng)用范圍。最近，Coon研究組將中子編碼（Neutron encoding，NeuCode）與SILAC技術(shù)結(jié)合發(fā)展為NeuCode SILAC［27］，提高了標(biāo)記效率，使蛋白質(zhì)組分析具有良好的動(dòng)態(tài)范圍和精度，理論上可達(dá)到39重標(biāo)記。

2.2.2 體外標(biāo)記定量技術(shù) 基于代謝反應(yīng)的體內(nèi)標(biāo)記定量技術(shù)存在著耗時(shí)長、價(jià)格貴等問題，因而發(fā)展出一系列體外標(biāo)記定量技術(shù)，其中在樣品處理后期進(jìn)行酶促標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

2.2.2.1 酶促標(biāo)記技術(shù)18O酶促標(biāo)記技術(shù)由Fenselau實(shí)驗(yàn)室首次應(yīng)用［28］，這種技術(shù)通過胰蛋白酶的催化作用將一組樣品的肽段C末端16O原子替換成

18O，從而使兩組樣品產(chǎn)生分子量的差異，通過比較標(biāo)記肽段和未標(biāo)記肽段的峰面積，即可對蛋白樣本進(jìn)行定量。該技術(shù)具有價(jià)格低廉、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是標(biāo)記穩(wěn)定性差且易發(fā)生18O-16O回標(biāo)反應(yīng)。為了解決這一問題，近年來對該方法進(jìn)行了一系列完善和改進(jìn)。Zhao等［29］采用微波加熱提高反應(yīng)速率，使用高濃度還原劑和烷基化試劑將胰蛋白酶滅活，有效提高了18O的標(biāo)記效率并抑制了18O-16O回標(biāo)反應(yīng)。Modzel等［30］提出了一種用18O和二甲氨基偶氮苯甲酰（Dabsyl）雙重標(biāo)記肽段的新方法，該方法廉價(jià)高效，且定量可信度高。顏輝［31］也報(bào)道在18O標(biāo)記肽段的C端的同時(shí)，用金屬標(biāo)記肽段的N末端，實(shí)現(xiàn)雙重等重標(biāo)記，結(jié)合MRM技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對定量，可提高定量的準(zhǔn)確性。

2.2.2.2 化學(xué)標(biāo)記技術(shù) 化學(xué)標(biāo)記技術(shù)利用化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)或肽段上引入同位素基團(tuán)實(shí)現(xiàn)樣品標(biāo)記，是發(fā)展最快的一類體外標(biāo)記定量技術(shù)，目前在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。這類技術(shù)依據(jù)標(biāo)記基團(tuán)和檢測方法不同有多種類型，常見的有基于一級(jí)質(zhì)譜的同位素親和標(biāo)簽（Isotope coded affinity tags，ICAT）技術(shù)和二甲基化標(biāo)記（Dimethyl Labeling）技術(shù)，以及基于串級(jí)質(zhì)譜的iTRAQ技術(shù)和TMT技術(shù)。

基于一級(jí)質(zhì)譜的化學(xué)標(biāo)記技術(shù)直接在一級(jí)質(zhì)譜譜圖中比較輕重標(biāo)記樣品的峰面積或強(qiáng)度，目前在定量蛋白質(zhì)組分析領(lǐng)域應(yīng)用不多。Gygi等［32］發(fā)展了一種針對半胱氨酸巰基（-SH）的ICAT試劑，這一試劑由反應(yīng)基團(tuán)、連接基團(tuán)和生物素標(biāo)簽組成，可用于定量比較細(xì)胞和組織中球蛋白的表達(dá)，使蛋白質(zhì)組分析更簡單、準(zhǔn)確和快速。但I(xiàn)CAT技術(shù)無法用于不含巰基的蛋白或肽段的定量分析，這一缺點(diǎn)導(dǎo)致其應(yīng)用范圍受限。二甲基化標(biāo)記技術(shù)由Hsu等［33］提出，其原理是利用甲醛和氰基硼氫化鈉組合標(biāo)記肽段所有的活性氨基，具有快速、高效、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。最近，Wu等［34］將甲醛和氰基硼氫化鈉分子上的H用D取代，甲醛上的12C用13C取代，組成五重標(biāo)記試劑，可極大地提高標(biāo)記效率。

基于串級(jí)質(zhì)譜的化學(xué)標(biāo)記技術(shù)通過比較二級(jí)或者三級(jí)質(zhì)譜譜圖中不同樣品的定量報(bào)告離子的峰強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)定量分析，是目前主流的蛋白質(zhì)組標(biāo)記定量技術(shù)。等重同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ）是Ross等［35］發(fā)展的一種體外同位素標(biāo)記的相對定量技術(shù)，該技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，具有通量高、穩(wěn)定性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)比較最多達(dá)八組樣品的蛋白表達(dá)量。串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（TMT）試劑［36］與iTRAQ試劑的原理類似，由報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)這3部分組成（圖3）。常用的TMT試劑盒有2-plex、6-plex和10-plex三種，前兩者分別標(biāo)記2組和6組樣品，10-plex通過使用報(bào)告離子質(zhì)荷比差異為6mDa的中子標(biāo)簽可標(biāo)記10組樣品［37］。目前TMT試劑在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用也比較多，這類定量技術(shù)可以結(jié)合其他標(biāo)記技術(shù)和高分辨質(zhì)譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)更高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析。例如，Dephoure等［38］將TMT技術(shù)與SILAC相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了18重（chong）（18-plex）標(biāo)記，再配合高分辨率的質(zhì)譜儀，可對多種蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量分析。Wojdyla等［39］利用TMT標(biāo)記和抗體富集方法對半胱氨酸氧化及其逆反應(yīng)進(jìn)行組合分析，這一方法替代了現(xiàn)有的半胱氨酸氧化分析法，有助于了解半胱氨酸亞硝基化（S-nitrosylation，SNO）和亞磺?；⊿-sulfenylation，SOH）之間的關(guān)系。Zhang［40］還提出了一種增強(qiáng)各種同位素標(biāo)記數(shù)據(jù)可比性的方法，可顯著提高現(xiàn)有iTRAQ 4-plex、iTRAQ8-plex、TMT6-plex和TMT 10-plex結(jié)果的應(yīng)用價(jià)值。

圖3 TMT 10-plex和iTRAQ 8-plex構(gòu)成

傳統(tǒng)的iTRAQ與TMT技術(shù)均使用二級(jí)譜圖（MS2）進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，但由于母離子共篩選（coisolation）和共碎裂（co-fragment）干擾，定量結(jié)果的準(zhǔn)確度會(huì)受到影響。三級(jí)質(zhì)譜（MS3）定量利用高分辨率的多功能質(zhì)譜選擇目標(biāo)離子進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離（Collision-Induced Dissociation，CID），然后從中過濾出信號(hào)最強(qiáng)的MS2碎片離子，進(jìn)一步進(jìn)行高能碰撞解離（High energy collision dissociation，HCD），利用MS3譜圖進(jìn)行定量，有效降低了母離子共篩選和共碎裂干擾的影響［7］。與MS2定量技術(shù)相比，MS3定量的問題是采集速度較慢，離子碎裂效率較低，導(dǎo)致定量蛋白質(zhì)數(shù)目減少，定量靈敏度下降。為解決這一問題，Dayon等［41］提出將氣相色譜分離（Gas-phase fractionation，GPF）與MS3分析模式結(jié)合，并證明在使用GPF與MS3結(jié)合分析TMT標(biāo)記的胰蛋白酶時(shí)，定量的精度、準(zhǔn)確度和蛋白質(zhì)組覆蓋率均有所提高。McAlister等［42］提出的MultiNotch MS3定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，采集報(bào)告離子數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)MS3的10倍，增加了報(bào)告離子動(dòng)態(tài)范圍，降低報(bào)告離子的方差，極大提高了定量蛋白數(shù)目和準(zhǔn)確度。

3 靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)

傳統(tǒng)的非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)的重復(fù)性、靈敏度和分析效率較低，值得慶幸的是，近年來可彌補(bǔ)上述質(zhì)譜定量缺陷的靶向定量技術(shù)取得了長足的進(jìn)步［43］。目前文獻(xiàn)報(bào)道的靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要有多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（MRM，又稱選擇反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)Selected reaction monitoring，SRM）和平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（PRM）。

3.1 多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)

MRM/SRM技術(shù)選擇目標(biāo)蛋白的特定母離子和子離子對，進(jìn)行質(zhì)譜分析，最大限度排除干擾離子的影響，顯著提高了目標(biāo)肽段的信噪比，是一種很有前景的高通量靶向蛋白定量技術(shù)。該技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為質(zhì)譜定量的“金標(biāo)準(zhǔn)”，特別適用于標(biāo)志蛋白的高通量驗(yàn)證。Dominik等［44］以基于MRM的多重累積方法在人血漿中成功地定量監(jiān)測了67個(gè)心血管疾病的生物標(biāo)志物，Whiteaker等［45］將SRM與基于抗體的免疫親和富集相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣品中目標(biāo)蛋白的精準(zhǔn)定量。MRM技術(shù)還可對目標(biāo)蛋白進(jìn)行絕對定量，如Gerber等［46］通過向樣本中摻入已知濃度的合成同位素標(biāo)準(zhǔn)肽段，實(shí)現(xiàn)了對人的分離酶蛋白（Human separase protein）的絕對定量。

3.2 平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)

PRM也可在復(fù)雜樣品中同時(shí)對多個(gè)目標(biāo)蛋白進(jìn)行相對或者絕對定量。與MRM相比，PRM采集目標(biāo)肽段的高分辨率MS2質(zhì)譜圖后，使用相關(guān)軟件在ppm級(jí)別的質(zhì)量偏差窗口范圍內(nèi)對定量子離子進(jìn)行峰面積抽提，可以有效排除背景離子的干擾。Kim等［47］利用該技術(shù)分析檢測了83個(gè)酪氨酸激酶，Ronsein等［48］的研究也證明PRM定量的動(dòng)態(tài)范圍較廣且精度較高。PRM技術(shù)的缺點(diǎn)是待分析肽段的數(shù)量過大時(shí)，需要精細(xì)調(diào)整質(zhì)譜采集參數(shù)，否則會(huì)極大影響定量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。2015年，Gallien等［49］設(shè)計(jì)了一種內(nèi)標(biāo)觸發(fā)并聯(lián)反應(yīng)監(jiān)測新方法（Internal standard triggered-parallel reaction monitoring，ISPRM），通過添加內(nèi)標(biāo)和對采集參數(shù)的實(shí)時(shí)調(diào)整來定量內(nèi)源肽段，在完成大量肽段分析的同時(shí)也可使質(zhì)譜始終保持高性能狀態(tài)。

4 數(shù)據(jù)依賴和非依賴采集技術(shù)

數(shù)據(jù)依賴采集技術(shù)（DDA）已廣泛的用于復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)的定性和定量分析，然而DDA一級(jí)掃描過程中隨機(jī)選擇肽段進(jìn)行裂解時(shí)總是偏向信號(hào)強(qiáng)的肽段，因此易造成低豐度肽段的丟失。隨著高分辨率，高掃描速度質(zhì)譜的出現(xiàn)，數(shù)據(jù)非依賴采集技術(shù)（DIA）越來越受到重視，并入選《Nature Methods》2015年度最值得關(guān)注技術(shù)。DIA采集數(shù)據(jù)時(shí)，首先將質(zhì)譜掃描的整個(gè)質(zhì)量軸切割為若干區(qū)域，使用四級(jí)桿或者離子阱將各個(gè)區(qū)域的母離子篩選出來，再利用高分辨質(zhì)譜采集該區(qū)域范圍內(nèi)所有母離子的全部碎片離子信息，最后根據(jù)DDA的譜圖庫信息抽提出DIA數(shù)據(jù)中對應(yīng)的子離子信息用于最終的定量分析。簡單來說，在任意一個(gè)洗脫時(shí)間點(diǎn)，DDA模式通常按照離子強(qiáng)度由高到低采集母離子的碎片離子信息，采集結(jié)果具有一定隨機(jī)性；DIA模式在整個(gè)檢測時(shí)間內(nèi)，將整個(gè)質(zhì)量軸切割為固定的幾個(gè)部分，按照順序進(jìn)行檢測，所有母離子碎片離子均采集；MRM模式在設(shè)定的時(shí)間窗口內(nèi)僅僅對某些特定母離子采集特定或者全部的碎片離子（圖4）。與DDA相比，DIA可對樣品中所有離子的碎片信息進(jìn)行無偏向性的數(shù)據(jù)采集，提升了定量結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性［50］；與MRM/PRM相比，DIA數(shù)據(jù)采集不受指定目標(biāo)肽段的限制，可用于未知蛋白和大規(guī)模蛋白的定量分析［51］。

圖4 DDA、DIA和MRM的原理比較圖

DIA技術(shù)是一種高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，特別適合于臨床生物標(biāo)志物的研究，如Zhong等［52］采用DIA技術(shù)篩選出了結(jié)核病的潛在血清標(biāo)志物；Muntel等［53］開發(fā)了快速可靠的尿蛋白質(zhì)組學(xué)DIA技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在現(xiàn)有的DIA技術(shù)中，SWATH（Sequential window acquisition of all theoretical spectra）策略已被較廣泛應(yīng)用，Gillet等［54］使用該技術(shù)對酵母全細(xì)胞蛋白進(jìn)行了定量分析；Ortea等［55］利用SWATH-MS和靶向數(shù)據(jù)提取技術(shù)發(fā)現(xiàn)了肺腺癌的潛在蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。DIA可實(shí)現(xiàn)對所有母離子的檢測，但選擇性相對于DDA或MRM降低了5-10倍，采集的MS2譜圖為所有母離子的碎片離子，易造成子離子定量數(shù)據(jù)的混亂。Egertson等［6］開發(fā)的msxDIA技術(shù)，可以使得母離子的選擇性提高5倍，降低數(shù)據(jù)處理的復(fù)雜度。Tsou等［56］開發(fā)的DIA-Umpire軟件，首先對DIA數(shù)據(jù)進(jìn)行母離子-子離子峰匹配，將DIA數(shù)據(jù)“轉(zhuǎn)換”為Pseudo-MS/MS MGF 文件，然后使用其他DDA搜庫軟件進(jìn)行檢索并將該檢索結(jié)果作為譜圖庫，最后再使用DIA-umpire軟件對DIA數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積抽提定量分析，與傳統(tǒng)的DIA數(shù)據(jù)處理模式相比其優(yōu)勢在于研究者無需采集DDA數(shù)據(jù)用于構(gòu)建譜圖庫。毫無疑問，克服了DDA隨機(jī)性和MRM低通量缺點(diǎn)的DIA/SWATH技術(shù)，將成蛋白質(zhì)組定量和標(biāo)志蛋白發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證的強(qiáng)有力工具。但任何一種技術(shù)都不是完美無缺的，需要根據(jù)實(shí)際情況選擇適用的定量技術(shù)（表1）。

5 翻譯后修飾蛋白定量技術(shù)

生物體細(xì)胞對蛋白質(zhì)合成后進(jìn)行的共價(jià)加工即翻譯后修飾（Post-translational modification，PTM）與許多重要的生命進(jìn)程控制相關(guān)，因此全面揭示翻譯后修飾的發(fā)生規(guī)律才能理解蛋白質(zhì)復(fù)雜多樣的生物功能。蛋白質(zhì)發(fā)生翻譯后修飾時(shí)其分子質(zhì)量會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，如發(fā)生磷酸化修飾時(shí)分子量會(huì)增加79.966 Da，通過質(zhì)譜可對翻譯后修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定性與定量研究。常見的PTM有磷酸化、乙酰化、泛素化和糖基化翻譯后修飾，分析流程基本相同，主要涉及修飾蛋白質(zhì)或修飾肽段富集，以及修飾位點(diǎn)的定性和定量檢測。

5.1 磷酸化修飾蛋白定量

磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾技術(shù)最為重要的一種形式。真核生物中大概有一半以上的蛋白質(zhì)可發(fā)生磷酸化修飾，蛋白質(zhì)磷酸化幾乎調(diào)節(jié)著整個(gè)生命活動(dòng)過程。因此，定量分析內(nèi)部和外部因子作用下磷酸化蛋白質(zhì)的分子調(diào)控機(jī)制對理解生物功能非常重要［57］。磷酸化蛋白或肽段富集目前主要有抗體富集法、固相金屬離子親和色譜法、金屬氧化物親和色譜法、強(qiáng)陰陽離子交換色譜法和親水相互作用色譜法。Mertins等［58］將iTRAQ標(biāo)記試劑與磷酸化富集技術(shù)結(jié)合起來對磷酸化肽段進(jìn)行定性和定量分析，這種定量方法可進(jìn)行多個(gè)條件或時(shí)間點(diǎn)樣品間的比較分析，在磷酸化定量蛋白質(zhì)組分析中得到廣泛的應(yīng)用。Piovesana等［59］將Graphitized carbon black（GCB）與金屬氧化物TiO2制備成磁性復(fù)合材料（mGCB@TiO2），優(yōu)化了磷酸化肽段的選擇性富集過程。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，對磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行規(guī)模化分析已成為現(xiàn)實(shí)［60］。

5.2 乙酰化修飾蛋白定量

蛋白質(zhì)的乙?；揎検峭ㄟ^乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用，在蛋白質(zhì)賴氨酸殘基上添加乙酰基的過程。乙?；揎椨绊懼?xì)胞生理的各個(gè)方面，如蛋白質(zhì)翻譯、折疊、DNA包裝和線粒體代謝等，在染色體結(jié)構(gòu)形成及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子激活方面具有重要作用［61］，對其進(jìn)行定量分析可為代謝類疾病的藥物研發(fā)提供重要依據(jù)［62，63］。將SILAC或iTRAQ標(biāo)記技術(shù)與乙?；贵w富集技術(shù)相結(jié)合，即可對細(xì)胞樣本中的乙酰化修飾進(jìn)行相對定量。Zhang等［64］將抗體富集技術(shù)與高精度的質(zhì)譜相結(jié)合，在大腸桿菌中鑒定到了349個(gè)乙?；鞍缀?0 709個(gè)乙?；稽c(diǎn)，相對于傳統(tǒng)方法分別提升了3倍和8倍，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的賴氨酸乙?；鞍踪|(zhì)的鑒定。

5.3 泛素化修飾蛋白定量

泛素化修飾是指一個(gè)或多個(gè)泛素分子在一系列酶的作用下與底物蛋白質(zhì)分子共價(jià)結(jié)合的翻譯后修飾過程［65］。泛素化在蛋白質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)中起著重要作用，可參與細(xì)胞分裂增殖、基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥免疫等幾乎一切生命活動(dòng)。通過將非標(biāo)記定量技術(shù)與泛素化抗體肽段富集方法相互結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)對泛素化肽段同時(shí)定性和定量的目的。Cai等［66］提出了利用蛋白質(zhì)序列中氨基酸的理化性質(zhì)（Physicochemical properties，PCPs）對泛素位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，建立了6個(gè)泛素集對其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明這一方法與其它方法相比具有很大優(yōu)勢。Akimo等［67］描述了一個(gè)將特異性的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Ubiquitin binding domains，UBDs）與SILAC技術(shù)相結(jié)合，以

表1 定量蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)特點(diǎn)與應(yīng)用

6 定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件

質(zhì)譜鑒定是定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟之一，其核心在于對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析。目前常用的數(shù)據(jù)庫檢索軟件包括MaxQuant、Mascot、Sequest、X！Tandem等，依賴于譜圖庫的檢索軟件有Pepitome、SpectraST等，其他相關(guān)軟件有Skyline，Spectronaut等。

MaxQuant是常用的標(biāo)記和非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，該平臺(tái)廣泛使用的集成搜索引擎Andromeda可以一種簡單的分析工作流程實(shí)現(xiàn)大規(guī)模數(shù)據(jù)集的分析［73］。Tyanova等［74］開發(fā)了優(yōu)化MaxQuant報(bào)告結(jié)果的工具M(jìn)axreport，以幫助用戶更好的理解和分享數(shù)據(jù)。Mascot和Sequest是利用分子序列數(shù)據(jù)檢索的方法來鑒定樣本中蛋白質(zhì)組成的經(jīng)典軟件，Brosch等［75］提出了對數(shù)據(jù)搜索結(jié)果再評(píng)分的算法Mascot Percolator，允許使用多重替代碎裂技術(shù)直接比較鑒定肽段，可作為獨(dú)立工具或集成到現(xiàn)有的數(shù)據(jù)分析流程中［76］。X！Tandem是一個(gè)在蛋白質(zhì)鑒定過程中將質(zhì)譜與肽序列匹配起來的開源軟件，用戶可以按照自己的需求對其源代碼進(jìn)行修實(shí)現(xiàn)對泛素相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行選擇性定量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略。Meng等［68］利用4個(gè)相同的泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（Ubiquitin-associated domains，UBA）構(gòu)建了GST-qUBAs誘餌蛋白，并且利用該誘餌蛋白和兩步親和富集法完成了水稻等植物泛素化修飾蛋白的富集和分析。

5.4 糖基化修飾蛋白定量

糖基化是蛋白質(zhì)或脂質(zhì)在酶的催化下結(jié)合上不同類型糖基的過程。糖基化修飾影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，是最重要、最復(fù)雜的翻譯后修飾過程之一，在蛋白質(zhì)折疊、定位和轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞生長、病毒復(fù)制、免疫保護(hù)等生物過程中起著重要的作用［69-70］。糖基化蛋白富集方法主要有氧化石墨烯固定化凝集素法、親水相互作用色譜法、代謝標(biāo)簽法、化學(xué)酶促標(biāo)記法和抗體富集法等，分析的難點(diǎn)主要在于質(zhì)譜鑒定方面，即特異性糖鏈結(jié)構(gòu)的解析，但近年來已有較多研究結(jié)果，如Hashii等［71］利用氚標(biāo)記定量分析了小鼠腎臟糖基化的變化；Ahn等［72］將MRM與Aleuria aurantia lectin（AAL）富集結(jié)合，用于肝癌血漿中異常蛋白質(zhì)糖基化定量。改，如Yang等［77］開發(fā)的Self-boosted Percolator，處理X！Tandem搜索結(jié)果時(shí)可提高肽段鑒定能力。

Pepitome是一種新的依賴于質(zhì)譜譜圖庫的搜索引擎，該軟件采用統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行評(píng)分，可靠性較高［78］。SpectraST是另一種功能全、通量高的開源MS2譜圖檢索軟件，適用于序列測定和靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析［79］。

Skyline是一款由美國華盛頓大學(xué)MacCoss實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的開源文檔編輯器，支持使用和創(chuàng)建各種資源的MS2譜庫，可依據(jù)之前觀察到的數(shù)據(jù)來選擇SRM過濾器并驗(yàn)證結(jié)果，常用于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法建立和定量數(shù)據(jù)分析［80］。Spectronaut是由瑞士蛋白質(zhì)組學(xué)公司Biognosys AG開發(fā)的可快速、準(zhǔn)確分析處理DIA或SWATH數(shù)據(jù)的軟件，具有強(qiáng)大的峰選擇算法，可自動(dòng)質(zhì)控并修正干擾［81］。

7 小結(jié)

定量蛋白質(zhì)組學(xué)在現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。目前主要應(yīng)用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)有體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)SILAC、基于串級(jí)質(zhì)譜的同位素標(biāo)記技術(shù)TMT和iTRAQ、非標(biāo)記定量技術(shù)、目標(biāo)離子檢測技術(shù)MRM/PRM，以及數(shù)據(jù)非依賴采集技術(shù)DIA/SWATH，其中MRM/PRM和DIA/SWATH是特別值得關(guān)注的定量蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)。此外，MS3定量技術(shù)解決了同重同位素標(biāo)記時(shí)共洗脫肽段干擾的問題，有望成為蛋白質(zhì)組學(xué)定量的新工具。翻譯后修飾蛋白質(zhì)組的定量分析涉及多種富集方法和質(zhì)譜技術(shù)，目前正處于迅速發(fā)展階段，有望成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要新領(lǐng)域。未來定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展方向是進(jìn)一步提高通量、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和自動(dòng)化程度。數(shù)據(jù)處理軟件也是定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵組件，有待在易用性、可靠性和計(jì)算效率方面進(jìn)一步發(fā)展。

致謝：

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（作物分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)）和國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2016YFD0101005）對項(xiàng)目研究給予了經(jīng)費(fèi)支持；徐江研究員和鄭兆彬工程師對本文的撰寫也給予了熱情幫助，特致謝意。

［1］ Adams MD, Celniker SE, Holt RA, et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster［J］. Science, 2000, 287（5461）：2185-2195.

［2］ Gregory SG, Barlow KF, Mclay KE, et al. The DNA sequence and biological annotation of human chromosome 1［J］. Nature, 2006, 441（7091）：315-321.

［3］ Muzny DM, Scherer SE, Kaul R, et al. The DNA sequence, annotation and analysis of human chromosome 3［J］. Nature, 2006, 440（7088）：1194-1198.

［4］ Yu J, Hu SN, Wang J, et al. A draft sequence of the rice genome（Oryza sativa L. ssp indica）［J］. Science, 2002, 296（5565）：79-92.

［5］ Kruger M, Moser M, Ussar S, et al. SILAC mouse for quantitative proteomics uncovers kindlin-3 as an essential factor for red blood cell function［J］. Cell, 2008, 134（2）：353-364.

［6］ Egertson JD, Kuehn A, Merrihew GE, et al. Multiplexed MS/MS for improved data-independent acquisition［J］. Nature Methods, 2013, 10（8）：744-746.

［7］ Ting L, Rad R, Gygi SP, et al. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics［J］. Nature Methods, 2011, 8（11）：937-940.

［8］ Marouga R, David S, Hawkins E. The development of the DIGE system：2D fluorescence difference gel analysis technology［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005, 382（3）：669-678.

［9］ Wu WW, Wang GH, Baek SJ, et al. Comparative study of three proteomic quantitative methods, DIGE, cICAT, and iTRAQ, using 2D gel- or LC-MALDI TOF/TOF［J］. Journal of Proteome Research, 2006, 5（3）：651-658.

［10］ Boersema PJ, Raijmakers R, Lemeer S, et al. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics［J］. Nature Protocols, 2009, 4（4）：484-494.

［11］ Levin Y, Schwarz E, Wang L, et al. Label-free LC-MS/MS quantitative proteomics for large-scale biomarker discovery in complex samples［J］. Journal of Separation Science, 2007, 30（14）：2198-2203.

［12］ Chahrour O, Cobice D, Malone J. Stable isotope labelling methods in mass spectrometry-based quantitative-proteomics［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2015, 113：2-20.

［13］ Washburn MP, Wolters D, Yates JR. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology［J］. Nature Biotechnology, 2001, 19（3）：242-247.

［14］ Gao J, Friedrichs MS, Dongre AR, et al. Guidelines for the routine application of the peptide hits technique［J］. J Am Soc Mass Spectrom, 2005, 16（8）：1231-1238.

［15］ Griffin NM, Yu J, Long F, et al. Label-free, normalized quantification of complex mass spectrometry data for proteomic analysis［J］. Nat Biotechnol, 2010, 28（1）：83-89.

［16］ Zhang Y, Wen Z, Washburn MP, et al. Improving label-free quantitative proteomics strategies by distributing shared peptides and stabilizing variance［J］. Analytical Chemistry, 2015, 87（9）：4749-4756.

［17］ Chelius D, Bondarenko, PV. Quantitative profiling of proteins in complex mixtures using liquid chromatography and mass spectrometry［J］. J Proteome Res, 2002, 1（4）：317-323.

［18］ Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, et al. Absolute quantification of proteins by LCMSE-A virtue of parallel MS acquisition［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2006, 5（1）：144-156.

［19］ Grossmann J, Roschitzki B, Panse C, et al. Implementation and evaluation of relative and absolute quantification in shotgun proteomics with label-free methods［J］. Journal of Proteomics, 2010, 73（9）：1740-1746.

［20］ Choi H, Glatter T, Gstaiger M, et al. SAINT-MS1：Proteinprotein interaction scoring using label-free intensity data in affinity purification-mass spectrometry experiments［J］. Journal of Proteome Research, 2012, 11（4）：2619-2624.

［21］ Choi H, Kim S, Fermin D, et al. QPROT：Statistical method for testing differential expression using protein-level intensity data in label-free quantitative proteomics［J］. J Proteomics, 2015, 129：121-126.

［22］ Van Riper SK, Higgins L, Carlis JV, et al. RIPPER：a framework for MS1 only metabolomics and proteomics label-free relative quantification［J］. Bioinformatics, 2016, 32（13）：2035-2037.

［23］ 錢小紅. 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法［J］. 色譜, 2013（8）：719-723.

［24］ Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2002, 1（5）：376-386.

［25］ Bicho CC, Alves FD, Chen ZA, et al. A genetic engineering solutionto the “arginine conversion problem” in stable isotope labeling by amino acids in cell culture（SILAC）［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2010, 9（7）：1567-1577.

［26］ Neubert TA, Tempst P. Super-SILAC for tumors and tissues［J］. Nat Methods, 2010, 7（5）：361-362.

［27］ Hebert AS, Merrill AE, Bailey DJ, et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification［J］. Nat Methods, 2013, 10（4）：332-334.

［28］ Xudong Yao AF, Javier Ramirez, Plamen A. Demirev, and Catherine Fenselau. Proteolytic 18O labeling for comparative proteomics：model studies with two serotypes of adenovirus［J］. Analchem, 2001, 73（13）：7.

［29］ Zhao Y, Jia W, Sun W, et al. Combination of improved18O incorporation and multiple reaction monitoring：a universal strategy for absolute quantitative verification of serum candidate biomarkers of liver cancer［J］. J Proteome Res, 2010, 9（6）：3319-3327.

［30］ Modzel M, Plociennik H, Kielmas M, et al. A synthesis of new, bilabeled peptides for quantitative proteomics［J］. J Proteomics, 2015, 115：1-7.

［31］ 顏輝. 金屬標(biāo)記結(jié)合生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組相對定量及絕對定量新方法研究［D］. 合肥：安徽醫(yī)科大學(xué), 2014.

［32］ Gygi SP, Rist B, Gerber SA, et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. ［J］. Nat Biotechnol, 1999, 17（10）：6.

［33］ Hsu J L, Huang SY, Chow NH, et al. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics［J］. Analytical Chemistry, 2003, 75（24）：6843-6852.

［34］ Wu Y, Wang F, Liu Z, et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics［J］. Chem Commun（Camb）, 2014, 50（14）：1708-1710.

［35］ Ross PL, Huang YN, Marchese JN, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents［J］. Mol Cell Proteomics, 2004, 3（12）：1154-1169.

［36］ Andrew Thompson J, 1rgen Schagunter KK, Stefan Kienle, Josef Schwarz, , 1nter Schmidt TN, And Christian Hamon. Tandem mass tags：A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS MS［J］. Analchem, 2003, 75（8）：10.

［37］ Werner T, Sweetman G, Savitski MF, et al. Ion Coalescence of neutron encoded TMT 10-plex reporter Ions［J］. Analytical Chemistry, 2014, 86（7）：3594-3601.

［38］ Dephoure N, Gygi SP. Hyperplexing：a method for higher-order multiplexed quantitative proteomics provides a map of the dynamic response to rapamycin in yeast［J］. Sci Signal, 2012, 5（217）：9.

［39］ Wojdyla K, Williamson J, Roepstorff P, et al. The SNO/SOH TMT strategy for combinatorial analysis of reversible cysteine oxidations［J］. Journal of Proteomics, 2015, 113：415-434.

［40］ Zhang Z, Yang XY, Mirokhin YA, et al. Interconversion of peptide mass spectral libraries derivatized with iTRAQ or TMT labels［J］. Journal of Proteome Research, 2016, 15（9）：3180-3187.

［41］ Dayon L, Sonderegger B, Kussmann M. Combination of gasphase fractionation and MS3acquisition modes for relative protein quantification with isobaric tagging［J］. Journal of Proteome Research, 2012, 11（10）：5081-5089.

［42］ Mcalister GC, Nusinow DP, Jedrychowski MP, et al. MultiNotch MS3enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes［J］. Analytical Chemistry, 2014, 86（14）：7150-7158.

［43］ Searle BC, Egertson JD, Bollinger JG, et al. Using data independent acquisition（DIA）to model high-responding peptides for targeted proteomics experiments［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2015, 14（9）：2331-2340.

［44］ Domanski D, Percy AJ, Yang J, et al. MRM-based multiplexed quantitation of 67 putative cardiovascular disease biomarkers in human plasma［J］. Proteomics, 2012, 12（8）：1222-1243.

［45］ Whiteaker JR, Zhao L, Anderson L, et al. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometrybased quantification of protein biomarkers［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2010, 9（1）：184-196.

［46］ Gerber SA, Rush J, Stemman O, et al. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100（12）：6940-6945.

［47］ Kim HJ, Lin D, Lee HJ, et al. Quantitative profiling of protein tyrosine kinases in human cancer cell lines by multiplexed parallel reaction monitoring assays［J］. Molecular & Cellular Proteomics,2016, 15（2）：682-691.

［48］ Ronsein GE, Pamir N, Von Haller PD, et al. Parallel reaction monitoring（PRM）and selected reaction monitoring（SRM）exhibit comparable linearity, dynamic range and precision for targeted quantitative HDL proteomics［J］. Journal of Proteomics, 2015, 113：388-399.

［49］ Gallien S, Kim SY, Domon B. Large-Scale targeted proteomics using internal standard triggered-parallel reaction monitoring（ISPRM）［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2015, 14（6）：1630-1644.

［50］ Law KP, Lim YP. Recent advances in mass spectrometry：data independent analysis and hyper reaction monitoring［J］. Expert Review of Proteomics, 2013, 10（6）：551-566.

［51］ Egertson JD, Maclean B, Johnson R, et al. Multiplexed peptide analysis using data-independent acquisition and Skyline［J］. Nature Protocols, 2015, 10（6）：887-903.

［52］ Zhong LJ, Li Y, Tian HF, et al. Data-independent acquisition strategy for the serum proteomics of tuberculosis［J］. International Journal of Clinical and Experimental Pathology, 2017, 10（2）：1172-1185.

［53］ Muntel J, Xuan Y, Berger ST, et al. Advancing urinary protein biomarker discovery by data-independent acquisition on a quadrupole-orbitrap mass spectrometer［J］. Journal of Proteome Research, 2015, 14（11）：4752-4762.

［54］ Gillet LC, Navarro P, Tate S, et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition：A new concept for consistent and accurate proteome analysis［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2012, 11（6）：17.

［55］ Ortea I, Rodriguez-Ariza A, Chicano-Galvez E, et al. Discovery of potential protein biomarkers of lung adenocarcinoma in bronchoalveolar lavage fluid by SWATH MS data-independent acquisition and targeted data extraction［J］. Journal of Proteomics, 2016, 138：106-114.

［56］ Tsou CC, Avtonomov D, Larsen B, et al. DIA-Umpire：comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics［J］. Nature Methods, 2015, 12（3）：258-264.

［57］ 甄艷李, 施季森. 磷酸化蛋白質(zhì)組定量研究策略. ［J］. 分子植物育種, 2014, 12（3）：7.

［58］ Mertins P, Udeshi ND, Clauser KR, et al. iTRAQ labeling is superior to mTRAQ for quantitative global proteomics and phosphoproteomics［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2012, 11（6）：12.

［59］ Piovesana S, Capriotti AL, Cavaliere C, et al. New magnetic graphitized carbon black TiO2 composite for phosphopeptide selective enrichment in shotgun phosphoproteomics［J］. Analytical Chemistry, 2016, 88（24）：12043-12050.

［60］ Song C, Ye M, Liu Z, et al. Systematic Analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2012, 11（10）：1070-1083.

［61］ 阮班軍, 代鵬, 王偉, 等. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進(jìn)展 ［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36（7）：1027-1037.

［62］ Scholz C, Weinert BT, Wagner SA, et al. Acetylation site specificities of lysine deacetylase inhibitors in human cells［J］. Nature Biotechnology, 2015, 33（4）：415-136.

［63］ Yang L, Vaitheesvaran B, Hartil K, et al. The Fasted/Fed mouse metabolic acetylome：N6-acetylation differences suggest acetylation coordinates organ-specific fuel switching［J］. Journal of Proteome Research, 2011, 10（9）：4134-4149.

［64］ Zhang K, Zheng S, Yang JS, et al. Comprehensive profiling of protein lysine acetylation in Escherichia coli［J］. Journal of Proteome Research, 2013, 12（2）：844-851.

［65］ Lu L, Li D, He FC. Bioinformatics advances in protein ubiquitination［J］. Hereditas（Beijing）, 2013, 35（1）：17-26.

［66］ Cai B, Jiang X. Computational methods for ubiquitination site prediction using physicochemical properties of protein sequences［J］. Bmc Bioinformatics, 2016, 17：116.

［67］ Akimov V, Rigbolt KTG, Nielsen MM, et al. Characterization of ubiquitination dependent dynamics in growth factor receptor signaling by quantitative proteomics［J］. Molecular Biosystems, 2011, 7（12）：3223-3233.

［68］ Meng Q, Rao L, Pan Y. Enrichment and analysis of rice seedling ubiquitin-related proteins using four UBA domains（GST-qUBAs）［J］. Plant Science An International Journal of Experimental Plant Biology, 2014, 229：172-180.

［69］ 包慧敏, 謝力琦, 陸豪杰. 糖蛋白質(zhì)組學(xué)中基于化學(xué)反應(yīng)的富集方法研究進(jìn)展［J］. 色譜, 2016（12）：1145-1153.

［70］ 張偉. 基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)N-糖基化定性與定量新技術(shù)［D］. 上海：復(fù)旦大學(xué), 2012.

［71］ Hashii N, Kawasaki N, Itoh S, et al. Alteration of N-glycosylationin the kidney in a mouse model of systemic lupus erythematosus：relative quantification of N-glycans using an isotope-tagging method［J］. Immunology, 2009, 126（3）：336-345.

［72］ Ahn YH, Shin PM, Kim YS, et al. Quantitative analysis of aberrant protein glycosylation in liver cancer plasma by AAL-enrichment and MRM mass spectrometry［J］. Analyst, 2013, 138（21）：6454-6462.

［73］ Cox J, Neuhauser N, Michalski A, et al. Andromeda：a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment［J］. Journal of Proteome Research, 2011, 10（4）：1794-1805.

［74］ Tyanova S, Temu T, Cox J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics［J］. Nature Protocols, 2016, 11（12）：2301-2319.

［75］ Brosch M, Yu L, Hubbard T, et al. Accurate and sensitive peptide identification with mascot percolator［J］. Journal of Proteome Research, 2009, 8（6）：3176-3181.

［76］ Wright JC, Collins MO, Yu L, et al. Enhanced peptide identification by electron transfer dissociation using an improved mascot percolator［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2012, 11（8）：478-491.

［77］ Yang PY, Ma J, Wang PH, et al. Improving X! Tandem on peptide identification from mass spectrometry by self-boosted percolator［J］. Ieee-Acm Transactions on Computational Biology and Bioinformatics, 2012, 9（5）：1273-1280.

［78］ Dasari S, Chambers MC, Martinez MA, et al. Pepitome：evaluating improved spectral library search for identification complementarity and quality assessment［J］. Journal of Proteome Research, 2012, 11（3）：1686-1695.

［79］ Lam H, Deutsch EW, Eddes JS, et al. Development and validation of a spectral library searching method for peptide identification from MS/MS［J］. Proteomics, 2007, 7（5）：655-667.

［80］ Maclean B, Tomazela DM, Shulman N, et al. Skyline：an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments［J］. Bioinformatics, 2010, 26（7）：966-968.

［81］ Bruderer R, Bernhardt OM, Gandhi T, et al. Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2015, 14（5）：1400-1410.

［82］ Mann M. Functional and quantitative proteomics using SILAC［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2006, 7（12）：952-958.

［83］ Werner T, Becher I, Sweetman G, et al. High-resolution enabled TMT 8-plexing［J］. Analytical Chemistry, 2012, 84（16）：7188-7194.

［84］ Pichler P, Koecher T, Holzmann J, et al. Peptide labeling with isobaric tags yields higher identification rates using iTRAQ 4-plex compared to TMT 6-plex and iTRAQ 8-plex on LTQ orbitrap［J］. Analytical Chemistry, 2010, 82（15）：6549-6558.

［85］ Neilson KA, Ali NA, Muralidharan S, et al. Less label, more free：Approaches in label-free quantitative mass spectrometry［J］. Proteomics, 2011, 11（4）：535-553.

［86］ Collins BC, Gillet LC, Rosenberger G, et al. Quantifying protein interaction dynamics by SWATH mass spectrometry：application to the 14-3-3 system［J］. Nature Methods, 2013, 10（12）：1246-1253.

（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Advancements in Quantitative Proteomics Technologies Based on Mass Spectrometry

MU Yong-ying1，2GU Pei-ming1MA Bo1YAN Wen-xiu1WANG Dao-ping1PAN Ying-hong1
（1. Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；2. Northeast Agricultural University，Harbin 150036）

Quantitative proteomic analysis is one of the key technologies in proteomics research. With the development of quantitative techniques，quantitative proteomics based on mass spectrometry has become an important branch of proteomics research. Quantitative proteomics technology is generally classified into two categories，untargeted quantitative proteomics and targeted quantitative proteomics. Targeted quantitative technology includes MRM and PRM models，and untargeted quantitative technology includes label-free and in vivo or vitro labeling. The most commonly used isotope labeling reagents are iTRAQ and TMT. According to the data collection model，the quantitative technology can be grouped into DDA and DIA. Through the collection and analysis of relevant literature，this article systematically introduces the main characteristics and current situation of quantitative proteomics based on mass spectrometry，aiming at providing help for the researchers on life science to better apply the quantitative proteomics technologies.

quantitative proteomics；target quantitative；stable isotope labeling；label-free；post-translational modification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0343

2017-04-28

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0101005），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程

牟永瑩，女，碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)；E-mail：mu_yongying@163.com

潘映紅，男，研究員，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)；E-mail：panyinghong@caas.cn