冉淦僑張紅艷任平

（1. 陜西省科學院酶工程研究所，西安 710600；2. 陜西省酶工程技術(shù)中心，西安 710600；3. 陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，西安 710600）

PCR-DGGE技術(shù)監(jiān)測自然發(fā)酵葛根中微生物菌群動態(tài)變化

冉淦僑1，3張紅艷2任平1

（1. 陜西省科學院酶工程研究所，西安 710600；2. 陜西省酶工程技術(shù)中心，西安 710600；3. 陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，西安 710600）

采用自然堆積發(fā)酵對葛根進行預(yù)處理，處理后葛根總異黃酮的提取量提高了5.7% 左右。隨后，分別采用傳統(tǒng)平板法和PCR-DGGE技術(shù)，對發(fā)酵過程中不同時期微生物菌群的變化進行分析，從而篩選出發(fā)酵中起主要作用的微生物。結(jié)果表明，自然發(fā)酵過程中的細菌呈升高-降低-再升高的變化趨勢：升溫期明顯增多，高溫期有所下降，降溫期再次增多；真菌的數(shù)量在整個發(fā)酵過程中都呈持續(xù)升高的趨勢。發(fā)酵過程中起主要作用的微生物也被初步確定，它們分別是地衣芽孢桿菌、桃色歐文氏菌、芽孢桿菌屬、枯草芽孢桿菌、不可培養(yǎng)細菌、爪哇青霉、黑曲霉、溜曲霉、米根霉和不可培養(yǎng)曲霉。

自然發(fā)酵；微生物群落；總異黃酮；變性梯度凝膠電泳（DGGE）

葛根（Radix Puerariae），又名葛藤，甜葛藤等，為豆科植物葛的根，一般指野葛 Pueraria Lobata（Willd.）Ohwi 或甘葛藤［1］。葛根黃酮為葛根中起主要藥理作用的黃酮類化合物，其主要成分有葛根素（Puerarin）、大豆苷元（daidzein）、大豆苷（daidzin）等［2-3］，約占葛根干重的4%-12%［4］，對嚴重威脅人類生命健康的心腦血管疾病具有重要的藥理和治療作用［5］。

近年來，微生物酶解法開始廣泛應(yīng)用于中草藥工業(yè)，只要選用恰當?shù)漠a(chǎn)酶菌株對原料進行預(yù)處理，不僅可以較溫和地分解植物組織，加速釋放有效成分，而且能夠分解去除影響液體制劑的雜質(zhì)，如淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等，促進某些極性低的脂溶性成分轉(zhuǎn)化為易溶于水的糖苷類，而有利于植物活性成分的提取，這為中草藥的提取提供一條新途徑［6］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采集于陜西省洋縣的葛根經(jīng)自然堆積發(fā)酵預(yù)處理后，葛根黃酮的提取量能提高 5% 左右，這在國內(nèi)尚屬首次，在此之前國內(nèi)未有關(guān)于自然發(fā)酵提高葛根黃酮提取量的相關(guān)報道。因此，有必要對葛根自然發(fā)酵過程中微生物種群多樣性及其動態(tài)變化進行研究，從而篩選出發(fā)酵過程中起主要作用的微生物。傳統(tǒng)的菌株篩選方法為平板培養(yǎng)法，該法需要先將樣品中的微生物進行分離純化，然后將純化的菌株回接到基質(zhì)中發(fā)酵，最后再根據(jù)發(fā)酵結(jié)果篩選出目標菌株。此法不僅費時費力，而且其適用范圍也有待提高，尤其對于多個菌株共同作用的自然發(fā)酵而言，研究起來就更加困難。變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)目前已經(jīng)成為研究微生物物種多樣性和動態(tài)變化的分子檢測工具之一［7］。該技術(shù)不依賴于微生物的分離培養(yǎng)，而是直接提取環(huán)境樣品中總的DNA進行PCR-DGGE分析，由此包括了樣品中可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物的總遺傳信息，從而真實地反映了微生物群落的原始組成。該技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境微生物生態(tài)的研究，如湖泊［8］、海洋［9］、土壤［10］、根系［11］、和沙丘［12］等。本實驗采用 PCR-DGGE 技術(shù)對自然發(fā)酵葛根中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化進行研究，并與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法進行對比，旨在明確發(fā)酵過程中微生物群落的組成及其在不同階段的變化規(guī)律，確定發(fā)酵中起主要作用的微生物，旨為葛根粉的發(fā)酵由自然堆積轉(zhuǎn)為人工控制下的發(fā)酵奠定基礎(chǔ)，同時也為進一步提高葛根總黃酮的提取率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

葛根樣品分別于 2014 年 12 月采集于陜西省洋縣，經(jīng)鑒定為野葛［Pueraria Lobata（Willd.）Ohwi］。葛根素標準品購買于陜西省食品藥品檢驗所，其它試劑均為國藥分析純。

真菌培養(yǎng)用 PDA 培養(yǎng)基；真菌分離培養(yǎng)基是在孟加拉紅培養(yǎng)基中加入過濾除菌的100 mg/L 鏈霉素；真菌純化培養(yǎng)基采用孟加拉紅培養(yǎng)基；細菌培養(yǎng)和純化用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；細菌分離培養(yǎng)基是在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入過濾除菌的 100 mg/L 鈉他霉素；放線菌培養(yǎng)和純化用高氏一號培養(yǎng)基；放線菌分離培養(yǎng)基是高氏一號培養(yǎng)基加入過濾除菌的 0.075 g/L重鉻酸鉀和 0.002 g/L 青霉素。所有的培養(yǎng)基均參見冉淦僑［13］的方法配制。

主要溶液 100 mg/L 鏈霉素溶液，100 mg/L 納他霉素溶液，參見冉淦僑［13］的方法配制。100 mg/L重鉻酸鉀溶液，100 mg/mL 青霉素溶液，參見冉淦僑［14］的方法配制。

葛根粉的制備：將采集的葛根洗凈，去除表面泥沙，晾干、切成小塊，于60℃烘干、粉碎，過80目篩后放于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

50×電泳緩沖液（TAE）：準確稱取Tris 242 g，Na2EDTA·2H2O 37.2 g，加入800 mL去離子水，充分攪拌溶解，再加入57.1 mL的醋酸，充分攪拌，加去離子水定容至1 000 mL，室溫保存。

1.2 方法

1.2.1 葛根的自然發(fā)酵 將經(jīng)粉碎處理的葛根粉與自來水按1:1（W/V）充分混合后分裝在呢絨袋中（每袋50 kg，共10袋），再將呢絨袋置于25℃環(huán)境中進行自然堆積發(fā)酵。每天定時記錄發(fā)酵堆的溫度，分別于0 d、1 d、5 d、12 d、15 d進行樣品采集。采樣點為發(fā)酵堆的上層、中間層和下層，每個點采樣3份。將每次采集的樣品混勻，一部分保存于4℃冰箱用于微生物分離培養(yǎng)以及葛根總黃酮的提取和檢測；一部分保存于-20℃冰箱中用于細菌和真菌的總DNA提取。1.2.2 葛根黃酮的提取 提取方法參見［15］，做了適當調(diào)整。將1.2.1中定時采集的葛根粉烘干至恒重（先用50℃烘8 h，去除大部分的水分，再用80℃烘至恒重）。精密稱取烘干后的葛根粉2.5 000 g裝于濾紙筒中，將開口端折疊封住，放入索氏提取器的提取筒中。將100 mL 80%乙醇作為提取液加入到圓底燒瓶中，安裝好索氏提取裝置，于85℃水浴中回流提取3 h。收集燒瓶中的提取液用于葛根黃酮的檢測。

1.2.3 葛根黃酮含量的測定 取1.2.2中收集的提取液0.1 mL，用水定容至10 mL。以0.l mL 80%乙醇加水至10 mL為空白對照，在250 nm處測定吸光度。

標準曲線繪制：精密稱取干燥至恒重的葛根素標準品5 mg，于25 mL量瓶中，加95%乙醇配制成0.2 mg/mL 的溶液，作為標準品溶液。精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0 mL 置于10 mL量瓶中，用水調(diào)至刻度；以 l mL 乙醇加水至10 mL為空白對照，在 250 nm 處測定吸光度，得回歸方程為：y=0.068 6x+0.009（R2=0.999 6）。

1.2.4 微生物純培養(yǎng)法分析葛根自然發(fā)酵過程微生物種群的變化 對自然發(fā)酵過程中采集的葛根樣品進行微生物種群變化分析。采用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)法確定葛根自然堆積發(fā)酵過程中微生物的種類和數(shù)量的動態(tài)變化情況。

1.2.4.1 微生物的分離與計數(shù) 稱取其中25 g發(fā)酵后的葛根粉放入含有250 mL 無菌水的三角瓶中（在瓶中加入玻璃珠），150 r/min搖床振蕩30 min后制成10-1的菌懸液，再用無菌水將菌懸液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6做梯度稀釋，取不同稀釋梯度的菌懸液0.1 mL分別涂于真菌分離培養(yǎng)基、細菌分離培養(yǎng)基和放線菌分離培養(yǎng)基表面，每個稀釋度設(shè)3次重復(fù)，30℃下培養(yǎng)2 d后開始細菌和放線菌計數(shù)，3 d后開始酵母菌和霉菌計數(shù)。根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等表型特征將真菌、細菌和放線菌進行初步劃分，平板劃線分離法進行純化，得到純種菌株，4℃貯藏備用。

1.2.4.2 微生物的鑒定 微生物的形態(tài)鑒定及分子鑒定均參考冉淦僑［13］的方法進行。

1.2.5 PCR-DGGE技術(shù)分析葛根自然發(fā)酵過程微生物種群的變化 對自然發(fā)酵過程中采集的葛根樣品，分別進行細菌和真菌的總DNA提取，并用PCRDGGE技術(shù)分析葛根自然堆積發(fā)酵過程中微生物的種類和數(shù)量的動態(tài)變化情況。

1.2.5.1 葛根中微生物總DNA提取 將發(fā)酵后的葛根粉置于-70℃冰箱中冷凍3 h后，稱取其中4 g樣品經(jīng)液氮充分研磨；接下來按照試劑盒操作說明（PowerSoil DNA Isolation Kit Sample，Catalog No.12888-S，MO BIO）和（PowerFecal DNA Isolation Kit Sample，Catalog No.12830-S，MO BIO）分別提取葛根樣品中微生物基因組總DNA。

1.2.5.2 PCR擴增 細菌16S rDNA V3區(qū)PCR：采用的引物為338F-GC/518R（引物序列見表1，其中，cclamp序列：GC clamp：CGCCCGCCGCGCGC GGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG），擴增目的片段為200 bp。50 μL的PCR反應(yīng)體系組成如下：Template DNA 0.5 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μmol/L）1 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL，2×PCR Mix（Vazyme）25 μL，ddH20 to final volume 50 μL。PCR反應(yīng)程序見表2（細菌第一輪PCR）。

真菌ITS區(qū)PCR：采用的引物為NS3F-GC/ Fun15R（引物序列見表1），擴增目的片段為200 bp。PCR反應(yīng)體系與細菌16S rDNA PCR相同。PCR反應(yīng)程序見表2（真菌第一輪PCR）。

表1 PCR-DGGE擴增細菌和真菌所需引物的名稱及序列

1.2.5.3 變性梯度凝膠電泳DGGE DGGE電泳分析使用德國Biorad儀器（DCode，Biorad，Germany），變性膠的范圍為30%-65%（100%的變性劑為7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺的混合物），變性膠的濃度從上至下遞增。待變性梯度膠完全凝固后，將膠板放入裝有1×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，取PCR產(chǎn)物30 μL加入加樣孔中，200 V電壓在60℃下電泳450 min。顯色采用EB染色，應(yīng)用Quantity One軟件分析結(jié)果。

1.2.5.4 DGGE特征條帶的回收、測序 將DGGE分析膠上的特征條帶用無菌手術(shù)刀片切下，用30 μL 的TE溶液浸泡過夜，取浸泡液4 μL作為PCR模板進行擴增，引物不帶GC夾子，擴增體系為：Template DNA 4 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μmol/L）2 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）2 μL，2×PCR Mix（Vazyme）25 μL，ddH20 to final volume 50 μL。PCR反應(yīng)程序見表2（第二輪PCR）。擴增所得產(chǎn)物送至GENEWIZ公司測序，測序結(jié)果在GenBank中進行序列同源性比對。

2 結(jié)果

2.1 葛根自然發(fā)酵過程中總黃酮的變化

發(fā)酵地點為安康中科麥迪森天然藥業(yè)公司的倉庫中，葛根原料產(chǎn)地為陜西洋縣，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的推移，葛根黃酮的得率也逐漸提高，在發(fā)酵第10天時達到最高點，與未經(jīng)發(fā)酵處理的葛根相比，提取出的總黃酮量提高了約5.7%，發(fā)酵15 d時，葛根黃酮的得率略有下降。

表2 細菌（16S rDNA V3區(qū)）和真菌（ITS區(qū)）PCR 擴增條件

2.2 微生物純培養(yǎng)法分析葛根自然發(fā)酵過程微生物種群的變化

以發(fā)酵過程中采集的葛根樣品作為研究對象，通過對葛根樣品中的微生物進行分離鑒定，研究葛根發(fā)酵過程中微生物的種類及數(shù)量的變化。

歷代鴻儒對“權(quán)”之闡釋表明，“權(quán)”是在具體的情景下，采取針對性的措施或者方法，需因地制宜，因時制宜。亦即權(quán)是對經(jīng)的反叛。但行權(quán)有度。如董仲舒《春秋繁露·玉英》中說：“夫權(quán)雖反經(jīng)，亦必在可以然之域。”權(quán)雖然是反經(jīng)的，但是權(quán)是在允許的、正確的范圍之內(nèi)，行權(quán)的結(jié)果需要對事物本身有益。在這一點上，余治平（2008）曾指出，“權(quán)”的實施，不能是沒有邊際的，而應(yīng)該以一定的“經(jīng)”為前提、為背景。岳天雷（2013）也曾說，“權(quán)”作為權(quán)衡輕重利弊的智慧和靈活變通的方法，是儒家政治哲學、道德哲學和歷史哲學的重要內(nèi)容。

如圖2所示，在整個自然發(fā)酵過程中，就微生物的菌群數(shù)量而言，隨著堆體溫度的升高，細菌和真菌的數(shù)量也迅速從102CFU/g升高至105CFU/g，并隨著發(fā)酵時間的延長，真菌數(shù)量呈逐漸上升的趨勢，而細菌除了在發(fā)酵第5天時數(shù)量略有下降之外，到第10天時又迅速上升至108CFU/g。分析原因，可能是由于從第3天開始到第5天，堆體溫度一直維持在40℃以上，持續(xù)的高溫會導致部分不耐熱的細菌死亡，而其余細菌生長緩慢，所以導致第5天時細菌數(shù)量略有下降；而真菌由于細胞壁較厚，加之曲霉屬的真菌還能產(chǎn)生抗逆性較強的孢子，所以真菌的數(shù)量沒有受到高溫的影響。

就微生物的菌群多樣性而言，從采集的葛根樣品中總共分離到6株不同的細菌，11株不同的真菌。經(jīng)過菌落形態(tài)初步鑒定及16S rDNA和18S rDNA的分子鑒定，鑒定結(jié)果見表3和表4。整個發(fā)酵過程中，細菌和真菌的種群多樣性都是呈先升高，后降低而后再升高的趨勢。

如圖3-A所示，在最初采集的樣品中，分離出的4種細菌，分別是B1地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、B2桃色歐文氏菌（Erwinia persicina）、B3污水桿菌（Lysinibacillus contaminans）和 B4大腸桿菌屬（Escherichia sp），到第3天的時候，又多了B5枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。第5天，受持續(xù)高溫的影響，樣品中的革蘭氏陰性細菌B3污水桿菌和B4大腸桿菌屬幾乎消失，而B5和B6由于是芽孢桿菌屬能產(chǎn)生抗逆性較強的芽孢，逐漸成為優(yōu)勢菌，直至發(fā)酵結(jié)束。綜上所述，確定發(fā)酵過程中起主要作用的細菌為：B1地衣芽孢桿菌、B2桃色歐文氏菌、B5芽孢桿菌屬和B6枯草芽孢桿菌。

圖1 葛根自然發(fā)酵過程中葛根總黃酮的動態(tài)變化

圖2 葛根發(fā)酵過程中堆體溫度及微生物菌群數(shù)量的變化

圖3 葛根發(fā)酵過程中細菌（A）和真菌（B）種群多樣性的變化

表3 葛根發(fā)酵樣品中分離出的6株細菌的16S序列比對結(jié)果

真菌種群多樣性的變化趨勢與細菌類似，如圖3-B所示，在最初采集的樣品中，分離出6種真菌，且每種真菌所占比例都差不多，沒有形成優(yōu)勢菌。隨著發(fā)酵時間的推移，到第3天的時候，樣品中分離出的真菌已達到8種，且F1爪哇青霉（Penicillium javanicum）逐漸成為優(yōu)勢菌。到第5天的時候，由于受持續(xù)高溫的影響，真菌種類又下降至6種，此時F1爪哇青霉（Penicillium javanicum）在樣品所占比例高達91%，成為絕對的優(yōu)勢菌。發(fā)酵第10天，隨著堆體溫度的降低，其余種類的真菌也開始生長，真菌種類又升高到8種，且F2/F3黑曲霉（Aspergillus niger）、F4溜曲霉（Aspergillus tamarii）和F7米根霉（Rhizopus oryzae）也開始快速生長，逐漸成為優(yōu)勢菌。綜上所述，確定發(fā)酵過程中起主要作用的真菌為：F1爪哇青霉，F(xiàn)2/F3黑曲霉，F(xiàn)4溜曲霉，F(xiàn)7米根霉。2.3 PCR-DGGE技術(shù)分析葛根自然發(fā)酵過程微生物種群的變化

2.3.1 葛根樣品中微生物基因組DNA的提取 采用PCR-DGGE技術(shù)進行微生態(tài)研究的第一步是提取環(huán)境樣品的總 DNA。所提取的總DNA必須既能實際代表原始體系中生物多樣性，又能滿足后續(xù)PCR 等分子生物學反應(yīng)的質(zhì)量要求?？紤]到葛根發(fā)酵樣品的固態(tài)原料比例很高，且含有豐富的代謝產(chǎn)物，在查閱相關(guān)文獻和咨詢相關(guān)專業(yè)人員的基礎(chǔ)上，選取了MO BIO公司的兩種DNA提取試劑盒，分別是Catalog No.12888-S的 PowerSoil DNA Isolation Kit Sample和Catalog No.12830-S，PowerFecal DNA Isolation Kit Sample。

結(jié)果如表5所示，就DNA濃度而言，貨號為12830-S試劑盒提取的DNA濃度普遍高于貨號為12888-S試劑盒。就A260/A280值而言，貨號為12888-S試劑盒的A260/A280值均在2.0以上，而貨號為12830-S試劑盒的A260/A280值均在1.8-2.0之間，純度較高，滿足后續(xù) PCR 反應(yīng)要求。因此不管是DNA濃度還是純度上，貨號為12830-S的試劑盒提取葛根樣品中的微生物總DNA效果較好。

表4 葛根發(fā)酵樣品中分離出的11株蘋真菌的18S序列比對結(jié)果

表5 發(fā)酵葛根樣品中微生物總DNA的提取結(jié)果

2.3.2 PCR-DGGE分析葛根發(fā)酵過程中微生物的種群變化 以提取的基因組DNA為模板，用引物對338F/518R擴增細菌16S rDNA V3區(qū)，用引物對NS3F/Fun15R擴增真菌的ITS區(qū)，PCR產(chǎn)物在合適的變性劑濃度梯度和電泳條件下經(jīng)DGGE分析，結(jié)果見圖4。

圖4中，0 d、1 d和5 d各泳道中優(yōu)勢條帶的電泳遷移位置基本一致，表明這個階段的優(yōu)勢微生物是相同的，且每個泳道中都僅有2-3條亮度較高的DNA 條帶，說明這幾個樣品中的微生物多樣性較低。10 d泳道亮度較高的 DNA 條帶增多，說明樣品中微生物多樣性增多，優(yōu)勢菌群增多。

為了確定DGGE圖譜中各條帶對應(yīng)的微生物種屬信息，對膠中主要條帶進行切膠、回收、克隆、驗證、測序和序列比對。

細菌條帶的鑒定結(jié)果（表6）表明，與條帶1和條帶3序列同源性最高的是芽孢桿菌屬和不可培養(yǎng)細菌屬，與條帶10、11和12序列同源性最高的也分別是不可培養(yǎng)細菌屬，芽孢桿菌屬和不可培養(yǎng)細菌屬，這說明在葛根的自然發(fā)酵過程中，不可培養(yǎng)細菌和芽孢桿菌屬于優(yōu)勢菌，這與微生物純培養(yǎng)的分析結(jié)果略有不同。雖然兩種分析結(jié)果都表明芽孢桿菌屬在整個發(fā)酵過程中占據(jù)優(yōu)勢，但由于不可培養(yǎng)細菌無法通過傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)法進行分離培養(yǎng)，因此微生物純培養(yǎng)法并不能將它檢測出來，這是該方法的局限性。此外，與條帶6序列同源性最高的是大腸桿菌屬，該條帶在5 d泳道中消失，這一結(jié)果與微生物純培養(yǎng)的分析結(jié)果一致。由此可見，PCR-DGGE技術(shù)確定了發(fā)酵過程中起主要作用的細菌為：芽孢桿菌（條帶1、5、7、11），不可培養(yǎng)細菌（條帶3、9、10、12、13）和歐文氏菌（條帶2、8）。綜上所述，PCR-DGGE技術(shù)不僅能檢測到傳統(tǒng)微生物分離中獲得的全部細菌，還能檢測出那些含量低、較難培養(yǎng)的細菌。與傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)相比，PCR-DGGE技術(shù)不僅涵蓋的細菌種類更為全面，檢測結(jié)果可信度高，還能更直觀、快速地觀察到細菌的演變過程，確定樣品中的優(yōu)勢細菌。

圖4 不同葛根樣品細菌16S rDNA V3區(qū)（A）和真菌ITS區(qū)（B）擴增片段的DGGE電泳分析

真菌條帶的鑒定結(jié)果（表6）表明，與條帶21序列同源性最高的是青霉屬（Penicillium sp.），而微生物純培養(yǎng)方法檢測的結(jié)果也表明爪哇青霉為整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，兩種方法的檢測結(jié)果一致。此外，與條帶22和23序列同源性最高的都是不可培養(yǎng)曲霉屬（Uncultured Aspergillus sp.）。與傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)方法相比，PCR-DGGE技術(shù)的優(yōu)點是能分析鑒定出不可培養(yǎng)真菌。但由于DGGE片段只有 bp，只含有18S rDNA 序列的一部分，因此序列比對結(jié)果的可靠性大大降低，只能鑒定到屬，這給真菌的多樣性分析帶來了困難。同時，表6的鑒定結(jié)果可以看出，PCR-DGGE技術(shù)分析出的真菌多樣性較低，只包含曲霉屬和青霉屬兩類。而微生物純培養(yǎng)方法分析結(jié)果表明，雖然樣品中青霉屬和曲霉屬為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬，但樣品中還存在大量的毛霉、根霉等其它菌屬。由此可見，DGGE技術(shù)對真菌的多樣性檢測結(jié)果存在偏差。主要有以下兩點原因：其一，總DNA提取的方法不夠優(yōu)化，涵蓋面較窄導致部分DNA的遺漏；其二，PCR擴增時對模板有偏嗜性，導致有的DNA被大量擴增，而有的DNA被擴增的幾率很小。因此，要提高DGGE檢測結(jié)果的準確性，還需要進一步的實驗探索。綜上所述，PCR-DGGE技術(shù)確定了發(fā)酵過程中起主要作用的真菌為：曲霉屬（條帶16、17、18、19），青霉屬（條帶20、21），不可培養(yǎng)曲霉屬（條帶22、23）。

3 討論

自然界中某些微生物可以分解植物組織（如果膠、木質(zhì)素、纖維素等），加速植物有效成分的釋放，有利于植物活性成分的提取。湯海鷗等［6］采用黑曲霉對葛根進行酶解處理，處理后葛根黃酮的提取量提高 21.1%。宋艷秋等［20］采用紅曲酶發(fā)酵轉(zhuǎn)化葛根，使葛根主要有效成分含量有所提高。鄔建國等［21］從10株食藥用真菌中篩選獲得1株高效菌株 DS1，該菌株在發(fā)酵葛根渣后使葛根渣中異黃酮的含量提升了30.3%。這些都說明了利用產(chǎn)酶微生物發(fā)酵處理葛根，可以提高葛根中總異黃酮的提取量。本研究采用自然堆積發(fā)酵處理葛根，處理10 d后葛根黃酮的提取量提高了 5.7% 左右，這說明自然發(fā)酵處理也能提高葛根黃酮的提取量。然而，并不是所有葛根在任何地方經(jīng)自然發(fā)酵后，其葛根黃酮的提取量都能得到提高，它取決于葛根的產(chǎn)地來源及發(fā)酵地點等諸多因素。在前期實驗中，本課題組將產(chǎn)地不同的8種葛根分別在兩個不同的地方進行自然發(fā)酵，僅有產(chǎn)自陜西洋縣的葛根在安康某公司的倉庫中進行發(fā)酵后，總黃酮的提取量才會提高（數(shù)據(jù)未顯示）。這說明洋縣的葛根中或安康某公司的倉庫環(huán)境中肯定存在著某些特有的微生物，正是通過這些特有微生物的發(fā)酵處理，才使得葛根總黃酮的提取量得以提高。

為了確定發(fā)酵過程中起主要作用的微生物，本研究分別采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PCR-DGGE技術(shù)對葛根自然發(fā)酵過程的微生物菌群變化進行分析。結(jié)果表明，就微生物的數(shù)量而言，傳統(tǒng)培養(yǎng)法與PCRDGGE技術(shù)得到了相似的變化規(guī)律；發(fā)酵過程中的細菌呈升高-降低-再升高的變化趨勢：升溫期明顯增多，高溫期有所下降，降溫期再次增多；真菌的數(shù)量在整個發(fā)酵過程中都呈持續(xù)升高的趨勢。就微生物的種類而言，傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PCR-DGGE方法得到的結(jié)果大致相同，但也存在差異。傳統(tǒng)培養(yǎng)法確定起主要作用的細菌為：地衣芽孢桿菌、桃色歐文氏菌、芽孢桿菌屬和枯草芽孢桿菌；PCR-DGGE技術(shù)分析表明，除了芽孢桿菌屬和歐文氏菌屬之外，還有大量的不可培養(yǎng)細菌在發(fā)酵中發(fā)揮主要作用。這說明PCR-DGGE技術(shù)不僅能直觀、快速地觀察到細菌的演變過程，確定樣品中的優(yōu)勢細菌，且涵蓋的細菌種類也較為全面，結(jié)果可信度較高。此外，傳統(tǒng)培養(yǎng)法確定起主要作用的真菌為：爪哇青霉、黑曲霉、溜曲霉和米根霉；而PCR-DGGE技術(shù)雖然能檢測出青霉屬、曲霉屬和不可培養(yǎng)的曲霉屬，但多種其它真菌（如米根霉、粗糙鏈孢霉菌等）該技術(shù)未能檢出，與純培養(yǎng)技術(shù)相比，并不能完全反映出真菌菌群的原始組成，且由于擴增的片段較短，比對結(jié)果準確性也不夠高。因此，還需進一步的研究，以提高PCR-DGGE技術(shù)在真菌檢測上的準確性。

表6 PCR-DGGE條帶的序列比對結(jié)果

4 結(jié)論

綜合上述兩種方法的結(jié)果，初步確定發(fā)酵過程中起主要作用的微生物有地衣芽孢桿菌、桃色歐文氏菌、芽孢桿菌屬、枯草芽孢桿菌、不可培養(yǎng)細菌、爪哇青霉、黑曲霉、溜曲霉、米根霉及不可培養(yǎng)曲霉。后續(xù)我們將分別對這些微生物的作用機理進行研究，最終確定具體是其中哪一種或哪幾種微生物通過何機制提高了葛根黃酮的提取率。

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（責任編輯 狄艷紅）

Dynamic Changes of Microbial Community in the Process of Natural Fermentation of Puerariae lotaba Monitored by PCR-DGGE

RAN Gan-qiao1，3ZHANG Hong-yan2REN Ping1
（1. Institute of Enzyme Engineering，Shaanxi Academy of Science，Xi’an 710600；2. Enzyme Engineering Technology Center of Shaanxi Province，Xi’an 710600；3. Shaanxi Bio-Agriculture Institute，Xi’an 710600）

In this study，the extraction yield of total isoflavones from Puerariae lotaba increased by 5.7% after pretreated with natural compost fermentation. After that，in order to determine the microorganisms playing a major role in this fermentation，the dynamic changes of the microbes in the process of natural fermentation of P. lotaba powder were analyzed using traditional flat culture method and PCR-DGGE technology respectively. The results showed that the number of bacteria showed an “increase-decrease-increase” trend in the whole fermentation process：increased significantly in the temperature-rising stage，then decreased slightly in the thermophilic stage，and finally rose again in the temperature-cooling stage，but the number of fungi presented a continuous increase trend. Besides，several microorganisms isolated from P. lotaba were initially identified to have positive effects on improving the extraction yield of total isoflavones，and these microbes included：Bacillus licheniformis，Rhizoctonia solani，Bacillus，Bacillus subtilis，non-cultivable bacteria，Penicillium japonicum，Aspergillus niger，Aspergillus，Asparagus，and non-cultivable Aspergillus.

natural fermentation；microbial community；total isoflavones；denatured gradient gel electrophoresis（DGGE）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0251

2017-03-30

陜西省科學院青年人才培養(yǎng)專項（2012k-31）

冉淦僑，女，碩士，助理研究員，研究方向：植物保護；E-mail：ranganqiao@163.com