馮紫洲+劉春梅+衡寶山+張繼星+陳永勝+王云+劉海臣+穆莎茉莉+冀照軍+霍紅雁

摘要：植物的絲氨酸羧肽酶（serine carboxypeptidases，簡稱SCP）是一類屬于α/β水解酶家族的蛋白酶，在許多生化途徑（包括次生代謝產(chǎn)物的生物合成、催化酰基轉(zhuǎn)移、除草劑共軛、種子萌發(fā)相關(guān)蛋白質(zhì)的降解過程）中起著重要作用。絲氨酸羧肽酶基因是植物的一種抗逆基因，在植物生長發(fā)育及抵抗逆境方面發(fā)揮著重要作用。蓖麻作為重要的油料作物，用途廣泛。本研究利用cDNA末端快速克?。≧ACE）方法克隆蓖麻RcSCP基因的3′端、5′端片段，最后設(shè)計(jì)全長引物獲得蓖麻RcSCP全長序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，絲氨酸羧肽酶蛋白基因的cDNA完整開放閱讀框序列為1 377 bp，推測它可編碼458個氨基酸；蓖麻RcSCP蛋白含有絲氨酸羧肽酶蛋白家族保守區(qū)，預(yù)測它定位于細(xì)胞質(zhì)中。

關(guān)鍵詞：蓖麻；RACE；絲氨酸羧肽酶；克隆

中圖分類號： S565.601文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0027-04

是一類屬于α/β水解酶家族的蛋白酶，在植物生長發(fā)育過程中參與多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾、降解等多個重要環(huán)節(jié)，并且在許多生化途徑包括次生代謝產(chǎn)物的生物合成、催化?；D(zhuǎn)移、除草劑共軛、種子萌發(fā)相關(guān)蛋白質(zhì)降解過程中起著重要作用[1]。目前，已從多種植物中分離得到SCP蛋白及絲氨酸羧肽酶類蛋白（serine carboxypeptidases-like proteins，簡稱 SCPLs）[2-4]。SCP基因是一種抗逆基因，在植物生長發(fā)育及抵抗逆境方面起著重要作用。葉玲飛通過對水稻耐旱方面的研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsSCP基因缺失會導(dǎo)致植株耐旱性和耐高溫性降低[5]，表明SCP基因在耐旱、耐高溫方面發(fā)揮重要作用；劉麗等將玉米ZmSCP基因?qū)氲綗煵葜邪l(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性、耐鹽性、抗氧化性均有提高，且其自身防衛(wèi)基因的表達(dá)量也有明顯升高[6]，這些均表明SCP基因在植物抵抗逆境方面起著重要作用。

蓖麻（Ricinus communis L.）是世界十大油料作物之一，是雙子葉一年生或多年生大戟科蓖麻屬草本植物[7]。蓖麻原產(chǎn)于非洲，屬熱帶多年生灌木，我國的蓖麻由印度傳入，至今已有1 400多年的歷史[8]。蓖麻有700多種工業(yè)用途，主要用途是從蓖麻籽粒中提取蓖麻油[9]。蓖麻根系發(fā)達(dá)，枝葉生長量大，能在沙化土壤中生長，起到防風(fēng)固沙的作用。蓖麻育種的研究主要集中在誘變育種和雜交育種方面，已育成一批旨在提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)的新品種，在生產(chǎn)上取得顯著的成績[7]。然而針對抵抗逆境育種的研究很少，關(guān)于蓖麻抗逆相關(guān)基因功能及抗逆分子育種的研究很少。研究表明，SCP在植物抵抗逆境方面起重要作用。本研究以蓖麻為材料，采用cDNA末端快速克?。╮apid-amplification of cDNA ends，簡稱RACE）等技術(shù)，獲取蓖麻絲氨酸羧肽酶基因RcSCP，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究RcSCP基因的轉(zhuǎn)化及功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

蓖麻種植于內(nèi)蒙古民族大學(xué)植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)室，品種為通蓖5號，取新鮮葉片為供試材料。Ex Taq DNA聚合酶、克隆載體pMD18-T、3′RACE和5′RACE試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，感受態(tài)細(xì)胞JM109保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2蓖麻葉片總RNA的提取及引物設(shè)計(jì)

使用改良的TRIzol提取法提取總RNA[10-11]，幾乎沒有DNA和蛋白質(zhì)的污染，其純度較高且具有較好的效果。采用RACE法克隆蓖麻SCP基因cDNA全長。根據(jù)其他植物上的NHX蛋白的保守序列設(shè)計(jì)，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)3′RACE簡并引物3F1、3F2；結(jié)合已經(jīng)克隆得到的蓖麻SCP 3′端基因片段，設(shè)計(jì)5′RACE特異性引物5F1、5F2；采用DNAMAN軟件對測定的核苷酸5′端、3′端序列進(jìn)行電子序列的拼接合并，從而獲得cDNA全長，在該基因編碼區(qū)域的兩端設(shè)計(jì)全長特異性引物F、R。

1.4蓖麻SCP基因生物信息學(xué)分析

對測序結(jié)果進(jìn)行分析，確定克隆獲得蓖麻SCP基因 cDNA 序列完整開放閱讀框。利用SWISS-Model、DNAMAN、WoLF PSORT等生物學(xué)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1蓖麻葉片總RNA活性的檢測

將提取好的蓖麻總RNA用DEPC水進(jìn)行10倍稀釋，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖1），并檢測其純度D260 nm/D280 nm值=2.10，純度較好，滿足下一步試驗(yàn)要求。

2.2蓖麻RcSCP基因克隆

采用RACE法克隆蓖麻SCP基因，利用設(shè)計(jì)的3′端、5′端引物及cDNA全長特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，最后得到蓖麻SCP基因cDNA全長1 377 bp的片段（圖2），命名為RcSCP（GenBank 登錄號：KX267676）。

2.3蓖麻RcSCP基因生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件對獲得的蓖麻RcSCP基因全長序列進(jìn)行分析。該序列包括1 377 bp完整的開放閱讀框，可推測編碼458個氨基酸的多肽。該多肽的分子量為51.245 ku，等電點(diǎn)（pI值）為5.67，pH值7.0時電荷為-6.29。預(yù)測 RcSCP 基因的保守區(qū)，使用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站的保守區(qū)分析（conserved domains）（http：//www.ncbi.Nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb/cgi）功能，結(jié)果表明，蓖麻RcSCP含有絲氨酸羧肽酶蛋白家族保守區(qū)，表明RcSCP與這些家族的蛋白具有相似的功能，是蓖麻的一種絲氨酸羧肽酶蛋白（圖3）。運(yùn)用SOPMA軟件預(yù)測蓖麻RcSCP蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白的α-螺旋為31.88%，延伸鏈為27.29%，β-轉(zhuǎn)角為11.14%，無規(guī)則卷曲為26.69%（圖4）。利用在線程序SWISS-Model的自動模式對該蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，得到該蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖5）。利用DNAMAN軟件對蓖麻RcSCP與大豆（Glycine max，XP_003531913.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_564298.1）、麻風(fēng)樹（Jatropha carcas L.，XP_012088729.1）的絲氨酸羧肽酶蛋白的氨基酸序列進(jìn)行對比，同源性分別為77.66%、7679%、8639%（圖6）。endprint