王全智+魏躍

摘要：為了建立草莓品種紅顏（Fragaria×ananassa Duch. Benihoppe）的高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因體系，以草莓紅顏組培苗的葉片作為試驗(yàn)材料，對(duì)影響基因的因子進(jìn)行優(yōu)化，獲得穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)基因體系。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌菌液D600 nm=0.4、侵染時(shí)間20 min、培養(yǎng)3 d后草莓抗性芽誘導(dǎo)率較高。用350 mg/L羧芐青霉素（carbenicillin，簡(jiǎn)稱Cb）作為抑菌抗生素能夠有效抑制農(nóng)桿菌而不傷害草莓葉片；用20 mg/L卡那霉素（kanamycin，簡(jiǎn)稱Kan）作為篩選抗生素能夠盡可能多的去除非抗性芽。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，草莓FaCBL1基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入草莓基因組中。

關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌；草莓；FaCBL1基因；轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)： S668.401文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0039-03

E-mail：1109238212@qq.com。八倍體栽培草莓品種紅顏（Fragaria×ananassa Duch. Benihoppe）是由日本引入我國栽培的優(yōu)良品種，該品種果實(shí)果形正，鮮食口感好，豐產(chǎn)性好，品質(zhì)優(yōu)良，適于設(shè)施栽培，目前已經(jīng)成為我國栽培面積較大的一個(gè)品種，尤其是在江、浙地區(qū)，栽培面積較大，占草莓總栽培面積的50%以上。但是由于該品種耐儲(chǔ)性差，貨架期短，而且該品種抗病性差，育苗過程極易感染炭疽病，成苗率低，設(shè)施栽培過程中容易感染白粉病和灰霉病。因此，亟待對(duì)該品種進(jìn)行改良，而傳統(tǒng)的育種方法周期長(zhǎng)，見效慢。近年來，由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物品種改良中的廣泛應(yīng)用，也有多項(xiàng)關(guān)于草莓基因改良的報(bào)道。因此，用分子育種的方法改良草莓基因在未來草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中是一條必經(jīng)之路，能夠?yàn)椴葺肿佑N開辟一條新途徑，對(duì)紅顏草莓的推廣種植和提高紅顏草莓生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益有重要的意義。

鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白（calcineurin B-like，簡(jiǎn)稱CBL）是在植物抗逆中起著重要作用的一類基因家族。其中CBL1基因在抗逆以及果樹果實(shí)發(fā)育、品質(zhì)形成等方面都有重要的作用[1]。而草莓果實(shí)的發(fā)育是果樹學(xué)科研究的重要問題之一，研究草莓果實(shí)成熟發(fā)育對(duì)培育草莓優(yōu)良品種有重要意義，因此，研究草莓FaCBL1基因在草莓果實(shí)發(fā)育中的作用及其功能是未來草莓分子生物學(xué)研究中的一條重要途徑[2]。而基因功能的驗(yàn)證有賴于一個(gè)高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。因此，建立一個(gè)高效穩(wěn)定的FaCBL1基因遺傳轉(zhuǎn)化體系，能夠?yàn)樘接懩婢诚嚓P(guān)基因在果實(shí)發(fā)育中的作用奠定一個(gè)良好的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用草莓品種紅顏組培苗，由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)園藝系組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室保存。組培苗在MS+0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)備用。取草莓葉片剪去葉尖和葉緣，將葉片剪成3 mm×3 mm的葉塊備用。

1.2菌株、載體和基因

本試驗(yàn)所用農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是GV3101，由江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存。GV3101含有植物表達(dá)載體pK7WG2D，該載體上含有的目的基因是FaCBL1基因，并帶有β-葡糖苷酸酶基因（GUS）和卡那霉素（Kan）抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（nptⅡ）。

1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

共培養(yǎng)培養(yǎng)基（G1）：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA；篩選培養(yǎng)基（G2）：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+20 mg/L Kan+350 mg/L Cb；伸長(zhǎng)培養(yǎng)基（G3）：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20 mg/L Kan+350 mg/L Cb；生根培養(yǎng)基（G4）：MS+0.1 mg/L IBA+25 mg/L Kan+300 mg/L Cb。所有培養(yǎng)基中均附加瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L。培養(yǎng)條件為光—暗周期16 h—8 h，光照度2 000～3 000 lx，溫度23～25 ℃。培養(yǎng)55 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.4轉(zhuǎn)基因方法

1.4.1農(nóng)桿菌的培養(yǎng)將保存的菌轉(zhuǎn)移到附加100 mg/L壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落放于附加100 mg/L壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液D600 nm為0.8～1.2，室溫下 5 000 r/min 離心10 min，收集菌體并用新鮮的MS液體培養(yǎng)基活化菌體。

1.4.2葉片轉(zhuǎn)化方法首先將葉片剪到新鮮的MS液體中，剪好后放在活化好的液體菌液中侵染，侵染以后的葉片用無菌濾紙吸干表面殘留的菌液后接種于G1培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)入G2篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)和再生，28 d后更換1次新的篩選培養(yǎng)基，待抗性芽長(zhǎng)出后，將抗性芽轉(zhuǎn)入G3伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，40 d后，將抗性芽從莖基部切下，轉(zhuǎn)入G4生根培養(yǎng)基上生根，獲得完整的抗性苗。

1.4.3植物篩選抗生素濃度的確定將葉片分別接種于含有Kan濃度為10、15、20、25 mg/L的G1培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng) 14 d 后轉(zhuǎn)至光下再培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)葉片褐化率、愈傷形成率和不定芽再生率，確定最適的Kan濃度。

1.4.4抑制農(nóng)桿菌抗生素濃度的選擇將共培養(yǎng)后的葉片分別接種于含有Cb濃度為200、350、500 mg/L的G1培養(yǎng)基上，經(jīng)暗培養(yǎng)14 d，篩選培養(yǎng)至40 d后，觀察農(nóng)桿菌的抑菌程度并確定最適的Cb濃度。

1.4.5菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化選擇培養(yǎng)菌液的D600 nm分別設(shè)為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6；葉片的浸染時(shí)間分別設(shè)為10、15、20、25、30 min；共培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)為1、2、3、4、5 d；確定最佳的菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間。endprint

1.5評(píng)價(jià)指標(biāo)與數(shù)據(jù)調(diào)查

用GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率來選擇最佳的菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間。GUS瞬時(shí)表達(dá)率=（顯示藍(lán)色的葉片數(shù)/所剪的總?cè)~片數(shù)）×100%。

1.6轉(zhuǎn)FaCBL1基因草莓植株的檢測(cè)

1.6.1檢測(cè)方法

1.6.1.1GUS染色轉(zhuǎn)化過程中獲得的抗性芽長(zhǎng)出葉片后，剪取3 mm×3 mm的葉塊裝于含GUS染色液的離心管中，于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行GUS組織染色，16～24 h后取出葉片，用70%乙醇脫色，至葉片中的葉綠素完全脫除為止。葉綠素脫除干凈后，葉片顯示藍(lán)色的為轉(zhuǎn)基因植株，顯示白色的為非轉(zhuǎn)基因植株。

1.6.1.2熒光定量PCR檢測(cè)提取轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，簡(jiǎn)稱RT-qPCR）的方法，檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)基因和內(nèi)標(biāo)Actin基因RT-qPCR擴(kuò)增的總反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL SYBR premix Ex Taq混合液，2 μL cDNA，1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），6 μL無核酸污染的滅菌水。反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)的第3步進(jìn)行熒光采集。最后從 60 ℃ 升溫至95 ℃，每隔30 s上升0.5 ℃，共71個(gè)循環(huán)。檢測(cè)其熒光值，繪制熔點(diǎn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品cDNA和待測(cè)樣品均設(shè)置3次重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1卡那霉素濃度對(duì)草莓轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)基因植物篩選抗生素的濃度應(yīng)當(dāng)是在不傷害植物本身的情況下能夠長(zhǎng)愈傷，而不能夠誘導(dǎo)過多的芽，因此葉片接種于不同濃度Kan的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，需要統(tǒng)計(jì)葉片的黃化率和白化率。隨著培養(yǎng)基中Kan濃度的增加，外植體失綠、黃化、皺褶、壞死的現(xiàn)象加重，當(dāng)Kan濃度達(dá)到30 mg/L時(shí)，外植體黃化，而且沒有再生芽，可見Kan對(duì)轉(zhuǎn)化外植體再生率有很大影響。由圖1可知，在Kan濃度為20 mg/L時(shí)，葉片褐化率達(dá)到75%，有一定數(shù)量的愈傷組織形成，但是有少量不定芽生成。因此，Kan濃度達(dá)到20 mg/L時(shí)能夠部分抑制草莓不定芽的再生，可作為草莓轉(zhuǎn)基因過程中植物篩選抗生素Kan的最佳濃度。

2.2羧芐青霉素濃度對(duì)草莓轉(zhuǎn)化的影響

本試驗(yàn)使用轉(zhuǎn)基因中常用的Cb抗生素抑制農(nóng)桿菌，Cb對(duì)草莓的再生會(huì)產(chǎn)生一定的影響。低濃度的Cb在轉(zhuǎn)基因初期一般都能夠抑制大部分農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，但在后期移至光下培養(yǎng)時(shí)不能夠很好地抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，在Cb濃度為350 mg/L時(shí)可以完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，而且對(duì)草莓外植體的再生率影響不大。因此，可以用選用Cb濃度為 350 mg/L 作為抑制培養(yǎng)基中農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的最佳濃度。

2.3菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間的選擇

由圖2可知，菌液D600 nm在0.1～0.4之間時(shí)，隨D600 nm的增加，GUS瞬時(shí)表達(dá)率隨之上升；在D600 nm=0.4時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高。菌液濃度過高會(huì)導(dǎo)致葉片切口處褐化，外植體容易死亡；濃度過低農(nóng)桿菌數(shù)目不足，會(huì)使轉(zhuǎn)化效率降低。因此，D600 nm=0.4時(shí)菌液濃度為最佳。

由圖3可知，隨侵染時(shí)間的增加，GUS瞬時(shí)表達(dá)率隨之上升，侵染外植體20 min時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到最高值。侵染時(shí)間過長(zhǎng)，外植體容易褐化變爛。因此，最佳侵染時(shí)間選為20 min。

由圖4可知，外植體在共培養(yǎng)2 d時(shí)開始有GUS瞬時(shí)表達(dá)，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率逐漸升高，但是在共培養(yǎng)4 d時(shí)農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)已經(jīng)很難被抑制。因此，以共培養(yǎng)3 d為最佳。

2.4抗性芽的伸長(zhǎng)、生根

將生長(zhǎng)健壯的抗性芽轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，抗性芽能很好地長(zhǎng)大、增殖。將增殖的抗性苗分株，單株放入生根培養(yǎng)基中可以正常生根，生根率達(dá)到90%以上。

2.5轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)

通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)FaCBL1基因轉(zhuǎn)紅顏草莓，共獲得8株轉(zhuǎn)基因植株，其中5株GUS陽性植株，GUS染色鑒定的部分結(jié)果如圖5所示。

2.6轉(zhuǎn)基因草莓植株的熒光定量PCR檢測(cè)

對(duì)GUS染色為陽性的5株草莓轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。提取PCR陽性植株和陰性對(duì)照植株的總RNA，以其為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。由圖6可知，5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的FaCBL1基因與對(duì)照相比都有較高的表達(dá)量，且均高于對(duì)照，說明基因已經(jīng)完全轉(zhuǎn)入草莓中。

3討論

草莓作為一種兼具觀賞和高營養(yǎng)價(jià)值的水果，目前在國內(nèi)外的種植面積日益增加。尤其在我國，隨著觀光農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，種植草莓將會(huì)是我國觀光農(nóng)業(yè)發(fā)展的一項(xiàng)重要經(jīng)濟(jì)收入。目前，我國江、浙、滬地區(qū)的城郊已經(jīng)開始大面積種植草莓，集觀光旅游于一體，還能夠增加農(nóng)民的收入。

基因工程的不斷發(fā)展為草莓育種提供了新的技術(shù)手段，可以針對(duì)草莓栽培中不能夠解決或者難以解決的問題有目的地對(duì)草莓進(jìn)行基因改良，而不改變草莓原有的特性。目前在草莓的轉(zhuǎn)基因中，最常用的方法就是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，這個(gè)方法操作較為簡(jiǎn)單，但是轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)化重復(fù)性差。本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化，建立了一個(gè)高效穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)化體系，對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了優(yōu)化。

基因轉(zhuǎn)化中要使用選擇性抗生素有效地篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞。本試驗(yàn)中所用的載體上帶有的篩選基因標(biāo)記是Kan，關(guān)于Kan的濃度已經(jīng)有許多的研究報(bào)道[3-4]，在草莓的遺傳轉(zhuǎn)化中Kan的濃度一般在20～30 mg/L之間[5]，本試驗(yàn)中選擇Kan的最佳濃度為20 mg/L。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中為了抑制農(nóng)桿菌常用Cb作為抑菌性抗生素，本試驗(yàn)對(duì)3種Cb濃度作了比較，結(jié)果表明，使用 350 mg/L Cb可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)而對(duì)外植體造成的傷害不大。這與其他研究者得出的結(jié)論[6-8]不同，可能是由于菌株不同或者菌株活性不同，所用抗生素種類以及濃度也有所不同[9]所致。endprint

菌液的濃度和侵染時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化有很大的影響，菌液濃度過高，對(duì)植物材料的毒害較大，容易導(dǎo)致外植體褐化、壞死，而且后期用抑菌抗生素除菌也很困難；菌液濃度過低，農(nóng)桿菌數(shù)目不多，侵染能力較弱，轉(zhuǎn)化效率也就降低，因此要選擇適宜的菌液濃度才能有效地提高轉(zhuǎn)化效率。侵染時(shí)間過長(zhǎng)容易導(dǎo)致外植體中毒死亡，侵染時(shí)間太短，農(nóng)桿菌不能充分被受傷細(xì)胞吸收，轉(zhuǎn)化效率較低，因此，掌握好侵染時(shí)間有助于提高遺傳轉(zhuǎn)化率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，D600 nm=0.4時(shí)的菌液濃度侵染外植體20 min效果最佳，這與張紅梅等的結(jié)論[10-13]一致。

本試驗(yàn)通過優(yōu)化一系列的轉(zhuǎn)化條件，建立起一個(gè)穩(wěn)定有效的轉(zhuǎn)基因體系，能夠?yàn)榻窈蟛葺幕蚋牧继峁┙梃b。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣天梅，殷學(xué)仁，王平，等. 乙烯調(diào)控非躍變型果實(shí)成熟衰老研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38（2）：371-378.

[2]張勇，湯浩茹，羅婭，等. 草莓FaCBF1基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2014，41（2）：240-248.

[3]張志宏，吳祿平. 草莓主栽品種Tudla遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1998，6（2）：200-204.

[4]金萬梅，尹淑萍，魯韌強(qiáng)，等. GO基因?qū)Σ葺z傳轉(zhuǎn)化及抗病性鑒定[J]. 分子植物育種，2005，3（6）：797-800.

[5]秦永華，張上隆. 草莓轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J]. 遺傳，2007，29（2）：150-156.

[6]Mathews H，Wagoner W，Kellogg J，et al. Genetic transformation of strawberry：stable integration of a gene to control biosynthesis of ethylene[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，1995，31（1）：36-43.

[7]Oosumi T，Gruszewski H A，Blischak L A，et al. High-efficiency transformation of the diploid strawberry （Fragaria vesca） for functional genomics[J]. Planta，2006，223（6）：1219.

[8]Barceló M，Elmansouri I，Mercado J A，et al. Regeneration and transformation via Agrobacterium tumefaciens of the strawberry cultivar Chandler[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1998，54（1）：29-36.

[9]金建鳳，高強(qiáng)，陳勇，等. 轉(zhuǎn)移擬南芥CBF1基因引起水稻植株脯氨酸含量提高[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志，2005，27（1）：73-76.

[10]張紅梅，王俊麗. “全明星”草莓葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 生物技術(shù)，2005，15（3）：68-70.

[11]王俊麗，葛會(huì)波，彭士琪，等. 草莓外源LEAS基因的導(dǎo)入[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2003，30（3）：322-324.

[12]張志宏，吳祿平，代紅艷，等. 草莓主栽品種再生和轉(zhuǎn)化的研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2001，28（3）：189-193.

[13]那杰，王關(guān)林，夏然，等.endprint