李先良+李居寧+彭春雷+趙志常

摘要：以竹葉型荊半夏葉柄為外植體，研究6-BA、2，4-D對半夏一步成苗的影響，以及多效唑（PP333）、茉莉酸甲酯（MJ）、蔗糖對塊莖大小的影響。結(jié)果表明，提高6-BA濃度有利于葉柄誘導(dǎo)率和平均每個(gè)葉柄形成塊莖數(shù)提高，添加低濃度2，4-D有助于提高平均每個(gè)葉柄形成塊莖數(shù)；單因素試驗(yàn)表明，添加多效唑和茉莉酸甲酯、增加蔗糖濃度均能增加塊莖直徑；正交試驗(yàn)表明，4個(gè)因素對半夏塊莖直徑的影響順序?yàn)?-BA濃度、蔗糖濃度、茉莉酸甲酯濃度、多效唑濃度。綜合考慮，荊半夏一步成苗較適宜的培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L PP333+2.0 μmol/L MJ+60 g/L蔗糖。

關(guān)鍵詞：荊半夏；葉柄；一步成苗；塊莖直徑；組培快繁；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S567.23+9.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0042-03

半夏（Pinellia ternata）是天南星科半夏屬的一種多年生草本植物，也是一種以塊莖入藥的傳統(tǒng)中藥材，主要有潤燥化痰、降逆、止嘔等功效[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，半夏還有抗早孕、抗腫瘤、降血脂、護(hù)肝等功能[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中藥處方中，半夏使用頻率居第22位[3]。半夏需求量大，且野生資源匱乏。種莖是半夏人工栽培的主要成本之一，因此通過高效的方法生產(chǎn)半夏種莖是提高半夏人工栽培效益的有效途徑之一。 組培快繁作為一種高效繁殖方法，被應(yīng)用到半夏種莖的繁殖研究中。其中，半夏一步成苗研究較多，通過該方法接種到培養(yǎng)基上的外植體可直接形成完整植株，從而可減少組培快繁中分化成苗的步驟。一步成苗法具有再生周期短、易操作、培養(yǎng)程序簡單等優(yōu)勢，展現(xiàn)了大規(guī)模工廠化生產(chǎn)潛能[4]。另外，一步成苗外植體的來源相對廣泛，葉片、珠芽及塊莖均可作為外植體[4-7]。在一步成苗過程中，不同外植體一般會(huì)經(jīng)歷一段愈傷組織階段，之后愈傷組織分化成苗。分化出的半夏苗可以移栽，也可將產(chǎn)生的塊莖直接作為種莖使用。由于種苗存在運(yùn)輸困難、移栽相對麻煩等問題，因此一步成苗以其產(chǎn)生的塊莖為好。有文獻(xiàn)報(bào)道，外植體可在培養(yǎng)基上形成塊莖[8-9]，但其增殖率不高[6]。另外，作為栽培用的種莖，其直徑大小在1 cm 左右較好[10]。因此，種莖大小也是衡量一次成苗法的指標(biāo)之一。本研究以荊半夏葉柄為外植體，研究不同激素組合﹑蔗糖濃度對一步成苗法產(chǎn)生塊莖數(shù)量和大小的影響，探索并優(yōu)化葉柄外植體一步成苗技術(shù)體系，旨在為推進(jìn)半夏種莖組培快繁的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

半夏取自湖北省荊門市京山縣永漋鎮(zhèn)。葉柄為其中竹葉形半夏葉柄。

1.2方法

1.2.16-BA、2，4-D 對半夏一步成苗的影響葉柄滅菌后，切成1.5 cm左右，平躺接入MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基分別添加0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L 6-BA，1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D，1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D，1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D。

1.2.2多效唑（PP333）、茉莉酸甲酯（MJ）、蔗糖對半夏一步成苗的影響以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D+30 g/L 蔗糖培養(yǎng)基為對照，在此基礎(chǔ)上分別添加0.5、1.0、20 mg/L多效唑或0.5、1.0、2.0 μmol/L茉莉酸甲酯。在培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D基礎(chǔ)上分別添加30、45、60、75 g/L蔗糖。葉柄滅菌后，切成1.5 cm 左右，平躺接入上述培養(yǎng)基。

1.2.3葉柄一步成苗的正交試驗(yàn)以6-BA、多效唑（PP333）、茉莉酸甲酯（MJ）、蔗糖為因素，設(shè)置L9（34）正交試驗(yàn)。正交設(shè)計(jì)見表1。

1.2.4培養(yǎng)條件及結(jié)果統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)條件：溫度（26±2） ℃，光照周期12 h/d，光照度2 000～3 000 lx。每個(gè)處理接4瓶，每瓶接種5個(gè)葉柄。30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。60 d后統(tǒng)計(jì)每個(gè)外植體分化的塊莖數(shù)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理塊莖平均直徑。塊莖計(jì)數(shù)以可分開塊莖為標(biāo)準(zhǔn)。

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的葉片數(shù)/接種的葉片總數(shù)×100%；

平均每個(gè)外植體分化的塊莖數(shù)=分化出的塊莖總數(shù)/分化出塊莖的總?cè)~柄數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.16-BA、2，4-D 對半夏一步成苗的影響

從表2可以看出，在不添加激素條件下葉柄也能形成塊莖，但塊莖是直接形成的，沒有經(jīng)歷成苗階段。培養(yǎng)基添加 6-BA可提高葉柄誘導(dǎo)率，且會(huì)使葉柄經(jīng)歷短暫的愈傷組織階段，然后該愈傷組織分化成苗，在苗生長過程中形成塊莖。隨著6-BA濃度升高，形成塊莖數(shù)增加，塊莖直徑變小。在添加6-BA基礎(chǔ)上，添加2，4-D可以增加塊莖數(shù)，但添加量增加不利于塊莖數(shù)增加，同時(shí)添加2，4-D不利于塊莖增粗。

表26-BA、2，4-D 對半夏一步成苗的影響

激素濃度（mg/L）6-BA2，4-D誘導(dǎo)率

（%）平均每個(gè)葉柄

形成塊莖數(shù)（個(gè)）塊莖平均

直徑（mm）0 0 900.7 7.50.2 0901.8 7.2 0.5 0954.1 5.6 1.0 01007.6 5.3 2.0 01007.7 4.1 1.0 0.1 100 9.6 5.6 1.0 0.2 100 9.5 5.2 1.0 0.5 100 8.5 4.7

2.2多效唑（PP333）、茉莉酸甲酯（MJ）、蔗糖對半夏一步成苗的影響

從表3可以看出，在培養(yǎng)基 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D中添加多效唑?qū)φT導(dǎo)率影響不大，但能使塊莖直徑增大。隨著多效唑濃度升高，每個(gè)葉柄形成塊莖數(shù)減少，塊莖直徑變化不大。添加茉莉酸甲酯既可以降低每個(gè)葉柄形成塊莖數(shù)，也能起到增加塊莖直徑的效果。升高蔗糖濃度對誘導(dǎo)率無影響，但當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到75 g/L時(shí)，部分葉柄因培養(yǎng)基高滲透壓而死亡，升高蔗糖濃度能提高塊莖直徑。endprint

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

為了了解因素之間的相互作用對誘導(dǎo)率、每個(gè)葉柄形成的塊莖數(shù)及塊莖平均直徑的影響，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。從誘導(dǎo)率看，4個(gè)因素對其影響大小順序是蔗糖濃度>6-BA 濃度>MJ濃度> PP333濃度。蔗糖濃度對誘導(dǎo)率的影響源于對培養(yǎng)基滲透壓的改變，高蔗糖濃度形成高滲透壓，進(jìn)而導(dǎo)致部分外植體死亡。因此，不同蔗糖濃度對誘導(dǎo)率造成比較明顯的影響。對誘導(dǎo)率而言，最佳組合為A3B1C3D1。

從平均每個(gè)葉柄形成塊莖數(shù)看，4個(gè)因素對其影響大小順序是6-BA濃度>PP333 濃度>蔗糖濃度> MJ濃度，最佳組合是A3B1C1D3。應(yīng)該指出的是，平均每個(gè)葉柄形成塊莖數(shù)時(shí)，并沒有將因高滲透壓死去的外植體計(jì)算在內(nèi)，故D3水平的該指標(biāo)值較高。因此，同時(shí)考慮誘導(dǎo)率情況下，最佳組合應(yīng)為A3B1C1D2。高濃度蔗糖增加6-BA濃度有利于增加平均每個(gè)葉柄形成塊莖數(shù)，PP333濃度升高不利于增加平均每個(gè)葉柄形成塊莖數(shù)。

塊莖平均直徑對組培塊莖用作栽培種莖而言是一個(gè)重要指標(biāo)。從表4可見，4個(gè)因素對塊莖直徑影響大小順序?yàn)?6-BA 濃度>MJ濃度>蔗糖濃度> PP333濃度。6-BA作為一種細(xì)胞分裂素，對于芽的形成具有重要作用，而半夏的珠芽和塊莖具有類似的解剖結(jié)構(gòu)，珠芽可看作塊莖母體[11]，因此 6-BA對于半夏塊莖的形成具有重要影響，同時(shí)也對半夏塊莖直徑大小具有基礎(chǔ)性作用。對于塊莖直徑而言，最佳組合為A2B3C3D2。

綜合3個(gè)指標(biāo)來看，最佳組合為A3B1C3D2，即MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L PP333+20 μmol/L MJ+60 g/L蔗糖。

3結(jié)論與討論

半夏葉柄來源廣泛，用葉柄作外植體可擴(kuò)大外植體選用范圍。從誘導(dǎo)率和平均單個(gè)外植體形成塊莖數(shù)2個(gè)指標(biāo)看，與葉片外植體一步成苗效果相當(dāng)。因此，葉柄作為一步成苗法的外植體是合適的。葉柄外植體一步成苗過程與葉片一步成苗類似，先脫分化形成愈傷組織，再分化成苗，但愈傷組織階段比較短暫，愈傷組織也不明顯。因此，培養(yǎng)基添加激素種類和濃度能配合其完成這一過程。6-BA在半夏愈傷組織誘導(dǎo)中經(jīng)常被選用[12-18]，半夏葉柄在添加6-BA的培養(yǎng)基上兩端膨大，形成黃綠色愈傷。愈傷脫分化形成芽需要 6-BA 刺激。2，4-D能誘導(dǎo)葉柄產(chǎn)生愈傷組織，顏色淡黃，可能脫分化程度較高。2，4-D在愈傷組織分化過程中不起作用，因此單獨(dú)添加2，4-D并不能最終分化成苗，單獨(dú)添加6-BA能最終分化成苗。6-BA濃度升高可提高誘導(dǎo)率和平均單個(gè)葉柄形成的塊莖數(shù)，這可能是因?yàn)樯?-BA濃度會(huì)增加愈傷組織量。適量升高2，4-D濃度可以增加愈傷組織量，進(jìn)而提高平均單個(gè)葉柄形成的塊莖數(shù)，2，4-D過高會(huì)抑制愈傷組織分化成苗。

半夏一步成苗法不僅要考慮增殖效果，即單位外植體形成苗或塊莖的數(shù)量，還需考慮形成塊莖的大小。多效唑作為一種植物生長延緩劑，通過控制莖葉生長，促進(jìn)光合產(chǎn)物及時(shí)向塊莖轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)植物貯藏器官的增大[19]。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，添加多效唑能起到增加塊莖大小的作用。正交試驗(yàn)中，多效唑?qū)K莖大小的作用不如其他3個(gè)因素，這表明多效唑可能與其他因素，特別是細(xì)胞分裂素之間存在相反作用。茉莉酸甲酯也能促進(jìn)地下器官的形成[20]，從單因素試驗(yàn)結(jié)果看，其具有增加塊莖大小的作用，正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，茉莉酸甲酯對塊莖大小的影響排在第3位。蔗糖在培養(yǎng)基中主要是提供植物在光合作用無法進(jìn)行時(shí)所需的碳源，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)升高蔗糖濃度可以提高塊莖大?。徽辉囼?yàn)結(jié)果表明，其對半夏塊莖直徑影響在4個(gè)因素排在第2位，具有較大影響。

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