王芳+楊笑笑+李振輪+楊水英

摘要：研究礦質(zhì)營養(yǎng)元素硼、鈣、鎂、鐵對(duì)番茄青枯菌在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的影響，同時(shí)研究硼、鈣、鎂、鐵分別對(duì)青枯菌胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性的影響，最后采用盆栽接種法研究復(fù)合礦質(zhì)元素組合對(duì)番茄青枯病發(fā)病率的影響。結(jié)果表明，礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵對(duì)青枯菌在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用；經(jīng)鈣、鎂、鐵處理過的青枯菌胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性均顯著升高，而經(jīng)硼處理過的青枯菌胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性顯著低于對(duì)照組；土壤中添加復(fù)合礦質(zhì)元素組合后，盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，添加礦質(zhì)元素的處理中青枯病菌的數(shù)量減少，番茄青枯病的發(fā)病時(shí)間推遲，并且發(fā)病率減緩。

關(guān)鍵詞：礦質(zhì)元素；青枯病菌；番茄；盆栽試驗(yàn)；生長(zhǎng)；致病力

中圖分類號(hào)： S436.412.1+5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0077-04

番茄青枯菌是一種土傳病原菌，屬于勞爾氏菌屬假單胞桿菌（Ralstonia solanacearum），該菌可在土壤中長(zhǎng)期殘存，通過寄主植物根部的自然孔口或傷口侵入寄主，比如馬鈴薯、番茄、花生、姜、木麻黃、桑、油橄欖、煙草等數(shù)百種植物，一旦侵染就會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的細(xì)菌性萎蔫病，造成植物快速枯死，常給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前尚無有效的防治方法，因此研究防控番茄青枯病的有效方法一直是熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

礦質(zhì)營養(yǎng)元素不僅影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)，而且一些礦質(zhì)營養(yǎng)元素還抑制植物病害的發(fā)生[1]。如 Sugimoto 等研究表明，大豆移栽前及移栽后14 d，噴施甲酸鈣、硝酸鈣都能顯著抑制大豆莖腐病的發(fā)生[2]。李鑫研究指出，感染馬鈴薯Y病毒的煙草噴施鐵元素、銅元素均能不同程度地提高煙株體內(nèi)葉綠素含量，說明鐵元素、銅元素能抑制病毒對(duì)葉綠體的降解，減輕病毒病的癥狀[3]。Dannon等研究硅營養(yǎng)與番茄青枯病的關(guān)系指出，增加硅營養(yǎng)可明顯降低番茄青枯病的發(fā)病率、病情指數(shù)，誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯病產(chǎn)生抗病特性[4-7]。He等研究指出，碳酸鈣可以作為一種土壤改良劑，通過提高土壤中鈣離子濃度來抑制青枯病菌生長(zhǎng)，從而控制由青枯菌引起的煙草青枯病[8]。營養(yǎng)調(diào)控是一條值得探索的新途徑，然而目前尚無鎂、鐵抑制青枯病菌生長(zhǎng)的研究報(bào)道，也沒有硼、鈣、鎂、鐵復(fù)合施用抑制青枯菌生長(zhǎng)及對(duì)青枯病發(fā)生影響的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)研究了硼、鈣、鎂、鐵4種礦質(zhì)營養(yǎng)元素對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，硼、鈣、鎂、鐵可以顯著抑制番茄青枯菌的生長(zhǎng)，同時(shí)4種元素復(fù)合可以顯著延緩番茄青枯病的發(fā)生，研究結(jié)果為利用礦質(zhì)營養(yǎng)元素防治番茄青枯病的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株為番茄青枯病菌，由土壤多尺度界面過程與調(diào)控重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。

供試土壤于2013年6月采自重慶市彭水縣潤溪鎮(zhèn)白果坪，其基本理化性質(zhì)詳見表1。表1供試土壤的基本性質(zhì)

土樣營養(yǎng)元素含量（g/kg）全氮全磷全鉀有機(jī)質(zhì)含水量

（%）有效養(yǎng)分含量（mg/kg）堿解氮速效磷速效鉀pH值

（1 ∶1）正交試驗(yàn)1.700.791.510.019 3926.31119.0092.90270.006.18盆栽試驗(yàn)1.720.623.980.031 5925.1380.5053.36258.036.11

番茄品種為美國大紅王。

礦質(zhì)元素試劑包括MgSO4·7H2O、Na2B4O7·10H2O、Fe2（SO4）3·xH2O、CaSO4·2H2O，以上均為分析純。

基本培養(yǎng)基包括PCCG選擇性培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基。

Hoagland營養(yǎng)液：1 L母液（1），KNO3 101.11 g、KH2PO4 27.28 g、MgSO4 98.61 g；1 L母液（2），Ca（NO3）2 205.05 g；1 L 母液（3）：H2BO3 32.86 g、MnCl2·7H2O 1.81 g、ZnSO4·7H2O 0.22 g、H3MoO4·H2O 0.09 g、CuSO4·5H2O 0.08 g；1 L 母液（4），F(xiàn)eSO4·7H2O 1.39 g、Na·EDTA 1.86 g。每配制1 L營養(yǎng)液需（1）4 mL、（2）5 mL、（3）1 mL、（4）4 mL。

1.2方法

1.2.1硼、鈣、鎂、鐵對(duì)青枯菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)量的影響本試驗(yàn)選擇硼、鈣、鎂、鐵4種礦質(zhì)營養(yǎng)元素，每種元素根據(jù)植物在土壤中缺乏臨界值、毒害臨界值設(shè)10個(gè)濃度處理水平（表2），將不同濃度水平的硼、鈣、鎂、鐵添加到馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，以不添加礦質(zhì)營養(yǎng)元素的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，在30 ℃、160 r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，隔12 h取樣分析培養(yǎng)液D600 nm，估算青枯菌數(shù)量，從而篩選出可抑制青枯病菌生長(zhǎng)的礦質(zhì)元素適宜濃度水平。

1.2.2硼、鈣、鎂、鐵對(duì)番茄青枯菌細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的影響將礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵添加到接種了青枯菌的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，160 r/min、30 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，以不添加硼、鈣、鎂、鐵為對(duì)照。硼、鈣、鎂、鐵濃度水平設(shè)置分別為90、600、400、150 mg/kg。將培養(yǎng)48 h的菌懸液4 ℃、5 000 r/min離心10 min，去除上清液，加適量磷酸緩沖液洗滌2次，離心取沉淀。1 g濕菌體中加入3倍體積的磷酸緩沖液，制成菌懸液，用樣品均質(zhì)破碎儀破碎（6 m/s、40 s），然后12 000 r/min、4 ℃離心 20 min，取上清液，即為粗酶液，用于SOD、POD、CAT活性的測(cè)定，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[3，11]。endprint

1.2.34種礦質(zhì)元素組合對(duì)土壤中青枯菌生長(zhǎng)的影響根據(jù)“1.2.1”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，選取硼、鈣、鎂、鐵4種礦質(zhì)元素中抑制效果較好的幾個(gè)水平（表3），并且在缺乏臨界值和毒害臨界值之間進(jìn)行正交試驗(yàn)。將礦質(zhì)元素鎂、鈣、硼、鐵根據(jù)正交表 L9（34） 進(jìn)行組合（表4），逐次添加到500 g土壤中，混勻后置于1 L三角瓶中滅菌，設(shè)空白對(duì)照。然后接種青枯菌使土壤的含菌量約為0.5億CFU/g，攪拌均勻保持土壤水分相對(duì)濕度為60%，置于30 ℃條件下培養(yǎng)。每隔10 d稱取樣品50.0 g，采用稀釋平板法，在PCCG選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行平板接種，土壤懸液接種量為0.2 mL，每個(gè)稀釋度設(shè)3次重復(fù)，接種后的平板于30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后用Acolyte全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，再根據(jù)稀釋濃度推算CFU值。

1.2.4復(fù)合礦質(zhì)元素組合對(duì)番茄青枯病發(fā)病的影響根據(jù)“1.2.3”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，采用抑制青枯病菌生長(zhǎng)效果良好的復(fù)合礦質(zhì)元素配比進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。取純凈的番茄種子，置于培養(yǎng)皿中的濕濾紙上，在25 ℃的培養(yǎng)箱中催芽48 h，把已催芽的種子播到穴盤中，每隔10 d澆霍格蘭氏營養(yǎng)液（Hoaglands solution），使植株正常生長(zhǎng)。將過篩去除石塊和泥塊的土壤混勻，每個(gè)營養(yǎng)缽裝入1.0 kg土，每個(gè)處理25個(gè)營養(yǎng)缽即25個(gè)重復(fù)。將礦質(zhì)元素鎂、鈣、硼、鐵按組合分別混入土壤中，CK不添加這4種礦質(zhì)元素。滅菌后，按照100萬CFU/g土壤的量接入青枯病菌，3 d后將株高為20～30 cm，6～7張真葉的番茄植株傷根后移入上述土壤中。移苗后進(jìn)行常規(guī)水肥管理，從番茄植株出現(xiàn)第1株病株開始調(diào)查記錄發(fā)病情況：發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%。

1.2.5數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007、SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵對(duì)青枯菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的影響

從表5可以看出，礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵對(duì)青枯菌在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。硼對(duì)青枯菌的抑制作用較強(qiáng)，隨著硼濃度的增大，硼對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)硼的濃度小于60 mg/kg（處理6）時(shí)，其對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制率緩慢增強(qiáng)；當(dāng)硼的濃度大于90 mg/kg（處理7）時(shí)，其對(duì)青枯菌生長(zhǎng)量的抑制作用非常強(qiáng)，抑制率均在70%以上；當(dāng)硼的濃度為200 mg/kg（處理10）時(shí)，抑制率達(dá)到9684%，青枯菌幾乎不生長(zhǎng)，抑制效果為最佳。鈣對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制作用隨著鈣濃度的增大而增強(qiáng)，低濃度的鈣對(duì)青枯菌的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。鈣濃度為600 mg/kg（處理5）時(shí)對(duì)青枯菌生長(zhǎng)量的抑制率顯著大于500 mg/kg（處理5）鈣時(shí)，抑制率增加40.10%。鎂、鐵對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制率也隨濃度的增大而增大。鎂濃度高于500 mg/kg（處理7）時(shí)，對(duì)青枯菌的抑制作用較強(qiáng)；而濃度高于150 mg/kg（處理7）時(shí)，鐵對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制作用較強(qiáng)。

2.2硼、鈣、鎂、鐵對(duì)番茄青枯菌細(xì)胞內(nèi)SOD、POD、CAT幾種酶的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表6）表明，在培養(yǎng)12 h后，與不處理的對(duì)照相比，經(jīng)600 mg/kg鈣、400 mg/kg鎂、150 mg/kg鐵處理過后的番茄青枯菌細(xì)胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性均較對(duì)照顯著升

2.3復(fù)合礦質(zhì)元素組合對(duì)土壤中青枯菌生長(zhǎng)的影響

據(jù)圖1可知，將青枯菌添加到土壤中后，青枯菌的數(shù)量隨著時(shí)間呈現(xiàn)先增后減少的趨勢(shì)。在培養(yǎng)20 d時(shí)，各處理青枯菌的數(shù)量較之前都有明顯的增長(zhǎng)，其中組合1、2對(duì)青枯菌的生長(zhǎng)有顯著地促進(jìn)作用，但是在30 d時(shí)，組合1、2中青枯菌的數(shù)量顯著下降。而在40 d時(shí)，青枯菌的數(shù)量均呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，并且每種組合對(duì)青枯菌的生長(zhǎng)都有顯著的抑制作用。培養(yǎng)20 d后，由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，這4種礦質(zhì)元素組合對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，這可為田間施肥時(shí)間提供一定的理論參考。

2.4土壤中抑制青枯菌生長(zhǎng)的礦質(zhì)元素最佳組合

根據(jù)圖1可知，在添加復(fù)合礦質(zhì)元素的土壤中培養(yǎng)青枯菌至40 d時(shí)，青枯菌的數(shù)量都呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，并且每種組合對(duì)青枯菌的生長(zhǎng)都有顯著的抑制作用。所以筆者選擇40 d時(shí)的結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)。通過對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單的計(jì)算（表7），可以確定理論的最優(yōu)水平組合為A1B2C3D3，即含200 mg/kg鐵的Fe2（SO4）3，含 60 mg/kg 鎂的MgSO4，含 100 mg/kg 硼的Na2B4O7及含400 mg/kg鈣的CaSO4，這4種土壤添加劑能夠有效抑制土壤中青枯菌的生長(zhǎng)，其中極差值最大的是Na2B4O7，即此組合中對(duì)青枯菌抑制作用的主要因子是Na2B4O7，其次是MgSO4，最后是CaSO4。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)土壤中的鈣、鎂、鐵、硼元素達(dá)到一定量時(shí)，對(duì)青枯菌的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。可嘗試通過添加這些元素，并控制添加一定的量，作為土壤添加劑或復(fù)合肥施用于農(nóng)田，從而達(dá)到抑制土壤中青枯菌生長(zhǎng)的目的，具體的施用量還須進(jìn)一步研究。表7礦質(zhì)元素抑菌效果L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5復(fù)合礦質(zhì)元素組合對(duì)番茄青枯病發(fā)病的影響

由圖2可以看出，隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)，添加礦質(zhì)元素可以延緩番茄植株青枯病的發(fā)生，降低青枯病的發(fā)病率?？梢姡寥乐袕?fù)合礦質(zhì)元素的添加對(duì)番茄青枯病的發(fā)生有一定的防效。

3結(jié)論與討論

青枯病是一種土傳植物病害，目前尚無有效的防治方法，雖然一些化學(xué)藥劑有一定的抑制作用，但長(zhǎng)期大量施用帶來的問題越來越嚴(yán)重[12]，因此探索綠色環(huán)保的控制方法具有重

要意義。礦質(zhì)營養(yǎng)元素不僅是植物正常生長(zhǎng)的必需元素，同時(shí)一些研究表明，提高植物組織中某些礦質(zhì)元素的含量可以增強(qiáng)植物對(duì)一些病害的抵抗力[2，13-15]。已有研究結(jié)果表明，礦質(zhì)元素減緩植物病害發(fā)生可能是通過提高植物對(duì)病原菌的抗性，或是礦質(zhì)元素直接抑制病原菌生長(zhǎng)[14，16-17]。然而目前尚無鎂、鐵抑制青枯病菌生長(zhǎng)的研究報(bào)道，也沒有硼、鈣、鎂、鐵復(fù)合施用抑制青枯菌生長(zhǎng)及對(duì)青枯病發(fā)生影響的研究報(bào)道。endprint

本試驗(yàn)系統(tǒng)研究了礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵對(duì)番茄青枯菌生長(zhǎng)及致病力的影響。研究結(jié)果表明，隨著硼濃度的增大，硼對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)硼含量大于20 mg/kg時(shí)，對(duì)青枯菌生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到 12.97%，這與吳衛(wèi)玲的研究結(jié)果[18]一致：0.5 mmol/L硼酸鈉對(duì)青枯病菌生長(zhǎng)抑制率達(dá)18.32%。同時(shí)，硼可以顯著降低青枯菌胞內(nèi)SOD、POD、CAT的活性，表明硼破壞了青枯菌的活性氧代謝系統(tǒng)，加強(qiáng)青枯菌膜脂過氧化，從而抑制青枯菌生長(zhǎng)。研究結(jié)果與黃芳等關(guān)于硼抑制灰霉病菌孢子萌發(fā)機(jī)制的結(jié)果[19]一致：0.1%硼處理可破壞灰霉病菌活性氧清除系統(tǒng)，造成活性氧大量積累，使得膜脂過氧化加強(qiáng)，最終影響細(xì)胞的正常生理功能。低于 400 mg/kg 鈣（硫酸鈣）對(duì)青枯菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而 600 mg/kg 鈣（硫酸鈣）能顯著抑制青枯菌的生長(zhǎng)。李洪研究表明，5 mmol/L氯化鈣能顯著抑制青枯菌的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)16.92%[20]。其原因一方面可能是伴隨陰離子不同，另一方面可能是硫酸鈣的溶解性低于氯化鈣，添加在液體培養(yǎng)基中后，實(shí)際起作用的有效鈣可能會(huì)少。鎂、鐵對(duì)青枯菌生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定的抑制作用，然而鈣、鎂、鐵能顯著增強(qiáng)青枯菌胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性，因此這3種元素不是通過影響青枯菌細(xì)胞中酶的清除氧這一機(jī)制來影響青枯菌的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。礦質(zhì)營養(yǎng)硼、鈣、鎂、鐵與番茄青枯病之間存在相互關(guān)系，摸清病原物、寄主植物與礦質(zhì)元素三者之間的關(guān)系對(duì)從營養(yǎng)調(diào)控方面著手解決茄科類植物青枯病防控問題具有重要意義。

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