陳沖 何勇

炎癥相關(guān)基因多態(tài)性與心臟瓣膜置換術(shù)后華法林療效的相關(guān)性研究

陳沖 何勇

作者單位：525200 廣東省高州市，高州市人民醫(yī)院胸心外科

目的 探討炎性基因IL-17的多態(tài)現(xiàn)象與心臟瓣膜置換術(shù)后華法林療效的關(guān)系。方法 納入我院行心臟瓣膜置換術(shù)采用華法林治療的患者96例作為觀察組，另外納入未采用華法林治療的生物瓣置換術(shù)患者78例作為對照組。采用基因測序的方法確定單核苷酸多態(tài)性的等位基因，分析兩組患者的基因型及臨床特點，探討分析心臟瓣膜置換術(shù)后華法林治療與不同的IL-17基因型之間的關(guān)系；采用Logistic回歸分析基因型與心臟瓣膜置換術(shù)后危險因素之間的相關(guān)性；運用Kaplan-Meier的生存曲線對攜帶IL-17 rs763780及rs2275913兩種基因型患者的生存及療效情況進行分析。結(jié)果 IL-17基因型在兩組的基因型分布是不相同的。通過多因素的Logistic回歸分析顯示，rs763780（OR=2.998，95%CI 1.176～7.639，P=0.023）及rs2275913（OR=2.936，95%CI 1.198～7.246，P=0.019）兩種基因型是心臟瓣膜置換術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的危險因素；術(shù)后攜帶rs763780基因型者心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的風險增加16%，而攜帶rs2275913基因型者心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的風險增加28%。療效及生存分析方面，攜帶rs2275913基因型IL-17高表達的患者生存時間為（37.34±10.90）個月，而低表達的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，IL-17rs2275913基因型表達的高低與預(yù)后有著一定的相關(guān)性。結(jié)論 IL-17的G等位基因是心臟瓣膜置換術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的危險因素；rs2275913基因型與心臟瓣膜置換治療及預(yù)后有著相關(guān)性，可作為心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的危險因素。

心臟瓣膜置換術(shù)； 華法林； 白介素-17； rs2275913基因型； rs763780基因型； 基因多態(tài)性； 炎癥相關(guān)

心臟瓣膜置換大大降低了心臟相關(guān)疾病的死亡率，但是預(yù)后仍不理想，多數(shù)患者治療后仍會發(fā)生各類并發(fā)癥，影響患者的預(yù)后。炎癥相關(guān)性因子與心臟內(nèi)膜疾病密切相關(guān)，越來越被關(guān)注[1,2]。驗證相關(guān)基因IL-17是特異性降解細胞外基質(zhì)和基底膜的主要因素，也是心臟內(nèi)膜疾病最重要的因子，對心血管疾病的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵性作用，為此本研究對IL-17進行不斷深入研究，以提高心臟瓣膜置換的水平[3,4]。已有研究提示，IL-17的G-197A位點上存在著基因多態(tài)性位點，該位點存在在種子序列當中，可以調(diào)控該基因的成熟體；且研究還提示，IL-17基因的上調(diào)與心臟瓣膜疾病有著密切的關(guān)系。華法林對心臟瓣膜置換術(shù)后的治療具有重要的臨床實踐意義[5]。本研究初步探討炎癥相關(guān)基因IL-17多態(tài)性與心臟瓣膜置換術(shù)后華法林治療效果的作用關(guān)系，為進一步探討其與預(yù)后的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入2014年1月至2016年1月我院行心臟瓣膜置換術(shù)后采用華法林治療的患者96例作為觀察組，另外納入未采用華法林治療的生物瓣置換術(shù)患者78例作為對照組，年齡32～66（53.65±10.95）歲。在術(shù)中取材之后，血液標本報告為標準，提取兩組患者的血液標本RNA，送華大基因研究院進行檢測。對所有手術(shù)治療的患者進行隨訪觀察，隨訪時間每月1次。

1.2 試驗試劑和儀器

1.2.1 試劑 Platinum SYBR Green qPCR Super－Mix-UDG（美國Invitroge公司），蛋白酶 K（默克生物公司），TaqMix（東盛生物公司），PCR試劑盒、TaqMan RNA試劑盒（美國Santa Cruz公司），RNA提取試劑盒（美國Sigma），DEPC（上海碧云天生物），乙醇、異丙醇、氯仿（上海碩盟生物）。

1.2.2 儀器 高速冷凍離心機（德國BiofugeS－tratos），-80℃～4℃冰箱（日本松下），PCR儀（澳大利亞 Rotor-gene），紫外分光光度儀（Beckman Coulter公司）。

1.3 RNA提取及qPCR檢測 對納入研究對象的血液標本采用RNA提取試劑盒進行RNA提取，采用TaqMan RNA試劑盒檢測IL-17的相對表達量。采用RNU6作為內(nèi)參進行校正。對IL-17的表達水平采用二步法進行檢測，第一步通過莖環(huán)引物來合成互補DNA，再通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對10 ng RNA進行反應(yīng)。PCR管加入10 μl的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，總的RNA濃度調(diào)整到2 ng/μl，最后加入 5 μl的逆轉(zhuǎn)錄引物，在冰上混勻之后反應(yīng)5 min，接著進行梯度變性反應(yīng)，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72℃、7 min遞減；第二步采用 Platinum SYBR Green qPCR的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為2×的 PCR Taqman Universal的混合液及Taqman RNA的特異性引物，通過逆轉(zhuǎn)錄體系進行反應(yīng)。cDNA共5 μl加入RNA的去酶水當中，將體積擴增至20 μl，通過循環(huán)反應(yīng)94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min遞減的擴張40個循環(huán)之后，對實驗結(jié)果進行分析。采用熒光實時定量反應(yīng)，按照PCR操作說明，Ct的檢測值在20～32之外的需要進行第二次檢測。應(yīng)用△Ct=CtIL-17－CtRNU6的計算公式計算IL-17的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有采集的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)文件。Pearson卡方判斷對照組的基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，正態(tài)分布采用±s表示，組間比較用方差分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗，組間率的比較用卡方檢驗。IL-17各個基因型的差異性表達采用方差分析，兩組比較采用SNK-q檢驗。采用Logistic回歸分析IL-17 rs2275913及 rs763780基因型是否為預(yù)后的危險因素。運用Kaplan-Meier的生存曲線對患者的生存情況進行分析，IL-17 rs763780基因型攜帶者與生存率之間的關(guān)系，統(tǒng)計檢測采用雙尾的檢測方法，應(yīng)用Mann-whitney U檢驗法進行兩兩數(shù)據(jù)之間比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床特征比較 兩組基線資料比較，年齡相比未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），肝腎功能比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?；蛐头植迹^察組的rs2275913基因型所分布的比例明顯高于對照組（P＜0.05），而rs763780基因型的分布比例兩組比較未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。臨床資料顯示對照組的各個基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P=0.75）。見表1。

2.2 嚴重并發(fā)癥發(fā)生人群基本特征 出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥的患者rs2275913基因型的比例要高于未出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥患者，提示IL-17的rs2275913基因型是心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的重要危險因素，年齡、肝腎功能損傷也是主要危險因素。見表2。

2.3 基因型與心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的危險因素 研究結(jié)果顯示，rs2275913及rs763780兩種基因型是心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的危險因素，其中攜帶rs763780基因型，OR=2.998，95%CI 1.176 ～7.639，P=0.023； 攜 帶rs2275913 基因型，OR=2.936，95%CI 1.198～7.246，P=0.019；攜帶rs763780基因型者心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的風險增加16%，而攜帶rs2275913基因型者心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的風險增加28%。從華法林的療效看，治療后攜帶rs763780基因型患者者嚴重并發(fā)癥的風險降低，OR=2.936，95%CI 0.576～1.896，P=0.019；攜帶rs2275913基因型患者嚴重并發(fā)癥風險降低，OR=1.846，95%CI 1.148～2.965，P=0.015，提示華法林可顯著降低兩基因型患者嚴重并發(fā)癥的發(fā)生風險。見表3。

表1 兩組患者臨床特征比較（±s）

表1 兩組患者臨床特征比較（±s）

基因型分布＞50 ≤50 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（U/L） 天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（U/L） 血肌酐（μmol/L） rs2275913 rs763780對照組 78 38 40 21.47±0.45 19.17±4.96 42.36±9.67 6 10觀察組 96 46 50 106.45±72.37 99.86±60.31 169.74±35.65 45 28 t/χ2值 0.53 8.64 7.26 6.77 7.44 P值 0.76 0.00 0.00 0.00 0.00年齡（歲） 肝功能組別 例數(shù)

表2 心臟瓣膜置換術(shù)后肝功能與基因型分布特征比較（±s）

表2 心臟瓣膜置換術(shù)后肝功能與基因型分布特征比較（±s）

組別 例數(shù) 年齡（歲） 肝功能 基因型分布＞50 ≤50 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（U/L） 天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（U/L） 血肌酐（μmol/L） rs2275913 rs763780非嚴重并發(fā)癥組 66 39 27 48.45±17.66 68.16±12.33 69.37±14.67 18 12嚴重并發(fā)癥組 20 16 4 146.75±70.65 156.87±80.34 287.44±135.66 10 7 t/χ2值 3.67 9.54 8.26 7.34 2.34 P值 0.01 0.00 0.00 0.00 0.03

表3 Logistic回歸分析基因型與心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的危險因素分析

2.4 IL-17攜帶rs2275913基因型表達的高低與預(yù)之間的相關(guān)性 96例觀察組患者IL-17的相對表達量為1.436，95%CI 0.323～0.534，表達量低于平均值的有42例，高于平均值的有54例。攜帶rs2275913基因型IL-17高表達的患者生存時間為（37.34±10.90）個月，而低表達的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。IL-17攜帶rs2275913基因型的高低與預(yù)后有著一定的相關(guān)性。

3 討論

心臟瓣膜置換大大降低了心臟疾病的病死率，但是術(shù)后一旦出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，則預(yù)后極差，生存率較低[6]。華法林可以有效防止血栓的擴大，同時溶解血栓，起到消除癥狀、預(yù)防肺栓塞及血栓復(fù)發(fā)的作用，且不增加出血等不良反應(yīng)的發(fā)生概率。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，心臟瓣膜置換的預(yù)后相關(guān)研究越來越深入。研究發(fā)現(xiàn)基因參與疾病的發(fā)生發(fā)展，并與預(yù)后密切相關(guān)，其表達譜還決定病情的嚴重程度，在臨床病理因素中發(fā)揮著重要作用，尤其對于術(shù)后的生存期及預(yù)后具有一定的相關(guān)性。研究提示，特異性的基因可以用于對心臟瓣膜置換術(shù)后預(yù)后的評估，其表達量與疾病的預(yù)后有著一定的相關(guān)性[7-9]。

已有研究表明，IL-17A/F基因多態(tài)性與多種炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病有關(guān)[10-13]。研究還提示，IL-17基因的上調(diào)與心臟炎癥活動有著密切的關(guān)系，但特定區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）可以使人更易罹患疾病[14-16]。已有研究提示，IL-17可以調(diào)控該基因的成熟體，在調(diào)節(jié)局部組織炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用。但是有關(guān)IL-17多態(tài)性與心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生之間的關(guān)系尚未見報道[17]。本研究旨在進一步研究闡明IL-17中的一種多態(tài)現(xiàn)象與心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，進一步了解IL-17基因多態(tài)性與心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生之間的關(guān)系。

通過納入心臟瓣膜置換術(shù)后華法林治療患者的病例樣本，采用基因測序的方法確定單核苷酸多態(tài)性的等位基因，分析心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥的發(fā)生與不同IL-17基因型之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，IL-17基因型在心臟瓣膜置換術(shù)后華法林治療組及對照組中的分布是不同的。多因素的Logistic回歸分析顯示，rs763780及rs2275913兩種基因型是心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的危險因素，攜帶 rs763780 基因型，OR=2.998，95%CI 1.176～7.639，P=0.023； 攜 帶 rs2275913 基 因 型 ，OR=2.936，95%CI 1.198～7.246，P=0.019；攜帶 rs763780基因型者心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的風險將增加16%，而攜帶rs2275913基因型者心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的風險將增加28%。從華法林治療的效果上看，攜帶rs763780基因型的治療后可降低嚴重并發(fā)癥的風險，OR=2.936，95%CI 0.576～1.896，P=0.019；攜帶 rs2275913 基因型降低嚴重并發(fā)癥風險，OR=1.846，95%CI 1.148～2.965，P=0.015。華法林治療之后可顯著降低兩基因型患者的嚴重并發(fā)癥發(fā)生風險。提示出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥的患者rs2275913基因型的比例要高于未出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥患者，IL-17的rs2275913基因型是心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的重要危險因素，而年齡、肝腎功能損傷也是心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的主要危險因素。攜帶rs2275913基因型、老齡、肝腎功能損傷患者心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生風險會明顯增加。生存分析方面，攜帶rs2275913基因型IL-17高表達的患者生存時間為（37.34±10.90）個月，而低表達的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，攜帶 IL-17rs2275913 基因型患者的生存時間要短于攜帶rs763780基因型，提示IL-17rs2275913基因型表達的高低與預(yù)后有著一定的相關(guān)性。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)基因的多態(tài)性在心臟瓣膜置換的調(diào)控機制上具有重要的作用，與術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)病、機制的調(diào)節(jié)及疾病的預(yù)后有著密切的關(guān)性。本研究結(jié)果提示，IL-17 rs2275913基因型可能與心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥及預(yù)后有關(guān)，該差異性表達推測可能是心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生早期的潛在靶點。但是本研究尚存在一定的不足。本研究病例數(shù)還相對較少，還未行長期的預(yù)后隨訪研究。接下來我們將進一步行前瞻性的隊列研究以獲得更多的相關(guān)資料。但是本研究初步揭示了IL-17基因多態(tài)性與心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生之間的相關(guān)性，綜合之前的研究提示rs2275913基因型對心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生的影響可能是通過上調(diào)IL-17的表達，從而啟動心臟瓣膜置換術(shù)后嚴重并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展。隨著進一步的研究，我們相信更多的炎癥相關(guān)基因調(diào)控機制將會得到揭示，從而為心臟瓣膜置換治療及預(yù)后的判斷提供新的方法及依據(jù)。

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Association of inflammation-associated gene polymorphism with Warfarin therapy after cardiac valve replacement

CHEN Chong，HE Yong.Thoracic Surgery，Gaozhou People′s Hospital，Gaozhou 525200，China

Objective To elucidate the relationship between polymorphism of inflammatory gene IL-17 and Warfarin therapy after heart valve replacement.Methods A total of 96 patients were enrolled in this study，and 78 patients who underwent heart valve replacement without warfarin were included in the study.Genomic sequencing.Ninety-six patients who underwent cardiac valve replacement were treated with warfarin as the observation group，and 78 patients who were not treated with warfarin were included as control group.Gene sequencing method was used to determine the content of single nucleoside The polymorphisms of IL-17 and IL-17 were analyzed by using logistic regression analysis.Results The genotype distribution of IL-17 genotype in two groups was different.Logistic regression analysis showed that rs763780 （OR=2.998，95%CI 1.176-7.639，P=0.023）and rs2275913（OR=2.936，95%CI 1.198-7.246，P=0.019）were the risk factors for postoperative complications of heart valve replacement.Patients with rs763780 genotype had an increased risk of serious complications after cardiac valve replacement.While those with rs2275913 genotype had a 28%greater risk of serious complications after heart valve replacement（37.34±10.90）months in the patients with high expression of rs2275913 genotype IL-17 and（54.23±12.43）months in the patients with low expression（P＜0.05）.There were significant differences between the two groups in the survival and survival time The expression of IL-17 rs2275913 genotype had a certain correlation with the prognosis.Conclusion Gallele of IL-17 is a risk factor for postoperative complications of heart valve replacement.The rs2275913 genotype is associated with heart valve replacement and prognosis，and may be a risk factor for heart valve replacement.

Cardiac valve replacement； Warfarin； Interleukin-17； rs2275913 genotype； rs763780 genotype； Gene polymorphism； Inflammation-related

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.09.017

R654.2

A

1672-5301（2017）09-0832-05

2016-10-12）