溫霞 高江峰

鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN-93對(duì)大鼠離體肥厚心肌電生理特性的影響

溫霞 高江峰

作者單位：010000 內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院急診科

目的 探討鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）抑制劑KN-93對(duì)大鼠離體肥厚心肌電生理特性的影響及其抗心律失常的特性。方法 雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）和心肌肥厚組（Hypertrophy，HY組）?？s窄腹主動(dòng)脈制作心肌肥厚模型。手術(shù)6周后，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)模型。運(yùn)用Langendorff心臟離體灌流電生理技術(shù)檢測(cè)整體心肌電生理特性，微電極陣列技術(shù)評(píng)價(jià)心臟傳導(dǎo)情況。結(jié)果 手術(shù)6周后，左室后壁舒張末期厚度及室間隔舒張末期厚度明顯增厚，提示心肌肥厚造模成功。與Sham組相比，HY組心室各部位的單向動(dòng)作電位時(shí)程（APD90）顯著延長(zhǎng)（70.0±5.9比 56.0±3.8，P＜0.01），有效不應(yīng)期（ERP）也顯著延長(zhǎng)（52.0±5.4比 39.0±6.3，P＜0.01）；誘發(fā)動(dòng)作電位電交替閾值中位數(shù)明顯增大（130比 90，P＜0.01）；傳導(dǎo)的時(shí)間離散度明顯增大（31.9±3.8比 5.8±0.32，P＜0.01），且室性心律失常的誘發(fā)率明顯升高（RV 9/12比 2/12，P＜0.05）。HY組使用CaMKⅡ抑制劑KN-93后，APD90（70±5.9比71±4.5，P＞0.05）和ERP（52±5.4比53±4.4，P＞0.05）并無顯著變化，APD電交替閾值也無明顯改變（HY組130比HY+KN-93組130，P＞0.05），但傳導(dǎo)的時(shí)間離散度明顯減?。?.4±0.33比31.9±3.8，P＜0.01），室性心律失常的誘發(fā)率減少（RV HY組9/12比HY+KN-93組2/12，P＜0.05）。結(jié)論 CaMKⅡ抑制劑KN-93對(duì)大鼠離體肥厚心肌APD90、ERP、APD電交替閾值均無明顯影響，但能顯著減小傳導(dǎo)速度離散度；對(duì)傳導(dǎo)的影響可能是KN-93抗心律失常的重要機(jī)制。

鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ； KN-93； 心肌肥厚； 心臟電生理； 心律失常

室性心律失常的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明了。近些年研究表明，鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）過度表達(dá)和持續(xù)激活與室性心律失常關(guān)系密切。一方面，CaMKⅡ激活后可增大晚鈉電流，延長(zhǎng)心肌細(xì)胞復(fù)極時(shí)程，導(dǎo)致早后除極的發(fā)生，引起觸發(fā)活動(dòng)。另一方面，CaMKⅡ過度激活可使蘭尼堿Ⅱ型受體（RYr2）持續(xù)磷酸化，導(dǎo)致舒張期經(jīng)RyR2漏至細(xì)胞的鈣增多，胞內(nèi)鈣濃度的升高使Na+/Ca2+交換體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)，此過程會(huì)產(chǎn)生內(nèi)向電流，容易引發(fā)遲后除極，增加心律失常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1]。

KN-93是CaMKⅡ特異性抑制劑。研究表明，KN-93通過抑制心臟晚鈉電流和肌漿網(wǎng)“鈣漏”來發(fā)揮抗心律失常的作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[2]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，KN-93能調(diào)節(jié)異丙腎上腺素引起的心肌細(xì)胞電生理特性的改變，包括L型鈣電流的增大和心肌細(xì)胞鈣紊亂[3]。本研究使用大鼠肥厚心肌模型，利用離體灌流電生理技術(shù)，觀察KN-93對(duì)整體心臟電生理的影響，闡明KN-93抗心律失常的特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組、模型制作和評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)用雄性SD大鼠（由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供）40只，體重220～250g，隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組（Sham 組，n=20）和心肌肥厚組（HY 組，n=20）。經(jīng)腹腔給予10%濃度水合氯醛（0.3 ml/kg）進(jìn)行麻醉。將麻醉好的大鼠取右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)，沿左側(cè)腹部劃3～5 cm的切口，分離淺筋膜和深筋膜，暴露腹主動(dòng)脈，在雙腎動(dòng)脈上端游離一段大約2 mm的腹主動(dòng)脈，將游離的動(dòng)脈與21F（約6 mm）針頭共同結(jié)扎，拔出針頭，造成腹主動(dòng)脈管腔環(huán)形縮窄50%～60%。假手術(shù)組開腹不結(jié)扎作對(duì)照。術(shù)后青霉素5000 U/只肌肉注射1周，預(yù)防感染。手術(shù)6周后，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心功能，分別記錄左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWs）、室間隔舒張末期厚度（IVDs）。

1.2 離體電生理研究 給予大鼠1200 U/kg充分肝素化，10%水合氯醛麻醉后，迅速取出心臟，置于100%氧飽和的4℃普通臺(tái)式液（NaCl 130 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl21 mmol/L，Na2HPO40.3 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，glucose 10 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，pH 7.35）中剪去心包及周圍結(jié)締組織，洗凈殘血，連接Langendorff心臟灌流裝置，經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流，灌流液為普通的臺(tái)式液。HY組離體心臟檢測(cè)完各項(xiàng)電生理指標(biāo)后換用加有KN-93（1μmol/L）的臺(tái)式液灌流，待30 min后重新測(cè)量各項(xiàng)電生理指標(biāo)。

1.3 心臟各部位單相動(dòng)作電位（MAP）、有效不應(yīng)期、APD電交替閾值與心律失常 ①M(fèi)AP記錄：刺激電極置于高位右心室（起搏周長(zhǎng)分別為250 ms、200 ms、150 ms、100 ms，脈寬 2 ms，刺激強(qiáng)度為舒張期起搏閾值的2倍），分別記錄左室前壁基底部（LAB）、左室前壁心尖部（LAA）、左室后壁基底部（LPB）、左室后壁心尖部（LPA）四個(gè)部位的 MAP。待MAP穩(wěn)定后取8個(gè)連續(xù)的MAP，應(yīng)用Chart 7.3軟件測(cè)量動(dòng)作電位復(fù)極程度達(dá)到90%的時(shí)間（APD90）。②各部位有效不應(yīng)期測(cè)量：將刺激電極置于上述心室4個(gè)部位，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm處進(jìn)行有效不應(yīng)期的測(cè)量。在連續(xù)發(fā)放8個(gè)起搏刺激波（S1）后發(fā)放期前收縮刺激波（S2）（S1S1 間期=250 ms，S1S2起始間期=100 ms）。以每次減少10 ms的幅度降低S1S2間期，如S2能誘發(fā)出動(dòng)作電位，則繼續(xù)降低S1S2間期10 ms；如不能誘發(fā)出動(dòng)作電位，則將S1S2增加10 ms，然后以-1 ms反掃至S2不能誘發(fā)出動(dòng)作電位。此時(shí)的S1S2間期即為心動(dòng)周期（CL），為250 ms時(shí)各個(gè)部位的ERP。③APD電交替測(cè)量：于左室前游離壁行程控S1S1增頻電刺激，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm處。初始PCL為200 ms，依次遞減10 ms直至出現(xiàn)APD電交替。APD電交替定義為快頻率刺激下標(biāo)測(cè)部位連續(xù)2個(gè)動(dòng)作電位的時(shí)程呈長(zhǎng)短交替，其中短APD較長(zhǎng)APD少10 ms以上。④VA誘發(fā)：將刺激電極分別置于左室前游離壁和右室游離壁，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm處，給予50 Hz持續(xù)時(shí)間2 s的Train刺激進(jìn)行VA誘發(fā)，連續(xù)發(fā)放20串。VA持續(xù)時(shí)間超過2 s記為VA可誘發(fā)，VA超過30 s記為持續(xù)性VA。

1.4 離體微電極陣列記錄 記錄使用的微電極為32導(dǎo)多電極，大小為3×3 mm（每個(gè)電極的距離為500μm），能夠記錄接觸的心外膜場(chǎng)電位。記錄位置固定在左室前游離壁，記錄時(shí)間為1 min。從最早被激動(dòng)的點(diǎn)至最晚被激動(dòng)的點(diǎn)所需的時(shí)間定義為總的激動(dòng)時(shí)間（TAT），傳導(dǎo)速度（CV）為總的激動(dòng)時(shí)間與傳導(dǎo)距離的比值，傳導(dǎo)速度的標(biāo)準(zhǔn)差定義為傳導(dǎo)離散度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件（SPSS Inc，Chicago，Illinois）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s表示，三組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Tukey′s方法，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，配對(duì)樣本采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組超聲心動(dòng)圖各項(xiàng)指標(biāo)比較 與Sham組比，HY組左室后壁舒張末期厚度［（0.33±0.03）cm比（0.28±0.03）cm，P＜0.05］、室間隔舒張末期厚度［（0.34±0.03）cm 比（0.29±0.03）cm，P＜0.05］均顯著增厚，而左室射血分?jǐn)?shù)［（86.6±4.6）%比（84.6±6.5）%，P=0.21］和短軸縮短率［（50.8±6.2）%比（48.2±2.7）%，P=0.44］無明顯變化。以上均提示心肌肥厚造模成功。見圖1。

2.2 造模之后APD90、ERP的變化及KN-93對(duì)其的影響 腹主動(dòng)脈縮窄6周后，起搏周長(zhǎng)250 ms、200 ms、150 ms下 APD90均延長(zhǎng)（P 均＜0.01），而CaMKⅡ抑制劑KN-93對(duì)其均無影響（表1、圖2）。與 APD90類似，心臟各部位（LAB、LAA、LPB、LPA）ERP在模型組明顯延長(zhǎng)（P均＜0.01），而KN-93對(duì)心臟各部位ERP無明顯影響（表2）。

表1 兩組在不同起搏周長(zhǎng)下APD90情況；心肌肥厚組使用KN-93 后 APD90變化情況（±s）

表1 兩組在不同起搏周長(zhǎng)下APD90情況；心肌肥厚組使用KN-93 后 APD90變化情況（±s）

注：Sham：假手術(shù)組；HY：心肌肥厚組；APD90：復(fù)極到幅值90%所需的時(shí)間；PCL：起搏周長(zhǎng)。與Sham組相比，aP＜0.01

組別 PCL=250 PCL=200 PCL=150 PCL=100 Sham 組 58.0±3.8 56.0±3.7 55.0±4.3 55.0±3.3 HY 組 72.0±7.7a 72.0±5.5a 71.0±6.7a 66.0±4.5aHY+KN-93 組 74.0±5.4 73.0±4.4 71.0±3.7 68.0±5.0

表2 兩組各部位有效不應(yīng)期情況；心肌肥厚組使用KN-93后ERP 變化情況（±s）

表2 兩組各部位有效不應(yīng)期情況；心肌肥厚組使用KN-93后ERP 變化情況（±s）

注：LAB：左室前壁基底部；LAA：左室前壁心尖部；LPB：左室后壁基地部；LPA：左室后壁心尖部；ERP：有效不應(yīng)期。與Sham組相比，aP＜0.01

組別 LAB LAA LPB LPA Sham 組 36.0±6.1 38.0±7.3 39.0±4.9 42.0±7.0 HY 組 47.0±6.7a 48.0±6.8a 58.0±4.7a 56.0±3.5aHY+KN-93 組 49.0±3.3 51.0±3.7 56.0±3.7 57.0±7.4

2.3 APD電交替閾值、傳導(dǎo)速度離散度的變化 造模之后，APD電交替閾值明顯增大（中位數(shù)Sham組 90，HY 組 130，P＜0.01）；HY 組使用 KN-93后，APD電交替閾值無明顯變化（中位數(shù)HY組130，HY+KN-93 組 130）（圖 3、4）。與 Sham 組相比，HY組傳導(dǎo)速度明顯不穩(wěn)定，1 min傳導(dǎo)速度離散度明顯增大，而KN-93可以明顯穩(wěn)定HY組心臟的傳導(dǎo)（P＜0.01）（圖 5）。

2.4 室性心律失常的誘發(fā) 在Burst的刺激誘發(fā)下，與Sham組相比，HY組室性心律失常的誘發(fā)率明顯升高（LV 4/12比 0/12；RV 9/12比 2/12，P均＜0.05）；KN-93可以明顯抑制HY組室性心律失常的誘發(fā)率（RV 2/12 比 9/12，P＜0.05）（表 3、圖 6）。

表3 兩組Burst刺激左、右室室性心律失常的誘發(fā)情況；心肌肥厚組使用KN-93室性心律失常的誘發(fā)情況

3 討論

心肌肥厚或心衰時(shí)，由于復(fù)極外向電流（鉀電流等）的減少[4,5]及內(nèi)向電流的增加（晚鈉電流等），細(xì)胞復(fù)極時(shí)程明顯延長(zhǎng)[6]。復(fù)極時(shí)程的延長(zhǎng)容易引起早后除極和晚后除極，引發(fā)觸發(fā)活動(dòng)，增加心律失常發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[6]。此外，心室各部位復(fù)極時(shí)程延長(zhǎng)的不一致性，容易形成折返環(huán)，增加折返性心律失常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]。在本研究中我們也觀察到造模后心臟APD90明顯延長(zhǎng)。

研究表明，CaMKⅡ的過度表達(dá)和持續(xù)激活可增大晚鈉電流，而增大的晚鈉電流又可促使CaMKⅡ的持續(xù)激活，形成正反饋[1]。KN-93是CaMKⅡ特異性抑制劑，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，且顯現(xiàn)出良好的抗心律失常效果[1]。既往研究表明，KN-93可以顯著抑制晚鈉電流[8]。然而在本研究中，我們并未觀察到由KN-93抑制晚鈉電流帶來的APD縮短效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)KN-93對(duì)大鼠離體肥厚心肌在不同頻率起搏下的APD90并無顯著改變。最近Bence等報(bào)道，KN-93對(duì)心肌細(xì)胞外向復(fù)極K+有直接的抑制作用[9]，故我們推測(cè)KN-93對(duì)復(fù)極外向K+電流的直接作用抵消了KN-93對(duì)晚鈉電流的間接作用，使復(fù)極時(shí)程無明顯變化。

目前關(guān)于心臟APD電交替機(jī)制尚不清楚，研究認(rèn)為APD電交替的細(xì)胞機(jī)制為鈣交替，與肌漿網(wǎng)上鈣泵SERCA2a和RyR2功能的受損密切相關(guān)，不協(xié)調(diào)性APD電交替與心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[10]。在本研究中我們觀察到，造模之后APD電交替閾值明顯增大，提示造模之后發(fā)生心律失常的風(fēng)險(xiǎn)增大。研究表明，KN-93能穩(wěn)定RyR2的功能，減少舒張期細(xì)胞“鈣漏”[1]，故有理由認(rèn)為KN-93能夠抑制APD電交替的發(fā)生。但令人意外的是，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，KN-93并不能減小肥厚心肌APD電交替的閾值。我們推測(cè)可能是因?yàn)镵N-93在穩(wěn)定RyR2功能的同時(shí)，也會(huì)抑制與SERCA2a結(jié)合的PLB-S17蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制SERCA2a的功能；而SERCA2a功能的抑制則會(huì)促進(jìn)“鈣交替”的發(fā)生，使心肌APD電交替閾值增大[11]。這也可能是KN-93的一大副作用。

很有意思的是，通過微電極陣列技術(shù)我們觀察到KN-93可以明顯穩(wěn)定肥厚心肌的傳導(dǎo)，具體機(jī)制目前尚不清楚，故需進(jìn)一步研究。肥厚心肌傳導(dǎo)速度的不穩(wěn)定可能會(huì)增加折返性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)[12]，而KN-93可以明顯減小傳導(dǎo)速度的離散度。因此我們認(rèn)為，KN-93減少Burst誘發(fā)的室性心律失常與這一作用相關(guān)，至少部分與此相關(guān)。

作為CaMKⅡ特異性抑制劑，KN-93已顯現(xiàn)出較好的抗心律失常作用，但既往研究偏重于KN-93對(duì)細(xì)胞和離體通道的作用，而關(guān)于KN-93對(duì)整體心臟的抗心律失常特性知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)KN-93并不能明顯縮短離體肥厚心肌APD90，也不能減小離體肥厚心肌APD電交替閾值，但卻可以改善傳導(dǎo)。本研究豐富了我們對(duì)KN-93抗心律失常特性的認(rèn)識(shí)，為推動(dòng)KN-93的臨床應(yīng)用提供了更多的依據(jù)。

（本文圖片見后插六）

［1］Mustroph J，Neef S，Maier L，et al.CaMKⅡ as a target for arrhythmia suppression.Pharmacol Ther，2016，176：22-31.

［2］Liang F，F(xiàn)an P，Jia J，et al.Inhibitions of late INa and CaMKⅡ act synergistically to prevent A TX-Ⅱ induced atrial fibrillation in isolated rat right atria.J Mol Cell Cardiol，2016，94：122-130.

［3］黃燕，黃從新，王丹丹，等.鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ抑制劑對(duì)心肌細(xì)胞電生理特性的調(diào)節(jié)作用.中華心律失常學(xué)雜志，2016，20：229-235.

［4］Steng M，Ramaker C，Donker DW，et al.Temporal patterns of electrical remodeling in canine ventricular hypertrophy：focus on IKs downregulation and blunted beta-adrenergic activation.Cardiovasc Res，2016，72：90-100.

［5］Nuss HB，Kaab S，Kass DA，et al.Cellular basis of ventricular arrhythmias and abnormal automaticity in heart failure.Am J Physiol，1999，277：80-91.

［6］Karagueuzian HS，Pezhouman A，Angelini M，et al.Enhanced late Na and Ca currents as effective ahtiarrhythmic drug targets.Front Pharmacol，2017，8：36.

［7］Liu T，Shi SB，Qin M，et al.Effects of dantrolene treatment on ventricular electrophysiology and arrhythmogenesis in rats with chronic β-adrenergic receptor activation.J Cardiovasc Pharmcol Ther，2015，20：414-427.

［8］Saq CM，Mallwitz A，Wagner S，et al.Enhanced late INa induces proarrhythmogenic SR Ca leak in a CaMKⅡ-dependent manner.J Mol Cell Cardiol，2014，76：94-105.

［9］Hegyi B，Ye CL，Zhong J，et al.KN-93 inhibits Ikr in mammalian cardiomyocytes.J Mol Cell Cardiol，2015，89：173-176.

［10］Narayan SM，Bayer JD，Lalani G，et al.Action potential dynamics explain arrhythmic vulnerability in human heart failure：a clinical and modeling study implicating abnormal calcium handling.J Am Coll Cardiol，2008，52：1782-1792.

［11］Culter MJ，Wan XP，Plummer BN，et al.Targeted SERCA2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.Circulation，2012，126：2095-2104.

［12］Sedmera D，Neckar J，Benes J，et al.Changes in myocardial composition and conduction properties in rat heart failure model induced by chronic volume overload.Fornt Physiol，2016，7：367.

The influence of KN-93，the inhibitor of CaMKⅡ，on the cardiac electrophysiology of hypertrophy rats

WEN Xia，GAO Jiang-feng.The Department of Emergency，Inner Mongolia Autonomous Region People′s Hospital，Hohhot 010000，China

GAO Jiang-feng，E-mail：wangdandan0806@126.com

Objective The aim of the study was to explore the effect of KN-93 on the cardiac electrophysiology in vitro hypertrophic heart.SD rats were randomly divided into sham group（Sham），hypertrophy group（HY）.Methods A rat model of Cardiac hypertrophy in vivo was established by constriction of abdominal aorta.Cardiac function was evaluated via echocardiography.The cardiac electrophysiology was tested in perfused hearts and the electrical conduction was measured by microelectrode array.Results The left ventricular diastolic wall thickness（LVPWd）and ventricular septal diastolic thickness（IVSd）were significantly increased after 6 weeks of abdominal aortic constriction.Compared with Sham group，both of the action potential duration at 90%（APD90）（56±3.8 vs 70±5.9，P＜0.01）and the effective refractory period（ERP）（39±6.3 vs 52±5.4，P＜0.01）were significantly increased in HY group.Furthermore，the threshold of APD alternate（ADP-ALT）（Sham:90 vs HY:130，P＜0.01），the dispersion of conduction velocity（5.8±0.32 vs 31.9±3.8，P＜0.01）and the incidence of VA（RV Sham:2/12 vs HY:9/12，P＜0.05）were also significantly increased in HY group compared with Sham group.The APD90（70±5.9 vs 71±4.5，P＞0.05），ERP（52±5.4 vs 53±4.4，P＞0.05），and APD-ALT（HY:130 vs HY+KN93:130，P＞0.05）were showed no significant change in HY group after administration KN-93.However，the increased dispersion of conduction velocity（31.9±3.8 vs 4.4±0.33，P＜0.01）and incidence of VA（RV HY:9/12 vs HY+KN-93:2/12，P＜0.05）in HY group were decreased by administration of KN-93.Conclusion CaMKⅡ inhibitor KN-93 had no significant effect on the APD，ERP，and APD alternans，but it could significantly reduce the dispersion ofconduction velocity in hypertrophy hearts.The effect of KN-93 on the conduction velocity may be an important mechanism of antiarrhythmic.

CaMKⅡ； KN-93； Cardiac electrophysiology； Hypertrophy； Arrhythmias

高江峰，E-mail：wangdandan0806@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.09.022

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）09-0854-04

2016-12-07）