鄭 宏，張昕洋，魯雨荍，曾子修，梁 曉，劉雪梅△(. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 00078； . 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 0009)

【方藥研究】

苦碟子注射液對氧糖剝奪損傷的C6膠質(zhì)細胞凋亡與自噬調(diào)節(jié)作用?

鄭 宏1，張昕洋2，魯雨荍1，曾子修2，梁 曉2，劉雪梅1△
(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

目的: 研究苦碟子注射液對氧糖剝奪損傷C6膠質(zhì)細胞凋亡與自噬的調(diào)節(jié)作用，明確其對氧糖剝奪損傷膠質(zhì)細胞的保護作用。方法: 采用氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)的方法建立C6膠質(zhì)細胞損傷模型，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、氧糖剝奪/復(fù)氧模型組、苦碟子注射液組、自噬抑制劑(3-MA)組4組，AnnexinV FITC/PI 雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率，免疫熒光染色法觀察活化caspase-3 表達， western blotting 法檢測LC3II蛋白表達。結(jié)果：氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后LC3II蛋白表達增加，細胞凋亡率升高，苦碟子注射液能夠顯著降低C6膠質(zhì)細胞凋亡率，增加LC3II蛋白高表達。結(jié)論：苦碟子注射液能夠降低C6膠質(zhì)細胞凋亡率，進一步激活細胞自噬而發(fā)揮保護作用。

C6膠質(zhì)細胞；氧糖剝奪；急性腦梗死；凋亡；自噬

缺血性腦卒中是由于供應(yīng)腦部的血管狹窄或者發(fā)生急性閉塞，從而導(dǎo)致該供血區(qū)域的腦組織出現(xiàn)功能障礙的疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率及高致殘率等特點，是對人類健康及生存構(gòu)成嚴重威脅的主要疾病之一[1-2]。膠質(zhì)細胞約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞總數(shù)的90%，不僅具有支撐、提供營養(yǎng)及協(xié)助代謝等輔助作用，而且參與神經(jīng)元的通訊并促進突觸形成和神經(jīng)再生等功能。

自噬作為自體修復(fù)的重要過程，適度激活可能幫助清除受損的細胞器和異常蛋白，防止蛋白聚集，抑制細胞凋亡，防止細胞死亡，從而對細胞起保護作用。也有研究認為，自噬會直接導(dǎo)致細胞的死亡，并與凋亡信號存在交互作用[3-4]?？嗟幼⑸湟壕哂谢钛雇?、清熱祛瘀的功效，廣泛應(yīng)用于中風(fēng)病急性期的治療。研究發(fā)現(xiàn)，苦碟子注射液可以保護急性腦缺血再灌注損傷大鼠，降低腦梗死體積[5]。其對氧糖剝奪損傷的C6膠質(zhì)細胞是否具有保護作用，其作用機制與細胞凋亡和自噬是否有關(guān)聯(lián)？目前尚未闡清。本文探討自噬和凋亡在膠質(zhì)細胞中的調(diào)節(jié)作用，并運用苦碟子注射液組對此進行干預(yù)，闡釋其治療急性腦梗死的細胞機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞株購自北京協(xié)和細胞資源中心(貨號3111C0001CCC000131)。

1.2 主要試劑

苦碟子注射液(碟脈靈，通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號140304)，無糖Kreb’s液(Macgene，CM012)，1640培養(yǎng)基(Gibco，11875-085)，胎牛血清(ScienCell, 0025)，AnnexinV FITC/PI檢測試劑盒(Roche，11684795910)，RIPA裂解液(Sigma，R0278)，磷酸酶、蛋白酶抑制劑(Thermo，78443)，BCA蛋白定量試劑盒(Thermo，23225)，抗β-actin兔多克隆抗體(Santa Cruz，sc-47778)，cleaved caspase3 兔單克隆抗體(CST，9664)，LC3II 兔單克隆抗體(CST，3868)，羊抗兔IgG-HRP(Jackson，111035003)。

1.3 主要儀器

倒置熒光相差顯微鏡(Olympus，IX71)，模塊化低氧培養(yǎng)裝置(Billups-rothenberg，MIC-101)，測氧儀(Nuvair)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V500)，流式細胞儀(Beckman，F(xiàn)ACS-420)，Mini-垂直電泳系統(tǒng)(Invitrogen，121201-0899)，轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-RAD, 153 BR 65818)，凝膠成像分析儀(Gene，5000P91DW)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及收集

細胞復(fù)蘇后24 h更換新鮮生長培養(yǎng)基(90% 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清)，待細胞密度增加至90%以上時0.25%胰酶消化，收集細胞用于western blot細胞鋪于100 mm直徑的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)。

2.2 氧糖剝奪/復(fù)氧損傷模型(OGD/R)

實驗裝置采用模塊化缺氧培養(yǎng)裝置。通入 95% N2和5% CO2混合氣充分置換空氣10 min后，將裝置連同細胞放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。缺氧時間結(jié)束后吸棄無糖 Kreb's 液，DPBS緩沖液漂洗1次，換成常規(guī)培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)復(fù)氧6 h。正常細胞組加入常規(guī)培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2中正常培養(yǎng)，時間與各模型組保持一致。

2.3 分組與給藥方式

對照組(Control)正常培養(yǎng)的細胞；氧糖剝奪/復(fù)氧模型組(OGD/R)氧糖剝奪時間為24 h，復(fù)氧時間為6 h；苦碟子注射液組(KDZ)在氧糖剝奪的同時，給予苦碟子注射液1.25%濃度進行干預(yù)；自噬抑制劑3-MA對照組(3-MA)在氧糖剝奪的同時，給予10mM 3-MA進行干預(yù)。

2.4 AnnexinV FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率

細胞加入0.125% 的胰蛋白酶0.5 ml，置37° 5～10 min進行細胞消化；加入含血清的培養(yǎng)液2 ml終止消化，吸管輕輕吹散細胞成懸液；1000 rpm離心8 min棄上清,加入2～3 ml冷的PBS液，輕輕吹打使細胞懸??；1000 rpm離心8 min棄上清；加入100 μL的Binding Buffer輕輕吹打；加入5 μl Annexin/FIT和lul 100 μg/ml的 PI 溶液，再加入400 μl結(jié)合緩沖液輕輕搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min加入200 μL的Binding Buffer輕輕搖勻后，用200目篩網(wǎng)過濾；激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長分別為530 nm和575 nm，流式細胞儀檢測分析。

2.5 免疫熒光染色法觀察細胞凋亡

細胞以 1×105/mL密度接種至 35 mm 培養(yǎng)于共聚焦專用培養(yǎng)皿內(nèi)。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS液漂洗3 min×3次；4% 多聚甲醛固定，室溫 15 min，PBS 液漂洗3 min×3次；3% Triton X-100 透膜，室溫 20 min，PBS液漂洗5 min×3次；5% 山羊血清進行封閉，室溫孵育 30 min；加入cleaved caspase-3兔單克隆抗體(1∶200)，4 ℃ 孵育過夜。吸棄一抗，PBS 液漂洗5 min×3 次；加入稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗兔 IgG 熒光二抗(1∶500)，室溫避光孵育 40 min。PBS液漂洗5 min×3 次；加入 DAPI 液(1∶200)，室溫孵育15 min，PBS液漂洗5 min×3 次；在激發(fā)波長 488 nm、發(fā)射波長 527 nm條件下，激光掃描共聚焦顯微鏡拍照。

2.6 Western blotting法測定蛋白

2.6.1 細胞總蛋白的提取 細胞加入RIPA細胞裂解液 150 μl/孔，磷酸酶蛋白酶抑制劑1.5 μl/孔，冰上孵育30 min。細胞刮刀收集細胞，14000 rpm、4 ℃ 離心 15 min，保留上清即為總蛋白。

2.6.2 采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度 加入適量RIPA緩沖液，將各組蛋白濃度調(diào)整至相同濃度，95 ℃、5 min變性；使用10%SDS-PAGE預(yù)制膠進行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉 1 h。TBST洗3次，每次10 min，加入用脫脂牛奶稀釋的LC3II兔單克隆一抗(1∶1000)，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次10 min；加入羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；最后滴加ECL液顯影、拍照，內(nèi)參照用β-actin。圖像采用Image J軟件進行處理分析，計算灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 苦碟子注射液對氧糖剝奪損傷C6細胞凋亡的影響

免疫熒光染色：采用活化的 caspase-3 熒光染色觀察細胞凋亡情況。其主要作用于細胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光，DAPI 作用于細胞核呈現(xiàn)藍色熒光(熒光圖見圖1A)。

圖1 苦碟子注射液對氧糖剝奪損傷C6膠質(zhì)細胞凋亡的影響注：A 熒光染色圖；B 流式細胞圖。

流式細胞術(shù)：表1顯示，采用 Annexine V FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率，4個象限中，右下代表早期凋亡，右上代表中晚期凋亡，左下為正常細胞，左上代表死亡的細胞(流式圖見圖1B)。

與正常組比較，OGD24 h/R6h模型組細胞綠色熒光增強(圖1A)，位于細胞核的藍色熒光出現(xiàn)固縮和分散狀，且右下和右上象限的細胞增多，細胞凋亡率(35.87±2.67)%明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示細胞凋亡明顯；與 OGD24 h/R6h 模型組比較，1.25%苦碟子注射液組和 3-MA 組的細胞綠色熒光減弱，右下和右上象限的細胞數(shù)量減少，1.25%苦碟子注射液組細胞凋亡率(14.25±0.34)%、3-MA 組細胞凋亡率(16.57±0.49)%均明顯降低(P<0.01)，但仍高于正常組水平。

表1 苦碟子注射液對氧糖剝奪損傷的C6膠質(zhì)細胞凋亡率和LC3II蛋白的影響

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與OGD/R模型組比較:#P<0.01

4.2 苦碟子注射對氧糖剝奪損傷的C6 細胞LC3II蛋白表達的影響

圖2表1顯示，western blotting法：正常組LC3II蛋白表達非常低，3-MA組細胞LC3II蛋白表達略高于正常組(P<0.01)。與正常組比較，OGD24 h/R6h模型組細胞LC3II蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與OGD24 h/R6h模型組比較，苦碟子注射液組LC3II蛋白表達進一步增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 苦碟子注射液對氧糖剝奪損傷C6細胞LC3II蛋白表達的影響

5 討論

近年來學(xué)者們認為，腦的正常運行不僅僅是神經(jīng)元的作用，而是依靠血管神經(jīng)單元中各個成分的功能交互而實現(xiàn)，因此研究神經(jīng)血管單元的意義十分重大[6]。本研究從膠質(zhì)細胞入手，明確膠質(zhì)細胞與自噬、凋亡的相關(guān)性，對于研究缺血性腦卒中的發(fā)病機制具有重要意義。

細胞死亡類型包括程序性死亡和壞死，而程序性死亡又分為凋亡(I型程序性死亡)和自噬(II型程序性死亡)。自噬過程是通過將受損細胞器、衰老細胞或者一些自身細胞內(nèi)的異物用一個雙層膜包裹形成自噬體后，再被運送至與溶酶體融合，從而降解自噬體內(nèi)所包裹的內(nèi)容物來完成[7-8]。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)作為自噬相關(guān)基因Atg8的同源物，對自噬體的形成至關(guān)重要，是參與自噬體形成的標(biāo)志分子[9-10]。當(dāng)細胞發(fā)生自噬后，LC3 的表達明顯增加，因此 LC3 的表達量可以準(zhǔn)確地反映細胞自噬被促進或是被抑制的程度。LC3 的前體經(jīng)過加工而形成 LC3-I，與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，從而形成 LC3-II。LC3-II 存在于自噬前體和自噬體膜上，目前已成為自噬體檢測特異性較高的標(biāo)志蛋白基因。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)是細胞發(fā)生凋亡的主要執(zhí)行者，是細胞凋亡發(fā)生過程中的核心效應(yīng)酶。缺血再灌注時可產(chǎn)生多種信號分子，它們作用于相應(yīng)的底物，誘導(dǎo) Caspase-3 激活，進而促使細胞發(fā)生凋亡。因此也將Caspase-3 稱為“死亡蛋白”，它的表達標(biāo)志細胞必定發(fā)生凋亡[11]。

有研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血后缺血中央?yún)^(qū)主要表現(xiàn)為壞死，而缺血半暗帶區(qū)主要表現(xiàn)為凋亡和自噬[12]。自噬與凋亡之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系，二者有著共同的上游信號(Ca2+、過氧化物等)，在應(yīng)激的狀態(tài)下可被單獨激活或者二者同時被激活[13]。Ginet等在新生大鼠永久性腦梗死模型中研究發(fā)現(xiàn)，大鼠梗死側(cè)皮層一些神經(jīng)元不僅存在自噬的表達水平增高，同時還表現(xiàn)出凋亡。董琳等觀察PC12 細胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后細胞自噬及凋亡現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)隨著氧糖剝奪時間的延長，細胞凋亡率顯著增高，自噬相關(guān)蛋白呈先上升后平穩(wěn)下降的表達趨勢[14]。這些研究與我們的研究結(jié)果亦有部分一致性，即自噬在氧糖剝奪損傷的膠質(zhì)細胞保護中起著重要作用，且與凋亡存在負相關(guān)的關(guān)系。

苦碟子注射液的主要化學(xué)成分為黃酮類、腺苷、倍半萜內(nèi)酯類等?，F(xiàn)代研究表明，苦碟子注射液可以抑制炎癥反應(yīng)，改善血管內(nèi)皮功能，對腦缺血有一定的保護作用[15]?？嗟幼⑸湟嚎山档图毙阅X梗死后患者IL-6、TNF-α水平,表明其可能從抑制炎癥反應(yīng)方面對腦梗死發(fā)揮治療作用[16]。團隊前期整體實驗[17]研究發(fā)現(xiàn)，苦碟子注射液可以改善MCAO模型大鼠梗死部位病理形態(tài)，下調(diào)NF-KB的表達。應(yīng)用人腦微血管內(nèi)皮細胞的體外實驗發(fā)現(xiàn)，苦碟子注射液可以下調(diào)高糖損傷細胞模型ICAM-1與VCAM-1的表達[18]。以上臨床、整體實驗、體外實驗研究均表明，苦碟子注射液對急性腦梗死具有神經(jīng)保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，苦碟子注射液治療后可進一步激活自噬增強，降低細胞凋亡，保護膠質(zhì)細胞，給予3-MA后LC3-II明顯降低表明自噬被有效抑制。然而凋亡關(guān)鍵因子caspase-3的表達水平卻有所升高，說明苦碟子注射液可能通過自噬與凋亡的共同調(diào)節(jié)而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

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Effect of Kudiezi Injection between Autophagy and Apoptosis in C6 Glial Cells Exposed by Oxygen Glucose Deprivation

ZHENG Hong1, ZHANG Xin-yang2, LU Yu-qiao1, ZENG Zi-xiu2, LIANG Xiao2, LIU Xue-mei1△
(1.DongfangHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing1000178,China; 2.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objectives: To study the regulatory effects of Kudiezi injection on the apoptosis and autophagy of C6 glial cells, which are exposed oxygen glucose deprivation / reoxygenation injury, and clarify its neuroprotective effect on glial cells damaged by oxygen and glucose deprivation. Methods: C6 glia cells were exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD/R) stress. The cells were randomly divided into four groups: control group, OGD/R group, Kudiezi injection group and autophagy inhibit (3-MA) group. Apoptosis and cleaved caspase-3 were detected by Annexin V FITC / PI double staining and immunofluorescence staining. The protein expression of LCII3 was detected by western blotting. Results: Oxygen-glucose deprivation /reoxygenation injury C6 cells activated LCII3 protein expression increased, apoptosis increased significantly. Kudiezi injection could further activate autophagy and increase the protein expression of LCII3, while reduce the rate of apoptosis. Conclusons: Kudiezi injection can reduce the apoptosis, and further activate autophagy, and plays a protective role in C6 glia cells.

C6 glia cells; Oxygen deprivation; Acute ischemic stroke; Apoptosis; Autophagy

國家國際科技合作專項項目(2015DFA31130)-清熱活血組分治療急性腦梗死；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(973項目)(2012CB518406)-治療心血管疾病有效方劑組分配伍規(guī)律研究; 國家自然科學(xué)基金資助項目(81202683)-從膠質(zhì)細胞TAK1-NF-kB通絡(luò)調(diào)控炎癥反應(yīng)失衡切入研究清腦丸對急性腦缺血的干預(yù)效應(yīng)機制

鄭 宏(1966-),女，主管技師，從事中醫(yī)藥防治腦病實驗技術(shù)研究。

△通訊作者：劉雪梅(1979-)，女，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治腦病應(yīng)用基礎(chǔ)研究，E-mail:liuxuemei@bucm.edu.cn。

R285.5

B

1006-3250(2017)08-1154-04

2017-02-26