2013年滁州市艾滋病病人亞型和耐藥結果分析

郭顏艷

1安徽理工大學 安徽淮南 232001；2滁州市疾病預防控制中心 安徽滁州 239001

2013年滁州市艾滋病病人亞型和耐藥結果分析

郭顏艷1，2

1安徽理工大學 安徽淮南 232001；2滁州市疾病預防控制中心 安徽滁州 239001

自從1996年提出的HAART（高效抗逆轉錄病毒治療）一方面顯著降低了艾滋病的死亡率和發(fā)病率，提高了艾滋病患者的生存質量，延長了艾滋病患者的生命，并且降低了傳染性，但是另一方面HIV-1具有高度的變異性和抗病毒藥物的選擇性壓力，且部分艾滋病病人的依從性差，導致HIV病毒產(chǎn)生耐藥突變。此次將滁州市2013年滁州市在治療大于一年的艾滋病病人的耐藥結果和亞型進行分析，為艾滋病病人的治療做出療效評估和監(jiān)測。

滁州市；艾滋??；耐藥

1 材料與方法

1.1 樣品：采集滁州市2012年12月31日前所有在治療艾滋病病人血漿共 174份進行病毒載量檢測，選取病毒載量檢測值＞1000CPS/ml的12位病人血漿繼續(xù)進行HIV-1耐藥基因型檢測。

1.2 RNA提取 提取試劑采用法國梅里埃 NucliSENS miniMAG（1.0）核酸提取試劑手工提取。將 200ml病人血漿樣本加到裂解液管后充分混勻，并將試管在室溫中靜置裂解孵育10分鐘以上，將二氧化硅和內(nèi)標的混合液100ul加入裂解液中靜置孵育10分鐘以上，嚴格按照操作說明書進行手工清洗，最后用洗脫緩沖液把吸附的核酸洗脫下來。洗脫下來的核酸及時轉移到無DNase和RNase的樣品保存管中。

1.3 NASBA反應 加入引物在65度1分鐘，41度1分鐘預擴增，加酶在41度等溫擴增1個小時。

1.4 巢式聚合酶聯(lián)鏈式反應 使用反擴轉錄巢式 PCR擴增HIV-1POL基因區(qū)片段。RNA逆轉錄和巢式第一輪PCR反應體系使用的是Takara公司的一步法試劑盒AMV（Takara one step RNA PCR kit）試劑盒.第二輪擴增使用TIANGEN 2×Taq PCR Master Mix試劑對第一輪的擴增產(chǎn)物進行第二輪 PCR。兩輪擴增產(chǎn)物目的片段約為1200bp.

1.5 RT-PCR 反轉錄擴增反應和第二輪擴增反應 第一輪擴增：引物 MAW26、HBX2、RT21、HBX2 各 0.5ul，酶 1ul，buffer12.5ul，無酶水5.5ul，RNA模板5ul，終體積為25ul。第二輪擴增：引物PRO-1、HBX2、RT20各1ul，MIX25ul，無酶水18ul，RNA模板5ul，終體積為50度。

1.6 電泳 二輪PCR后的擴增產(chǎn)物用EB作核酸染料跑1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 測序 PCR產(chǎn)物送由博邁德公司純化和測序。

1.8 把所得到的fasta格式的程序文件提交斯坦福大學HIV耐藥數(shù)據(jù)庫（SHDB）得到耐藥結果。

2.結果

2.1 此次收集標本均為2012年12月31日前所以在治療艾滋病病人血漿共174份。

其中病毒載量檢測檢測值＞1000的共12人。并對12人進行耐藥檢測.其中異性傳播10例，同性傳播2例，男性8人，女性4人。

2.2 亞型結果分析 在POL區(qū)的亞型結果分析中，12例標本中有CRF01-AE重組亞型8例為最多，占66.7%（8/12），且兩例同性傳播亞型均為CRF01-AE重組亞型，其余四例均為B亞型。

2.3 耐藥基因情況分析

在12名抗病毒治療的病人標本中有7例24個突變位點，沒有出現(xiàn)蛋白酶抑制劑主要耐藥相關突變，其中5例出現(xiàn)NRTIs和NNRTIs雙突變。其中M184V和K103N位點突變次數(shù)最多，分別為4例。K65R位點突變頻率為2次。見表1.

表1 ：滁州市在治療HIV-1病人相關耐藥突變

3.討論

隨著高效抗逆轉錄病毒治療在我國廣泛應用，以及不斷增長的HIV-1感染者人數(shù)。單一或者多重艾滋病病毒耐藥株也隨之產(chǎn)生并傳播。同時隨著耐藥株越來越多的出現(xiàn)，導致耐藥株的流行，以至于原發(fā)性耐藥感染者初次接受抗病毒治療后可能失敗或者無法持續(xù)控制HIV-1病毒復制。截止2012年12底我市在治療病人共 個，有12名病人病毒載量檢測值＞1000cps/ml，且只有7人出現(xiàn)不同程度耐藥突變，但是都沒有PI主要突變和次要突變，說明目前使用的一線藥物對我市絕大部分HIV-1病人有效。在這12個病人的治療方案全部使用3TC，所以針對3TC的M184V位點頻率最高，引起3TC、FTC的高度耐藥同時引起 ABC的潛在耐藥。在一些調查研究中表明，K103N是所有NNRTIS治療的所有病人里最普遍和重要的突變，可能會對所有的非核苷類反轉錄酶抑制劑產(chǎn)生20到50貝的耐藥性。我市的12名病人突變次數(shù)最多K103N，和研究結果一致。12名病人中，治療時間最長的病人只出現(xiàn)V106R突變，沒有產(chǎn)生耐藥，而出現(xiàn)多重藥物重度耐藥的病人治療時間才兩年。隨訪表明病人的服藥依從性差。在我市病人中，外出務工病人占了一部分，回來不便等各種原因導致服藥依從性差，還有長期使用同一種治療方案都有可能導致耐藥相關突變。要盡量可能提高這部分人群的服藥依從性，否則即使使用二線藥，也有可能產(chǎn)生耐藥或者治療失敗。且現(xiàn)在我市新發(fā)病人中MSM成了主力軍，據(jù)研究報道我國的男男新發(fā)感染人群里的原發(fā)性耐藥率竟然高達 14.4%，所以有必要對此人群進行治療前耐藥檢測。在我實驗室，耐藥檢測工作還未能開展，為了指導臨床用藥，為了艾滋病防控提供技術支持，

[1]吳建軍，刑輝，沈月蘭，等.2008年安徽省原發(fā)HIV-1感染者耐藥毒株變異情況研究[J].中華疾病控制雜志，2011，15（1）：33-35

[2]劉建芳，嚴延生，林勛，等.福建省 HIV-1流行毒株基因分型與流行特征分析[J].中國人獸共患病學報，2006，22（7）：601-605，608.

[3]李晶，姚均.HIV-1表型耐藥檢測方法的研究進展[J].國際病毒學雜志2014，21（2）：45-48

R512.91

A

1672-5018（2017）01-256-01

郭顏艷（1980.10-），女，漢族，籍貫：安徽省滁州市，學歷：研究生在讀，安徽理工大學。職稱：主管檢驗師。主要研究方向醫(yī)學免疫學。