董芮娟，楊立業(yè)

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022）

HPLC法測(cè)定鹽酸左西替利嗪有關(guān)物質(zhì)

董芮娟，楊立業(yè)

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022）

建立鹽酸左西替利嗪中有關(guān)物質(zhì)的HPLC測(cè)定方法。方法：采用Agilent SB-C18色譜柱（4.6 mm×25 cm，5 μm）對(duì)降解雜質(zhì)和工藝雜質(zhì)進(jìn)行定量分析，以乙腈和0.7%磷酸溶液為流動(dòng)相低壓梯度洗脫，流速1.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。結(jié)果：該色譜方法可檢測(cè)到鹽酸左西替利嗪的9種有關(guān)物質(zhì)，主峰與各雜質(zhì)峰間能達(dá)到良好分離；3批樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果顯示，總雜質(zhì)含量低于0.4%。結(jié)論：方法學(xué)驗(yàn)證表明，本法可作為鹽酸左西替利嗪有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制的方法。

鹽酸左西替利嗪；有關(guān)物質(zhì)；高效液相法；分析

鹽酸左西替利嗪（Levocetirizine Dihydrochloride）R-(-)2-[2-[4-[4-(氯苯基)苯甲基]-1-哌嗪基]乙氧基]乙酸二鹽酸鹽，分子式為C21H25ClN2O3·2HCl，相對(duì)分子質(zhì)量為461.82。作為西替利嗪的R-對(duì)映體，也是西替利嗪的活性成份，其與組胺H1受體的親和力比西替利嗪高2倍，比右西替利嗪約高30倍，選擇性作用于H1受體，對(duì)M膽堿受體和5-HT受體作用較小[1]。1995年FDA批準(zhǔn)UCB公司鹽酸左西替利嗪片以商品名XYZAL上市。其消旋體為鹽酸西替利嗪，1987年UCB公司以商品名Zyrtec將其推向市場(chǎng)。因消旋體中鹽酸右西替利嗪（S-對(duì)映體）與受體有一定親和性，會(huì)導(dǎo)致嗜睡等不良反應(yīng)。

目前僅美國(guó)藥典對(duì)鹽酸左西替利嗪有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法中，將有關(guān)物質(zhì)分為手性雜質(zhì)和有機(jī)雜質(zhì)兩種，其中歐洲、英國(guó)對(duì)鹽酸西替利嗪原料藥的有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)基本采用的均為正相色譜系統(tǒng)，僅英國(guó)藥典中鹽酸西替利嗪制劑的有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)研究采用反相色譜系統(tǒng)。根據(jù)所收載的有關(guān)物質(zhì)方法分別進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用方法學(xué)中要求的普通硅膠色譜柱進(jìn)行研究，結(jié)果均不能達(dá)到基本的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[2-7]。

結(jié)合歐洲藥典（8.0）鹽酸西替利嗪的有關(guān)物質(zhì)，根據(jù)R1、R2、R3等取代基的不同，見(jiàn)圖 1，將雜質(zhì)分為A、B、C、D、E、F、G 等 7 種，美國(guó)藥典將雜質(zhì)種類分到11種[4]，本文參考英國(guó)藥典對(duì)鹽酸西替利嗪的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，參考鹽酸左西替利嗪的合成路線[8-11]，建立了鹽酸左西替利嗪9種有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可將鹽酸左西替利嗪的9個(gè)相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行分離，更適合中國(guó)目前在用的普通C18色譜柱。

圖1 鹽酸西替利嗪取代基結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The structure diagram of Levocetirizine Dihydrochloride substituent

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC-2010C液相色譜儀，島津公司；FA1104電子天平，上海天平儀器廠；ZF-2型三用紫外儀，上海市安亭電子儀器廠。

1.2 試劑

鹽酸左西替利嗪原料（20150401，20150402，20150403）、乙腈（默克公司色譜級(jí)）、西替利嗪有關(guān)物質(zhì)A(批號(hào) 130715)、B(130801)、C(130922)、D(130802)、E(131113)、F(130922)、G(130726)、4-CBH（2-GBL-169-1）分別由Molcan公司提供，純度均為95%；左西替利嗪對(duì)照品批號(hào)100659-201102，純度99.8%；對(duì)氯苯酚對(duì)照品，批號(hào)100498-200301純度95%，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；磷酸、氫氧化鈉、鹽酸、雙氧水為分析純，純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠（Agilent SB-C18）色譜柱，0.7%磷酸溶液（10 mL磷酸溶液加水稀釋至1 400 mL）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行低壓梯度洗脫（見(jiàn)表1），檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，流速1.2 mL/min，柱溫度30℃。

表1 梯度洗脫方式Tab.1 The mode of gradient elution

2.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法

取西替利嗪的雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、對(duì)氯苯酚和左西替利嗪等10種對(duì)照品適量，分別精密稱定，加42%乙腈水溶液溶解稀釋制成相應(yīng)濃度，作為對(duì)照貯備溶液；精密量取西替利嗪有關(guān)物質(zhì)C適量配制成每1 mL含5 μg，另分別精密量取上述各對(duì)照品適量配制成1 mL含0.5 μg，用42%乙腈水溶液定容混勻制成對(duì)照混合溶液；取左西替利嗪樣品溶液適量，配制成每1 mL含左西替利嗪0.2 mg，作為供試溶液；精密量取上述供試品溶液1 mL，加流動(dòng)相稀釋至100 mL，再精密量取1 mL，加流動(dòng)相稀釋至10 mL，作為對(duì)照溶液；西替利嗪對(duì)照混合溶液確定各有關(guān)物質(zhì)保留時(shí)間以左西替利嗪（60 min）為參照，分別約為：F=0.2、A=0.45、對(duì)氯苯酚=0.5、G=0.7、B=0.8、C=0.85、E=1.05、D=1.29、4-CBH=1.3。供試品溶液中若有雜質(zhì)峰，其單個(gè)雜質(zhì)不大于對(duì)照溶液主峰面積的2倍（0.2%）；非特異雜質(zhì)：每個(gè)雜質(zhì)不大于對(duì)照溶液主峰面積（0.10%）；總雜質(zhì)不大于對(duì)照溶液主峰面積的4倍（0.4%）；可忽略雜質(zhì)不大于對(duì)照溶液主峰面積的0.5倍（0.05%）。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取鹽酸左西替利嗪對(duì)照品及西替利嗪雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、對(duì)氯苯酚各適量，精密稱定，加稀釋劑溶解并稀釋制成混合對(duì)照溶液，進(jìn)樣分析，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，在本文色譜條件下鹽酸左西替利嗪與各雜質(zhì)峰能達(dá)到良好分離，各色譜峰的分離度均大于1.5。

2.4 破壞試驗(yàn)

另取左西替利嗪原料藥（20150401）適量，精密稱定，用42%乙腈溶液溶解并稀釋制成每1 mL含左西替利嗪200 mg，作為樣品溶液，取1 mL溶液，分別進(jìn)行不同條件下的降解試驗(yàn)，試驗(yàn)條件依次為（A）紫外光365 nm，253.7 nm 下分別光照 10 min、20 min、30 min、1 h、3 h、4 h；（B）60 ℃下分別放置 1 h、3 h、8 h、20 h；（C）加 1 mol/L鹽酸溶液 100 μL，放置 1 h、3 h、6 h后，加入 1 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL中和；（D）加1 mol/L氫氧化鈉溶液 100 uL，放置 1 h、3 h、6 h 后，加入 1 mol/L 鹽酸溶液100 μL中和；（E）1%過(guò)氧化氫濃度的分別放置1 min，3%濃度放置 5 min，30 min；（F）將樣品溶液敞口放置3 h；同時(shí)做空白溶劑試驗(yàn)。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定上述溶液。各破壞試驗(yàn)的代表色譜圖見(jiàn)圖3。

總結(jié)破壞試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)雙氧水濃度1%放置3 min時(shí)，左西替利嗪溶液降解50%；雙氧水濃度3%放置5 min、30 min后均降解70%；敞口放置3 h，左西替利嗪溶液較穩(wěn)定，無(wú)有關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生。

鹽酸左西替利嗪樣品溶液經(jīng)堿破壞1 h和3 h時(shí)，左西替利嗪降解2.5%～3%，2.5 min出現(xiàn)的未知雜質(zhì)峰的量與其平衡；堿破壞6 h后降解6%，而2.5 min未知雜質(zhì)峰也相應(yīng)增加6%。原因可能是氫氧化鈉與左西替利嗪中的羧基緩慢發(fā)生反應(yīng)，而形成極性較大的鹽，故在此液相條件下出峰較快。

鹽酸左西替利嗪樣品溶液經(jīng)酸破壞1 h時(shí)，左西替利嗪降解1%；破壞3 h左西替利嗪降解為83.6 min的未知雜質(zhì)，二者按面積歸一法達(dá)到平衡；破壞6 h后，左西替利嗪雜質(zhì)峰回歸至1 h，而3 h時(shí)候出現(xiàn)的83.6 min未知雜質(zhì)峰則基本無(wú)。原因可能是左西替利嗪穩(wěn)定形似為鹽酸鹽，在過(guò)量鹽酸作用下，可能繼續(xù)與左西替利嗪下的羧基不穩(wěn)定，而形成83.6 min的未知中間產(chǎn)物；當(dāng)放置6 h后，83.6 min的雜峰在強(qiáng)酸作用下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的左西替利嗪。

鹽酸左西替利嗪樣品溶液60℃放置20 h后未知雜質(zhì)個(gè)數(shù)及含量無(wú)明顯增加，左西替利嗪主峰無(wú)變化。

鹽酸左西替利嗪樣品溶液在紫外光照情況下，10 min降解了25%，30 min時(shí)左西替利嗪已降解50%，各有關(guān)物質(zhì)主要表現(xiàn)為未知雜質(zhì)均呈現(xiàn)不同程度的增加，其中已知雜質(zhì)F、G增加；而紫外光照1 h時(shí)，左西替利嗪降解了75%，30 min的各有關(guān)物質(zhì)的較有不同程度的降低，雜質(zhì)B、C、4-CBH呈現(xiàn)增加形式；光照4 h時(shí)，左西替利嗪完全降解，30 min的各有關(guān)物質(zhì)的較有不同程度的降低，雜質(zhì)B、C、4-CBH呈現(xiàn)增加形式，在整個(gè)降解過(guò)程中，溶劑峰附近的未知雜質(zhì)峰持續(xù)增加。

圖2 專屬性試驗(yàn)圖譜Fig.2 The illustration of specificity experiment

圖3 破壞試驗(yàn)代表圖譜Fig.3 The representative illustration of destruction experiment

以上破壞性試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸左西替利嗪樣品溶液對(duì)紫外光、氧化極不穩(wěn)定，堿性條件下會(huì)慢慢降解，而酸性條件下則呈現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)，耐高溫。

2.5 線性關(guān)系

分別精密稱取西替利嗪雜質(zhì)對(duì)照品A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、對(duì)氯苯酚9個(gè)雜質(zhì)和左西替利嗪對(duì)照品適量，用42%的乙腈水溶液溶解稀釋制成對(duì)照貯備液；分別精密量取適量配制成2.0、5.0、10.0、15.0和20.0 μg/mL系列濃度的對(duì)照混合溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，由溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）對(duì)峰面積（A）做線性回歸，所得方程見(jiàn)表2。結(jié)果表明各濃度線性關(guān)系良好。

表2 鹽酸左西替利嗪各有關(guān)物質(zhì)線性關(guān)系Tab.2 The linearity of each related substance of Levocetirizine Dihydrochloride

2.6 檢測(cè)限和定量限

分別精密稱取西替利嗪雜質(zhì)對(duì)照品A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、對(duì)氯苯酚9個(gè)雜質(zhì)和左西替利嗪對(duì)照品適量，用42%乙腈水溶液溶解稀釋制成一定濃度的混合溶液；精密量取混合溶液適量，用42%乙腈水溶液逐級(jí)稀釋進(jìn)樣分析，按信噪比S/N=3計(jì)算檢測(cè)限，S/N=10為定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)限與定量限Tab.3 The LOD and LOQ of each related substance

2.7 精密度試驗(yàn)

按2.3項(xiàng)下混合溶液，分別于分別置于冰箱冷藏室24 h，48 h，7 d，10 d，20 d；室溫24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，考察混合對(duì)照溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，待測(cè)溶液在以上環(huán)境下存放溶液穩(wěn)定，各有關(guān)物質(zhì)和左西替利嗪峰面積RSD均小于1%。

2.8 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取西替利嗪雜質(zhì)對(duì)照品A、B、C、D、E、F、G、4-CBH、對(duì)氯苯酚9個(gè)雜質(zhì)和左西替利嗪對(duì)照品適量，用42%的乙腈水溶液溶解稀釋制成對(duì)照貯備液；分別精密量取適量配制成8.0、10.0和12.0 μg/mL系列的對(duì)照混合溶液各3份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以工作曲線折算試劑測(cè)量值，進(jìn)而計(jì)算各回收率。經(jīng)計(jì)算各雜質(zhì)回收率均在90%～110%之間，RSD小于5%，回收率良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.3項(xiàng)下方法配置每1 mL中含左西替利嗪和各雜質(zhì)10 μg的混合溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜柱進(jìn)行進(jìn)樣分析，以工作曲線計(jì)算，考察方法重復(fù)性。經(jīng)計(jì)算，雜質(zhì)C含量的RSD為3.3%，其他各雜質(zhì)含量的RSD均小于1%。

2.10 有關(guān)物質(zhì)樣品測(cè)定

取鹽酸左西替利嗪原料適量，依2.1色譜方法測(cè)定，結(jié)果表明，三批檢驗(yàn)結(jié)果均符合要求。

3 討論

3.1 耐用性考察

普通C18柱（Diamonsil C18柱，4.6 mm×25 cm，5 μm）、酸性介質(zhì)C18柱（Agilent SB-C18）、流速（0.8、1.2 mL/min）、柱溫（25℃、35℃），結(jié)果表明流動(dòng)相的酸度越低，越有利于各雜質(zhì)的分離；因鹽酸左西替利嗪的各雜質(zhì)極性相差較大，水相比例直接影響各雜質(zhì)峰的出峰情況，故采用低壓梯度洗脫。分別考察了上述條件下各組分分離效果較好，證明該方法耐用性較好。

3.2 小結(jié)

本文通過(guò)HPLC法測(cè)定鹽酸左西替利嗪的有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果顯示，此高效液相色譜法更適合于中國(guó)境內(nèi)常用的C18色譜柱，且能將西替利嗪的多種雜質(zhì)有效分離，可用以鹽酸左西替利嗪的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。

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Determination the Related Substance in Levocetirizine Dihydrochloride by HPLC

DONG Rui-juan YANG Li-ye
（Food and Medicine School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022,China）

To establish a HPLC method of the concent and related substances of Levocetirizine Dihydrochloride.Methods：RP-HPLC was adopted to determine Levocetirizine Dihydrochloride related substances，quantitative analysis of degradation and process impurities using an Agilent SB-C18 column(4.6 mm×25 cm，5 μm)with a low pressure gradient elution system of acetonitrile-0.7%phosphoric acid，while the flow rate was 1.2mL/min and the detection wavelengh was 230 nm。The result shows the related substance in Levocetirizine Dihydrochloride can be detected by this chromatographic method ，related substances were completely separated from the main constituents；according to the result，the related substance of three bacthes were lower than 0.4%。The conclusion shows that this method is proved by the validation that it can be used for the related substance control of Levocetirizine Dihydrochloride。

Levocetirizine Dihydrochloride；related substance；HPLC；analysis

R917

A

1008－830X(2017)03－0223－05

2017-01-09

浙江省公益計(jì)劃項(xiàng)目(2017C33126)

董芮娟（1981-），女，山西芮城人,工程師，碩士研究生,研究方向：海洋藥物.

楊立業(yè)（1963-），男，副教授，E-mail:liyey@zjou.edu.cn