毛山山，程小珍，崔榮花，元建華，王美清

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院 腫瘤化療科，海南 ?？?570208）

I EX-1蛋白在胃癌中的表達(dá)及其意義*

毛山山，程小珍，崔榮花，元建華，王美清

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 腫瘤化療科，海南 ?？?570208）

目的揭示即刻早期反應(yīng)X-1（IEX-1）蛋白在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)，探討其對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)100例胃鏡活檢標(biāo)本中IEX-1蛋白的表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和Western blot檢測(cè)人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞MKN28中IEX-1基因和蛋白的表達(dá)，同時(shí)轉(zhuǎn)染IEX-1的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-FLAG-IEX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-IEX-1，分別采用流式細(xì)胞術(shù)及四甲基偶氮唑鹽比色法檢測(cè)IEX-1對(duì)細(xì)胞周期、凋亡及增殖的影響。結(jié)果胃癌組織中IEX-1蛋白表達(dá)水平高于正常胃組織和慢性胃炎組織（P＜0.05），且隨著病情進(jìn)展，IEX-1表達(dá)水平有逐漸升高的趨勢(shì)。相對(duì)于人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1，胃癌細(xì)胞MKN28中IEX-1基因和蛋白表達(dá)更高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，IEX-1蛋白表達(dá)增高后S期細(xì)胞比例升高，G2期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞增殖率升高，凋亡減少（P＜0.05），而干擾IEX-1蛋白表達(dá)后，G1期細(xì)胞升高，G2期細(xì)胞比例下降，細(xì)胞增殖率下降，細(xì)胞凋亡增加（P＜0.05）。結(jié)論IEX-1蛋白在胃癌組織中呈高表達(dá)，在人胃癌細(xì)胞中上調(diào)IEX-1蛋白能促進(jìn)細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗凋亡能力，干擾IEX-1蛋白表達(dá)能阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，并誘導(dǎo)凋亡。

胃癌；即刻早期反應(yīng)X-1；增殖；凋亡

胃癌是來(lái)于自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在全部惡性腫瘤中排第3位，是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，可見(jiàn)胃癌是威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病。人類(lèi)即刻早期反應(yīng)基因X-1（immediate early responsegene X-1，IEX-1）位于人染色體6p21.3，全長(zhǎng)1.2 kb，表達(dá)含156個(gè)氨基酸殘基的蛋白，分子量約為18 kD[1-2]。IEX-1表達(dá)有組織差異性，被證實(shí)是一種凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，在不同細(xì)胞和組織中能夠正性或負(fù)性調(diào)控凋亡相關(guān)過(guò)程，參與很多腫瘤分子生物學(xué)過(guò)程[3-5]。但目前關(guān)于其在胃癌研究中的報(bào)道較少，在胃癌中的功能尚不清楚。本研究擬通過(guò)檢測(cè)IEX-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平，并分析其對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響，探討其在胃癌進(jìn)程中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自法國(guó)Biowest公司，兔抗人IEX-1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，鼠抗人Tunbulin單克隆抗體購(gòu)自加拿大Fermentas公司，LipoTM2000轉(zhuǎn)染試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒及限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自日本TaKaRa公司，pcDNA3-flag質(zhì)粒、pLL3.7質(zhì)粒、T4連接酶、DNA抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒、即用二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色劑、四甲基偶氮唑鹽比色法[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]試劑及碘化丙啶試劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，培養(yǎng)箱和超凈工作臺(tái)購(gòu)自美國(guó)Thermo Forma公司，ABI PRISM 7700 qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，水平式瓊脂糖凝膠電泳儀、垂直式電泳儀及濕式電轉(zhuǎn)移均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，ACEA Novo CyteTM流式細(xì)胞儀購(gòu)自杭州艾森生物有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Gene公司，光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。所有引物委托北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.1.2 組織標(biāo)本和細(xì)胞 為研究正常胃組織→慢性胃炎→胃癌過(guò)程中IEX-1蛋白的表達(dá)變化，在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院2014年1月-2015年12月胃鏡活檢患者中收集10例正常胃組織、40例慢性胃炎組織及50例胃癌組織標(biāo)本。所有患者簽署標(biāo)本研究知情同意書(shū)。人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司，胃癌細(xì)胞MKN28購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 采用二步法檢測(cè)正常胃組織、慢性胃炎組織及胃癌組織中IEX-1蛋白的表達(dá)。4μm切片56℃過(guò)夜。次日常規(guī)脫蠟和去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加入三羥基甲胺 -鹽酸緩沖鹽溶液（Tris-HCl buffer saline，TBS）進(jìn)行抗原修復(fù)。擦去組織周?chē)鶷BS，置切片于濕盒內(nèi)，滴加正常綿羊血清（1∶20），70μl/片，37℃、20 min。吸去切片上部分血清，滴加工作濃度兔抗人IEX-1多克隆抗體（1∶200），70μl/片，37℃、1 h后，4℃放置過(guò)夜。陰性對(duì)照用TBS代替一抗。次日滴加相對(duì)應(yīng)工作濃度二抗，70μl/片，37℃、1 h，滴加DAB顯色。開(kāi)始出現(xiàn)背景時(shí)，用蒸餾水終止顯色。蘇木素復(fù)染后立即流水沖洗。將切片于56℃烤箱內(nèi)烤干，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀(guān)察。染色程度由2位病理醫(yī)生在不知臨床資料的情況下獨(dú)立評(píng)價(jià)。400倍光鏡下觀(guān)察8個(gè)任一視野，得到染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率。IEX-1染色評(píng)分由染色強(qiáng)度（0～3級(jí)：0級(jí)為陰性，1級(jí)為弱陽(yáng)性，2級(jí)為中等陽(yáng)性，3級(jí)為強(qiáng)陽(yáng)性）和陽(yáng)性細(xì)胞百分率（0～4級(jí)：0級(jí)為0%，1級(jí)為1%～25%，2級(jí)為26%～50%，3級(jí)為51%～75%，4級(jí)為76%～100%）的乘積得到，分為不同等級(jí)（0、1、2、3、4、6、8、9和12）。0級(jí)為陰性表達(dá)，1、2和3級(jí)為弱陽(yáng)性表達(dá)，4和6級(jí)為中度陽(yáng)性表達(dá)，8、9和12級(jí)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 液氮凍存細(xì)胞拿出后迅速放于37℃水浴中溶解，使用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%抗生素）37℃、5%二氧化碳CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復(fù)蘇次日更換新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞密度＞80%時(shí)需使用胰酶消化傳代。傳代比例1∶6～1∶4。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 在細(xì)胞樣品中加入預(yù)冷的裂解液，超聲破碎后4℃、13 000 r/min離心10 min；輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中置于冰上待用。使用BCA蛋白定量試劑盒通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品的蛋白濃度。取等量蛋白樣品（30μg），加入上樣緩沖液，97℃加熱6 min變性，室溫冷卻離心后上樣。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，采用電轉(zhuǎn)儀將蛋白從分離膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜封閉后加入一抗（1∶1 000，用封閉液稀釋?zhuān)?℃雜交過(guò)夜。加入適當(dāng)比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h，將電化學(xué)發(fā)光試劑盒的A液和B液等體積混合后均勻滴在PVDF膜上，放入暗盒中顯影。使用Quantity One軟件進(jìn)行光密度分析。

1.2.4 qRT-PCR 在樣品中加入1 ml Trizol，劇烈震蕩混勻，室溫放置5 min后加入200μl氯仿劇烈震蕩，4℃靜置5 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，將約600μl上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）1.5 ml離心管中。加入等體積氯仿，劇烈震蕩，4℃靜置2 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新的無(wú)RNase 1.5 ml離心管中。按等體積加入異丙醇，上下顛倒充分混勻后于-20℃靜置30 min。4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用75%預(yù)冷乙醇洗滌后，離心棄上清，充分干燥后加入適量焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA并測(cè)定濃度。為防止DNA對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響，要用脫氧核糖核酸酶消化提取的RNA中的DNA，其消化程序和反應(yīng)液的量按說(shuō)明書(shū)操作。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），即可作為qRT-PCR的反應(yīng)模板。從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心獲得IEX-1 mRNA的全長(zhǎng)序列，利用Primer Blast設(shè)計(jì)引物序列。IEX-1正向引物：5'-CGGTCCTGAGATCTTCACCT-3'，反向 引 物 ：5'-TGGTGAGCAGCAGAAAGAGA-3'；GAPDH正向引物：5'-ACATGTTCCAATATGCTTCC-3'，反向引物：5'-TGGACTCCACCACGTACTCAG-3'。配置標(biāo)準(zhǔn)的PCR體系，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于qRT-PCR儀上設(shè)置所需的反應(yīng)條件，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)據(jù)。

1.2.5 構(gòu)建pcDNA3-FLAG-IEX-1和pLL3.7-si-IEX-1真核表達(dá)載體 以MKN28 cDNA為模板，從NCBI獲得IEX-1 mRNA的全長(zhǎng)序列。NotⅠ：5'-ATAAGAATGCGGCCGCATGTGTCACTCTCGCAGCTgCCACC-3'；EcoRⅠ：3'-CCGGAATTCGCGAAGGCGgCCGGgTGTTGCTGGAGG-5'。配置標(biāo)準(zhǔn)的PCR體系，在PCR儀上設(shè)置所需的反應(yīng)條件，將PCR產(chǎn)物與pcDNA3-flag質(zhì)粒使用NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切。將上述酶切產(chǎn)物跑1%瓊脂糖凝膠，切膠回收，使用T4Ligase 16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，涂布氨芐平板。37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取平板上長(zhǎng)出菌落，質(zhì)粒小提后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。pLL3.7-si-IEX-1真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法相同，使用載體為pLL3.7，雙酶切位點(diǎn)為HpaⅠ和XhoⅠ。干擾序列為250～270 kb，正向引物：5'-AAAAGgCTTCTCTTTCTGCTG-3'，反向引物：5'-CAGCAGA AAGAGAAGCCTTTT-3'。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前1 d傳代MKN28細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度需達(dá)80%～90%。嚴(yán)格按照LipoTM2000轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每個(gè)培養(yǎng)血（直徑6 cm）細(xì)胞使用質(zhì)粒量4μg。分別轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒 pcDNA3-flag、pLL3.7、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3-flag-IEX-1及干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-IEX-1。在轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)IEX-1的蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù) 將轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒48 h后的MKN28細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，每個(gè)樣品收集細(xì)胞5×106個(gè)，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗細(xì)胞2次，2 000 r/min離心2 min，棄上清液。70%預(yù)冷乙醇固定過(guò)夜，4℃保存?zhèn)溆茫旧坝肞BS洗去固定液，棄上清液。每管中加RNase A，37℃水浴30 min，PI染色混勻，4℃避光30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 MTT法 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒48 h后的MKN28細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以3 000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板，體積200μl/孔。每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后加MTT溶液（5 mg/ml）20μl/孔。492 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。等級(jí)資料以頻數(shù)表示，用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常胃組織、慢性胃炎及胃癌組織中I EX-1的表達(dá)

IEX-1蛋白在各類(lèi)組織中均有陽(yáng)性表達(dá)（100/100）（見(jiàn)附表）。正常胃黏膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中IEX-1表達(dá)豐富（見(jiàn)圖1A、B）；慢性胃炎組織中，腸上皮化生細(xì)胞胞質(zhì)有中等量的IEX-1表達(dá)（見(jiàn)圖1C、D）；而在胃癌組織中，IEX-1有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（見(jiàn)圖1E、F）。經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H= 38.609，P=0.000），相對(duì)于正常胃組織和慢性胃炎組織，胃癌組織中IEX-1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性程度更高。

2.2 人胃正常黏膜細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中I EX-1基因和蛋白表達(dá)水平

為進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組織化學(xué)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞MKN28進(jìn)行qRT-PCR和Western blot檢測(cè)。IEX-1基因和蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 13.019和6.120，P=0.006和0.026），胃癌細(xì)胞MKN28中IEX-1基因和蛋白表達(dá)水平高于人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1。見(jiàn)圖2、3。

附表 不同組織中I EX-1蛋白表達(dá)程度的比較 例（%）

圖1 I EX-1蛋白在正常胃組織、慢性胃炎及胃癌組織中的表達(dá) （×10）

2.3 pcD N A3-FLAG-I EX-1和pLL3.7-si-I EX-1真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

為下一步了解IEX-1蛋白在胃癌進(jìn)展中的意義，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建IEX-1的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-FLAGIEX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-IEX-1。將NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切連接好的pcDNA3-FLAG-IEX-1質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，紫外線(xiàn)下可見(jiàn)在靠近500 bp處有1條帶，與IEX-1 mRNA的長(zhǎng)度相符（見(jiàn)圖4）。將雙酶切鑒定正確的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-FLAGIEX-1和提取好的干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-IEX-1送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序，應(yīng)用Chromas軟件讀取測(cè)序結(jié)果，使用NCBI BLAST驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果正確，說(shuō)明pcDNA3-FLAG-IEX-11和pLL3.7-si-IEX-1真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 人胃正常黏膜細(xì)胞G ES-1和胃癌細(xì)胞M KN 28中I EX-1基因表達(dá)水平

圖3 人胃正常黏膜細(xì)胞G ES-1和胃癌細(xì)胞M KN 28中I EX-1蛋白表達(dá)水平

圖4 pcD N A3-FLAG-I EX-1真核表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcD N A3-FLAG-I EX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-I EX-1轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞M KN 28后I EX-1基因和蛋白表達(dá)水平的變化

為驗(yàn)證過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-FLAG-IEX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-IEX-1在MKN28中的效果，將2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN28 48 h后，經(jīng)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)IEX-1基因和蛋白的表達(dá)。3組IEX-1基因表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3 438.589，P=0.000），過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染48 h后IEX-1基因表達(dá)水平升高，而干擾組IEX-1基因表達(dá)水平降低（見(jiàn)圖5）。過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干擾組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組IEX-1蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 311.85，P=0.000）。過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染48 h后IEX-1蛋白表達(dá)水平升高，而干擾組IEX-1蛋白表達(dá)水平降低（見(jiàn)圖6）。過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干擾組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。過(guò)表達(dá)組IEX-1基因和蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，而干擾組IEX-1基因和蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，說(shuō)明重組質(zhì)粒過(guò)表達(dá)和干擾效果顯著。

2.5 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcD N A3-FLAG-I EX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-I EX-1轉(zhuǎn)染后對(duì)胃癌細(xì)胞M KN 28細(xì)胞周期的影響

圖5 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcD N A3-FLAG-I EX-1和干擾質(zhì)粒pLL3. 7-si-I EX-1轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞M KN 28后I EX-1基因表達(dá)水平

圖6 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcD N A3-FLAG-I EX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-I EX-1轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞M KN 28后I EX-1蛋白表達(dá)水平

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化。過(guò)表達(dá)組各期細(xì)胞比例比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78.537，P=0.000），過(guò)表達(dá)組細(xì)胞合成期（synthesis phase，S）細(xì)胞比例升高，第二間隙期（gap phase 2，G2）細(xì)胞比例降低。過(guò)表達(dá)組S期與對(duì)照組S期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；過(guò)表達(dá)組G2期與過(guò)表達(dá)對(duì)照組G2期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第一間隙期（gap phase 1，g1）和G2/G1期細(xì)胞比例變化不大，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.237，P=0.572）。過(guò)表達(dá)IEX-1后，MKN28細(xì)胞增殖更加旺盛。干擾組各期細(xì)胞比例比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=88.324，P=0.000），干擾組G1期細(xì)胞比例升高，G2期細(xì)胞比例下降。干擾組G1期與干擾對(duì)照組G1期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），干擾組G2期與干擾對(duì)照組G2期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干擾組、干擾對(duì)照組各期細(xì)胞比例比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54.779，P=0.000），干擾組S期和G2/G1期細(xì)胞比例有所下降。干擾組S期與干擾對(duì)照組S期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），干擾組G2/G1期與干擾對(duì)照組G2/G1期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明干擾IEX-1蛋白表達(dá)后，MKN28細(xì)胞增殖活動(dòng)受抑制，使細(xì)胞滯留于G1期。見(jiàn)圖7。

2.6 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcD N A3-FLAG-I EX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-I EX-1轉(zhuǎn)染后對(duì)胃癌細(xì)胞M KN 28凋亡的影響

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡變化。各組凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=107.892，P=0.000）。過(guò)表達(dá)組與過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），干擾組與干擾對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明過(guò)表達(dá)組凋亡水平低于過(guò)表達(dá)對(duì)照組，而干擾組凋亡水平高于干擾對(duì)照組。見(jiàn)圖8。

2.7 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcD N A3-FLAG-I EX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-I EX-1轉(zhuǎn)染后對(duì)胃癌細(xì)胞M KN 28增殖的影響

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖變化情況，各組增殖率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=88.643，P=0.000）。過(guò)表達(dá)組與過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），干擾組與干擾對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖率高于過(guò)表達(dá)對(duì)照組，而干擾組細(xì)胞增殖率低于對(duì)照組。見(jiàn)圖9。

圖7 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcD N A3-FLAG-I EX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-I EX-1轉(zhuǎn)染后對(duì)胃癌細(xì)胞M KN 28細(xì)胞周期的影響

圖8 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcD N A3-FLAG-I EX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-I EX-1轉(zhuǎn)染后對(duì)胃癌細(xì)胞M KN 28凋亡的影響（±s）

3 討論

胃癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，更是引起惡性腫瘤患者死亡的第2大原因。我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率和死亡率高居前列[6-7]。多年來(lái)胃癌治療后的5年生存率一直＜24%[8]。盡管目前有很多關(guān)于胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的知識(shí)被發(fā)現(xiàn)和了解，但是能夠?qū)颊吒行У奈赴┗蛑委煹陌邢蚍肿尤栽趯ふ抑小?/p>

圖9 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcD N A3-FLAG-I EX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-I EX-1轉(zhuǎn)染后對(duì)胃癌細(xì)胞M KN 28增殖的影響（±s）

IEX-1首次發(fā)現(xiàn)于人類(lèi)X射線(xiàn)照射引起的腫瘤細(xì)胞中[1-2]，其表達(dá)有組織差異性，在皮膚、呼吸道、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)的上皮細(xì)胞，以及多組織或器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在胰腺和乳腺中高表達(dá)；在肝、肺、淋巴結(jié)、胎盤(pán)中表達(dá)較弱；而在胸腺、睪丸、卵巢、心肌、骨骼肌、脾臟中未檢測(cè)到[9-10]。同樣在不同的癌組織中，其表達(dá)也有差異。僅有38.3%的卵巢癌表達(dá)IEX-1[11]，胰腺癌中IEX-1則有53%的陽(yáng)性表達(dá)率[12]，并通過(guò)ERK磷酸化途徑促進(jìn)胰腺細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[13]；在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞株中IEX-1表達(dá)大幅度下調(diào)[14]；同樣直腸癌組織中IEX-1的表達(dá)比癌旁正常組織降低[15]，而在骨肉瘤組織中IEX-1則呈高陽(yáng)性表達(dá)[16]。目前，鮮有關(guān)于成人正常胃組織和胃癌組織中IEX-1蛋白表達(dá)的報(bào)道，且存在相互矛盾的情況。

多項(xiàng)研究表明，IEX-1是一種凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白[17-19]。其可正性或負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡功能[20]。IEX-1在293細(xì)胞中通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）抑制劑IkBα的降解，下調(diào)基礎(chǔ)水平和誘導(dǎo)水平NF-κB的活性，從而對(duì)抗NF-κB的抗凋亡作用[21]。胃泌素17對(duì)表達(dá)野生型CCK2受體結(jié)腸癌細(xì)胞的促凋亡作用也是通過(guò)IEX-1介導(dǎo)，依賴(lài)NF-κB抗凋亡途徑而產(chǎn)生[22]。轉(zhuǎn)染IEX-1基因的人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液中Caspase-3的活性增加[23]。而更早期的報(bào)道則顯示，IEX-1能夠抵抗TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[24]。目前關(guān)于IEX-1調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究，尚無(wú)定論。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常胃組織中有IEX-1蛋白的表達(dá)，與FELDMANN等[9]報(bào)道一致，但胃癌組織的IEX-1蛋白表達(dá)水平要高于正常胃組織和慢性胃炎組織，為進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組織化學(xué)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞MKN28中IEX-1基因和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果同樣顯示其在胃癌細(xì)胞中呈現(xiàn)更高表達(dá)狀態(tài)。另外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，正常胃組織發(fā)展到慢性胃炎，再至胃癌的疾病進(jìn)展過(guò)程中，IEX-1的表達(dá)水平有逐漸升高的趨勢(shì)，揭示IEX-1蛋白的升高可能是胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中潛在機(jī)制之一。為探究IEX-1在胃癌進(jìn)程中所起的作用，考慮其為凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外源性導(dǎo)入過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-FLAG-IEX-1和干擾質(zhì)粒pLL3.7-si-IEX-1，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IEX-1蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞MKN28細(xì)胞周期和凋亡的影響，結(jié)果證實(shí)上調(diào)IEX-1蛋白表達(dá)能使S期細(xì)胞比例升高，G2期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞凋亡減少，說(shuō)明過(guò)表達(dá)IEX-1蛋白后，MKN28細(xì)胞增殖更加旺盛。而將IEX-1蛋白表達(dá)干擾后，胃癌細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，增殖受抑制并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MTT法則進(jìn)一步驗(yàn)證IEX-1蛋白促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用，說(shuō)明IEX-1在調(diào)控胃癌細(xì)胞的凋亡和增殖發(fā)生轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，IEX-1蛋白在胃癌組織中呈高表達(dá)水平狀態(tài)，在人胃癌細(xì)胞中上調(diào)IEX-1蛋白表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗凋亡能力，干擾IEX-1蛋白表達(dá)能夠阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)凋亡。因此，IEX-1蛋白在胃癌進(jìn)程中發(fā)揮癌蛋白的作用。下一步筆者將就IEX-1在胃癌中相關(guān)的分子機(jī)制及下游信號(hào)通路進(jìn)行研究，為IEX-1作為胃癌基因治療的靶向分子提供科學(xué)理論依據(jù)。

[1]CHARLES C H,YOON J K,SIMSKE J S,et al.Genomic structure,cDNA sequence and expression ofgly96,agrowth factor-inducibleimmediate-earlygene encoding a short-livedglycosylated protein[J].Oncogene,1993,8(3)：797-801.

[2]KONDRATYEV A D,CHUNG K N,JUNG M O.Identification and characterization of a radia tion-inducibleglycosylated human early-responsegene[J].Cancer Res,1996,56(7)：1498-1502.

[3]WU M X,USTYUGOVA I V,HAN L,et al.Immediate early responsegene X-1,a potential prognostic biomarker in cancers[J]. Expert Opin Ther Targets,2013,17(5)：593-606.

[4]USTYUGOVA I V,ZHI L,ABRAMOWITZ J,et al.IEX-1 deficiency protects against colonic cancer[J].Mol Cancer Res,2012, 10(6)：760-767.

[5]ARLT A,SCHAFER H.Role of the immediate early response 3 (IER3)gene in cellular stress response,inflammation and tumorigenesis[J].Eur J Cell Biol,2011,90(6/7)：545-552.

[6]BRENNER H,ROTHENBACHER D,ARNDT V.Epidemiology of stomach cancer[J].MethodsMol Biol,2009,472：467-477.

[7]CATALANO V,LABIANCA R,BERETTAg D,et al.Gastric cancer[J].Crit Rev Oncol Hematol,2009,719(2)：127-164.

[8]FERLAY J,SHIN H R,BRAY F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer, 2010,127(12)：2893-2917.

[9]FELDMANN K A,PITTELKOW M R,ROCHE P C,et al.Expression of an immediate earlygene,IEX-1,in human tissues[J]. Histochem Cell Biol,2001,115(6)：489-497.

[10]張明,朱武,肖濤.1種獨(dú)特的凋亡調(diào)節(jié)蛋白IEX-1[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2011(3)：274-277.

[11]HAN L,GENG L,LIU X,et al.Clinical significance of IEX-1 expression in ovarian carcinoma[J].Ultrastruct Pathol,2011,35(6)：260-266.

[12]SASADA T,AZUMA K,HIRAI T,et al.Prognostic significance of the immediate early responsegene X-l(IEX-l)expression in pancreatic cancer[J].Ann Surg Oncol,2008,15(2)：609-617.

[13]GARCIA M N,GRASSO D,LOPEZ-MILLAN M B,et al.IER3 supports KRASG12D-dependent pancreatic cancer development by sustaining ERK1/2 phosphorylation[J].J Clin Invest,2014：124(11)：4709-4722.

[14]HU Y,SUN H,DRAKE J,et al.From mice to humans：identification of commonly deregulatedgenes in mammay cancer viacomparative SAGE studies[J].Cancer Res,2004,64(21)：7748-7755.

[15]NAMBIAR P R,NAKANISHI M,GUPTA R,et al.Genetic signatures of high-and low-risk aberrant crypt foci in a mouse model of sporadic colon cancer[J].Cancer Res,2004,64(18)：6394-6401.

[16]XIAO T,LI K H,LIg Y,et al.Mechanism of apoptosis of human osteosarcoma MG-63 induced by arsenic trioxide[J].Journal of Central South University of Technology,2005,12(suppl 1)：317-321.

[17]de KEULENAERg W,WANG Y,FENG Y,et al.Identification of IEX-1 as a biomechanically controlled nuclear factorkappa β targetgene that inhibits cardiomyocyte hypertrophy[J]. Circ Res,2002,90(6)：690-696.

[18]KOBAYASHI T,PITTELKOW M R,WARNERg M,et al. Regulation of a novel immediate early responsegene,IEX-1,in keratinocytes by 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3[J].Biochem Biophys Res Commun,1998,251(3)：868-873.

[19]ZHANG Y,SCHLOSSMAN S F,EDWARDS R A.et al.Impaired apoptosis,extended duration of immune responses,and a lupus-like autoimmune disease in IEX-1-transgenic mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(2)：878-883.

[20]耿莉娜,張曉雪,韓麗萍.即刻早期基因IEX-1與腫瘤[J].中國(guó)腫瘤臨床,2012(4)：234-236.

[21]ARLT A,MINKENBERG J,KOCS B,et al.The expression of immediate earlygene X-1 (IEX-1)is differentially induced by retinoic acids in NB4 and KG1 cells：possible implication in the distinct phenotype of retinoic acid-responsive and-resistant leukemic cells[J].Leukemia,2004,18(10)：1646-1655.

[22]SEBENS MüERK?STER S,RAUSCH A V,ISBERNER A.The apoptosis-inducing effect ofgastrin on colorectal cancer cells relates to an increased IEX-1 expression mediating NF-kappa B inhibition[J].Oncogene,2008,27(8)：1122-1134.

[23]SCHILLING D,PITTELKOW M R,KUMAR R,et al.IEX-1, an immediate earlygene,increases the rate of apoptosis in keratinocytes[J].Oncogene,2001,20(55)：7992-7997.

[24]WU M X,AO Z,PRASAD K V,et al.IEX-1L,an apoptosis inhibitor involved in NF-kappa β-mediated cell survival[J]. Science,1998,281(5379)：998-1001.

（童穎丹 編輯）

Expression of IEX-1 protein ingastric carcinoma and its effect on apoptosis and proliferation of humangastric cancer cells*

Shan-shan Mao,Xiao-zhen Cheng,Rong-hua Cui,Jiang-hua Yuan,Mei-qing Wang
(Department of Oncology,Haikou Hospital Affiliated to Xiangya Medical College of Central South University,Haikou,Hainan 570208,China)

ObjectiveTo reveal the expression of IEX-1 protein ingastric cancer tissues and cell lines, and investigate the effect of IEX-1 on the proliferation and apoptosis of humangastric cancer cells.MethodsImmunohistochemistry was used to detect IEX-1 protein expression in 100 samples ofgastric mucosal biopsy. IEX-1gene and protein expressions were detected by fluorescence qRT-PCR and Western Blot respectively in normalgastric mucosagES-1 cells andgastric cancer MKN28 cells.pcDNA3-FLAG-IEX-1 plasmid and pLL3.7-si-IEX-1 plasmid were transfected into MKN28 cells respectively,and then cell cycle,apoptosis and proliferation were detected by flow cytometry and MTT assay.MethodsThe expression of IEX-1 protein in thegastric cancer tissues was higher than that in the normalgastric tissues and the chronicgastritis tissues (P＜0.05),and the expression level of IEX-1 wasgradually increased with the progress of the disease.The expressions ofIEX-1gene and protein in thegastric cancer MKN28 cells were higher than those in the normalgastric mucosalgES-1 cells (P＜0.05).Compared with the controlgroup,the increased expression of IEX-1 protein could increase the proportion of the cells in S phase,decrease the proportion of the cells ing2 phase,increase the rate of cell proliferation,and decrease apoptosis (P＜0.05).After the expression of IEX-1 protein was interfered,the percentage ofg1 phase cells increased,that ofg2 phase cells decreased, the rate of cell proliferation decreased,apoptosis increased (P＜0.05).ConclusionsIEX-1 protein is highly expressed ingastric cancer tissues.Up-regulation of IEX-1 protein expression can promote the proliferation ofhumangastric cancer cells and play an anti-apoptotic role.Interfering with the expression of IEX-1 protein could block cell cycle progression and induce apoptosis.

gastric cancer;IEX-1;proliferation;apoptosis

R735.2

A

2017-03-20

2013年海南省?？谑兄攸c(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：2013-70）

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.006

1005-8982（2017）20-0026-08