羨海英，馬千里，王金星，陳登峰，石秋林

（河北省衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院 心胸外科，河北 衡水 053000）

血清抵抗素水平及抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性與川崎病的相關性研究

羨海英，馬千里，王金星，陳登峰，石秋林

（河北省衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院 心胸外科，河北 衡水 053000）

目的觀察血清中抵抗素水平及抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性在川崎病的表達水平，并對其相關性進行分析。方法隨機選擇60例川崎?。↘D）患兒為KD組，另設60例健康兒童為對照組。兩組均采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測兒童血清抵抗素水平，應用多聚酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性技術檢測不同組別患兒抵抗素基因-420C/G位點多態(tài)性的差異，同時檢測統(tǒng)計其血液學相關指標，包括血白細胞計數(shù)（WBC）、紅細胞計數(shù)（RBC）、血紅蛋白水平（Hb），紅細胞壓積（Hct）。結果與對照組比較，KD患兒外周血液中WBC、RBC、Hb及Hct表達水平均降低（P＜0.05），而血小板計數(shù)（PLT）表達水平升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義；血清抵抗素檢測結果顯示，與對照組相比，KD患兒血清抵抗素水平升高；限制性核酸內(nèi)切酶試劑盒BpiⅠ檢測血清抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性，與對照組相比，KD組患兒GG較CC基因頻率較低（P＜0.05）。Pearson相關分析顯示，KD患兒血漿抵抗素水平與WBC、RBC、Hb及Hct呈負相關（P＜0.05），而與PLT表達水平呈正相關（P＜0.05）；KD患兒組的GG基因型的WBC、RBC、PLT、Hct及血清抵抗素比CG基因型高，GG、CC基因型均高于CC基因型。結論在川崎病患兒血清抵抗素水平升高，提示血清抵抗素水平的檢測可作為川崎病診斷的潛在可靠指標。

血清抵抗素；基因多態(tài)性；川崎病；兒童

川崎?。╧awasaki disease，KD）是一種急性發(fā)熱性疾病，好發(fā)于嬰幼兒及年齡較小的兒童，其中有15%～25%的患兒常伴有冠狀動脈的損傷，對患兒及其家庭帶來了極大的傷害，因此近年來引起兒科醫(yī)生以及社會的極大關注[1-2]。抵抗素來源為脂肪細胞的肽類，為分泌性蛋白家族，富含半胱氨酸殘基?；蚨鄳B(tài)性位點（以下簡稱SNP）-420與血清抵抗素的水平密切相關，并且SNP-420與抵抗素的關系從強到弱依次為GG＞CG＞CC。有研究表明，抵抗素和SNP-420與KD及冠脈動脈鈣化過程密切相關[3-4]。本研究旨在探討血清中抵抗素水平及抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性與川崎病發(fā)病的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月-2016年6月河北省衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院就診的60例KD患兒作為KD組。其中，男性35例，女性25例；平均年齡（3.65± 1.33）歲。KD患兒的診斷標準嚴格按照1984年日本小兒皮膚黏膜淋巴結綜合征研究委員會決定的典型川崎病診斷標準：①持續(xù)發(fā)熱≥5 d且原因不明；②雙側(cè)眼結膜充血；③咽部及口腔黏膜呈彌漫性充血，唇發(fā)紅干裂，呈楊梅舌；④發(fā)病初期出現(xiàn)手足硬腫及掌跖紅斑，恢復期伴趾端膜狀脫皮；⑤軀干部位有多形性紅斑，無水皰及結痂；⑥頸部淋巴結腫脹，而非化膿性，其直徑≥1.5 cm[5-6]。此外經(jīng)冠狀動脈造影或者二維超聲心動圖如果提示有冠狀動脈損傷，除發(fā)熱癥狀以外，同時伴有其他5項中2～3項，即可確診不典型川崎病。隨機選取60例同期健康體檢兒童作為對照組。其中，男性34例，女性26例；平均年齡（3.35±1.62）歲。兩組觀察對象的年齡及性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有觀察對象簽署知情同意書并獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器

人抵抗素酶聯(lián)免疫吸附實?驗試劑盒（美國R&D公司），限制性核酸內(nèi)切酶試劑盒BpiⅠ（立陶宛Fermentas公司），瓊脂糖Agarose和DNA Marker（日本TaKaRa公司）。37℃孵箱和-80℃低溫冰箱（日本SANYO公司），酶標儀（美國Thermo公司），全自動生化分析儀（AU2700型，日本Olympus公司），自動電化學發(fā)光免疫分析儀（德國Centaur Immunoassay Bayer公司），B型超聲診斷儀（探頭頻率為3.5 MHz，日本東芝公司），PCR擴增儀（LIFE EXPRESS，杭州博日科技有限公司），凝膠分析儀（GSG-2000，珠海黑馬醫(yī)學儀器）。

1.3 血液學指標檢測

所有實驗對象均于清晨空腹12 h后取外周血10 ml，3 ml用于常規(guī)檢測外周血白細胞計數(shù)（white blood cells counts，WBC）、紅細胞計數(shù)（red blood cells counts，RBC）、血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）、血小板計數(shù)（platelet count，PLT） 及紅細胞壓積（Hematocrit，Hct）；3 ml用于檢測血清中抵抗素水平；4 ml用于全血DNA的提取及血清中抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性檢測。

1.4 實驗方法

血清中抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性檢測：從人類基因庫中檢索出人抵抗素的DNA序列，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。正向引物：5'-CTGCTTGTCTACCTGTTCTCT-3'，反向引物：5'-GGGCTTCCTGGCTTGGCTAAA-3'，常規(guī)操作提取DNA，取血液樣品300μl，加入900μl× Buffer，立即顛倒混勻，14 000 r/min離心30 s，留下沉淀細胞核，棄去上清液；向細胞核沉淀中加Buffer WTL 240μl，徹底混勻；加入Buffer BL 250μl，然后充分顛倒混勻，于65℃放置10 min，其間需顛倒混勻數(shù)次，直至溶液變?yōu)榍辶翞橹?；加入無水乙醇250μl，混勻后加入吸附柱（以下簡稱CB3）中，8 000 r/min離心1 min后棄廢液；然后向CB3中加入HB Buffer 500μl，8 000 r/min離心1 min后棄廢液；向CB3中加入DNA 650μl漂洗液（乙醇稀釋），8 000 r/min離心1 min后棄廢液；再次向CB3中加入DNA漂洗液650μl（乙醇稀釋），8 000 r/min離心1 min后棄廢液；13 000 r/min離心2 min棄廢液，將CB3在室溫條件下放置數(shù)分鐘，吸附材料中殘余的漂洗液徹底晾干為止；將CB3換到另一個干凈的離心管中，在吸附膜中間位置懸空滴加50μl洗脫緩沖液（洗脫緩沖液在65℃水預熱），室溫放置5 min，10 000 r/min離心1 min，收集溶液到離心管中。如若基因組DNA的產(chǎn)量需增加，可將離心收集得到的溶液再次加入到CB3中，于室溫條件下放置2 min，10 000 r/min離心2 min，所需的DNA即在所得溶液中。置入-20℃冰箱貯存待用。紫外分光光度法檢查DNA濃度和純度。在20μl的反應體重擴增基因組的DNA。PCR反應條件：94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸7 min，共39個循環(huán)。酶切：采用限制性核酸內(nèi)切酶試劑盒BpiⅠ將PCR產(chǎn)物酶切。將酶切體系放入37℃的水浴箱中恒溫水浴14 h。將6μl酶切產(chǎn)物加樣于瓊脂凝膠電泳中，電壓為90 V，電泳25 min，以100～2 000 bp DNA Marker為分子量標準，確定PCR擴增產(chǎn)物是否為目的基因片斷，在紫外燈下觀察結果，凝膠成像系統(tǒng)上照相保存。其PCR產(chǎn)物為219 bp，以100～2000 bp DNA Marker為參考標準，并判斷基因型。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素的方差分析，組間兩兩比較用F檢驗；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，Pearson相關分析用于相關性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般血液學指標比較

兩組WBC、RBC、Hb、Hct及PLT比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），KD組WBC、RBC、Hb以及Hct表達水平比對照組低（P＜0.05），而PLT表達水平比對照組高（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組一般血液指標比較 （n=60，±s）

表1 兩組一般血液指標比較 （n=60，±s）

組別H c t / %對照組 1 3 . 0 0 ± 0 . 9 9 4 . 7 8 ± 0 . 8 9 1 1 1 . 7 8 ± 8 . 1 1 4 1 0 . 1 3 ± 5 5 . 9 8 3 8 . 8 8 ± 6 . 8 8 K D組 1 1 . 3 4 ± 0 . 8 4 3 . 7 7 ± 1 . 1 1 9 1 . 3 6 ± 8 . 9 0 4 4 9 . 1 1 ± 6 9 . 3 3 3 1 . 4 5 ± 7 . 6 6 t值 1 0 . 0 0 6 5 . 4 9 9 1 3 . 1 3 6 3 . 3 8 8 5 . 5 9 0 P值 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 1 0 . 0 0 0 W B C /（× 1 09/ L）R B C /（× 1 012/ L）H b /（g / L）P L T /（× 1 09/ L）

2.2 血清抵抗素水平比較

檢測血清抵抗素水平結果顯示：KD組（21.98± 9.33）μg/L，對照組（11.13±3.98）μg/L，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.286，P=0.000），KD組抵抗素水平升高。

2.3 血清抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性

應用限制性核酸內(nèi)切酶試劑盒BpiⅠ檢測血清抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性，結果顯示：兩組等位基因、基因型比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），KD組GG較CC基因頻率低。見表2和附圖。

表2 兩組一般血液指標比較 [n=60，例（%）]

2.4 KD組血漿中抵抗素水平與其他指標的相關性分析

Pearson相關分析結果顯示，KD患兒血漿抵抗素的水平與WBC、RBC、Hb及Hct呈負相關（r=-0.243、-0.225、-0.336和-0.544，P=0.041、0.038、0.046和0.034）；而與PLT表達水平呈正相關（r=0.431，P=0.031）。

2.5 不同基因型患兒的生化指標比較

不同基因型患兒的WBC、RBC、Hb及Hct比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），GG基因型的WBC、RBC、PLT、Hct、血清抵抗素比CG基因型高，GG和CG基因型均高于CC基因型。見表3。

表3 不同基因型患兒的生化指標比較 （±s）

表3 不同基因型患兒的生化指標比較 （±s）

注：1）與CC基因型比較，P＜0.05；2）與GC基因型比較，P＜0.05

基因型血清抵抗素/（μg / L）C C（1 0） 1 0 . 3 3 ± 0 . 6 4 3 . 5 8 ± 1 . 1 2 9 2 . 3 6 ± 7 . 9 0 4 2 9 . 1 3 ± 5 9 . 3 2 3 0 . 4 5 ± 5 . 6 6 1 8 . 9 8 ± 5 . 3 3 Cg（2 8） 1 1 . 3 3 ± 0 . 5 41）3 . 6 7 ± 1 . 1 41）9 1 . 2 7 ± 7 . 0 8 4 3 4 . 1 4 ± 5 6 . 3 31）3 3 . 4 6 ± 6 . 6 71）2 1 . 9 7 ± 6 . 3 71）W B C /（× 1 09/ L）R B C /（× 1 012/ L）H b /（g / L）P L T /（× 1 09/ L）H c t / %gg（2 2） 1 2 . 4 3 ± 0 . 5 31）2）3 . 7 1 ± 1 . 0 11）2）9 1 . 2 6 ± 7 . 0 3 4 4 9 . 1 9 ± 5 9 . 5 71）2）3 5 . 4 7 ± 5 . 6 81）2）2 6 . 9 1 ± 5 . 3 41）2）F值 1 1 . 3 9 7 5 . 3 2 8 2 . 8 7 5 2 4 . 7 6 5 7 . 4 3 6 8 . 9 5 4 P值 0 . 0 0 0 0 . 0 1 3 0 . 0 8 9 0 . 0 0 0 0 . 0 0 2 0 . 0 0 0

附圖 限制性核酸內(nèi)切酶酶切后瓊脂糖凝膠電泳結果

3 討論

KD主要發(fā)生于嬰幼兒時期，主要是由免疫介導引起的急性血管炎，其發(fā)病可累及到中小動脈，尤其是冠狀動脈，易導致冠狀動脈瘤擴張及冠狀動脈狹窄或血栓，病情嚴重者甚至可導致心肌梗死等疾病。在歐美部分發(fā)達國家，KD發(fā)病率已超過風濕熱，已然成為危及嬰幼兒時期后天性心臟病的首位病因。盡管已有多種學說的深入研究，取得一些可喜的研究進展，但目前關于KD的發(fā)病病因以及發(fā)病機制仍不明確。關于KD的診斷方法，目前尚無特異的實驗室診斷指標，主要根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)做出診斷，在KD的臨床診斷過程中主要有以下特征：①出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)眼球結膜充血；②出現(xiàn)口腔潰瘍、口唇或口腔伴咽扁桃體的滲出性改變；③常見伴有皮疹以斑丘疹為主，也可見多形性紅斑，且會陰部較為明顯，而在發(fā)病的急性期可能會出現(xiàn)會陰部脫皮現(xiàn)象；④在發(fā)病的急性期可見手掌和足底的硬性水腫、紅斑及在手掌、腕關節(jié)或足底與踝關節(jié)之間有分界線；⑤頸淋巴結腫大，多伴有單側(cè)無痛性[7-8]。以上臨床診斷指標都具有一定的客觀性，因此探討出可信的具有高度應用價值的診斷KD患兒的實驗指標迫在眉睫。

抵抗素是于2001年首次在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，又名為胰島素抵抗因子，由脂肪細胞特異性分泌而得，主要位于炎癥基因的區(qū)域3，具有多種表達模式和生物學特征。在研究的初期結果顯示抵抗素主要涉及人類胰島素抵抗以及糖尿病的疾病過程，并在其中發(fā)揮著重要作用，但目前多項研究結果顯示其在肥胖、胰島素抵抗及糖尿病等疾病過程中的地位仍存在很大的爭議。近些年以來有不少研究結果顯示抵抗素與動脈硬化、心血管疾病等疾病的發(fā)生密切相關[9-10]。提示抵抗素可能參與到代謝性疾病、心血管疾病以及自身免疫性疾病分子機制的調(diào)節(jié)過程中，也有可能參與到血管平滑肌細胞的遷移與增殖過程，誘導血管疾病的發(fā)生，導致血栓形成，從而最終發(fā)生動脈硬化的發(fā)生[11-12]。有諸多研究表明，人體內(nèi)抵抗素基因存在多種單核苷酸多態(tài)性，OSAWA和CHO等[13-14]研究結果均顯示，單核苷酸多態(tài)性-420與血清中抵抗素水平密切相關，單核苷酸的多態(tài)性與抵抗素的水平關系從弱到強依次為CC＜CG＜GG。本研究檢測血清抵抗素水平結果顯示，與對照組相比，KD患兒血清抵抗素水平升高。在KD患兒血清中抵抗素呈高表達水平。應用限制性核酸內(nèi)切酶試劑盒 BpiⅠ檢測血清抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性，結果顯示與對照組相比，KD組患兒GG較CC基因頻率較低，提示，在KD患兒血清中GG較CC基因出現(xiàn)頻率降低。經(jīng)Pearson相關分析，KD患兒血清抵抗素水平與WBC、RBC、Hb及Hct呈負相關；而與PLT表達水平呈正相關。KD患兒組的GG基因型的WBC、RBC、PLT、Hct和血清抗素比CG基因型升高，兩組基因型均高于CC基因型。這與付淑芳等[15]人的研究結果相一致。

綜上所述，在KD患兒的血清抵抗素水平升高，抵抗素基因啟動子-420C/G多態(tài)性隨之發(fā)生變化。提示抵抗素可作為KD診斷過程中的有效指標。

參 考 文 獻：

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（李科 編輯）

Serum resistin level and correlation of resistingene promoter 420 C/G polymorphism with Kawasaki disease

Hai-ying Xian,Qian-li Ma,Jin-xing Wang,Deng-feng Chen,Qiu-lin Shi
(Department of Cardiothoracic Surgery,Hengshui Halison International Peace Hospital,Hengshui,Hebei 053000,China)

ObjectiveTo observe the serum resistin leveland resistin gene promoter420 C/G polymorphism in Kawasaki disease(KD),and to analyze its relevance.MethodsSixty children with Kawasaki disease(KD)were randomly selected for KDgroup,the same number of healthy children were included into controlgroup.ELISA was used to detect serum resistin level in the children.PCR restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)technique was utilized to detect the polymorphisms of resistingene-420 C/G locus. The related parameters of hematology including blood leucocyte count(WBC),red blood cell count(RBC), hemoglobin (Hb),and hemotocrit (Hct)were also tested.MethodsCompared with the controlgroup,the peripheral blood levels of WBC,RBC,Hb and Hct were significantly decreased,and the platelet count was significantly increased in the KDgroup(P＜0.05).The serum resistin level of the KDgroup was significantly higher than that of the controlgroup.Detection of serum resistingene promoter 420 C/G polymorphism showed that compared with the controlgroup,thegene frequency ofgG was relatively lower than that of CC in the KDgroup (P＜0.05).Pearson correlation analysis showed that in the children with KD,the plasma resistinlevel was in negative correlation with WBC,RBC,Hb and Hct(P＜0.05);but in positive correlation with platelet count(P＜0.05).WBC,RBC,platelet,Hct and resistin levels in the KD children withgGgenotype were significantly higher than those in the KD children with CGgenotype,which were in turn significantly higher than those in the KD children with CCgenotype.ConclusionsSerum resistin level significantly increases in children with Kawasaki disease,which suggests serum resistin level can be used as a potential indicator for diagnosis of Kawasaki disease.

serum resistin;gene polymorphism;Kawasaki disease;children

R725.4

A

2016-09-07

石秋林，E-mail：shiqiulin521@126.com；Tel：13184769688

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.009

1005-8982（2017）20-0046-05