安娜

哈爾濱樂泰藥業(yè)有限公司 黑龍江哈爾濱 150025

RP-HPLC法測定聚乙二醇重組人促紅素成品中的甲硫氨酸的含量

安娜

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目的：完善聚乙二醇重組人促紅素成品中關于甲硫氨酸的含量的測定方法。方法：實驗采用反向色譜法，色譜柱選取Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm），流動相A為注射用水,流動相B為乙腈。檢測波長為210nm，流速為1.0ml/min。結果：配制甲硫氨酸的濃度在11.25-33.36μg之間，驗證在此范圍內的線性，r=0.9993；驗證規(guī)定濃度的甲硫氨酸的平均回收率，回收率為100.13%，RSD=0.2%。結論：經(jīng)過方案驗證，此方法簡單，有效。方法的精密度、準確度及線性等符合中國藥典的要求，此方法可用于檢測聚乙二醇重組人促紅素成品中甲硫氨酸含量的測定。

聚乙二醇重組人促紅素；甲硫氨酸；反相高效液相色譜

聚乙二醇重組人促紅素是用聚乙二醇（PEG）修飾重組人促紅素(EPO)。聚乙二醇這種大分子量化合物本身對人體是無毒的[1]，在藥品生產(chǎn)中常用來修飾蛋白質或多肽，從而對蛋白質或多肽產(chǎn)生保護作用，增加蛋白質或多肽藥物的分子量，降低腎臟的排出速度，延長藥物在體內的作用時間[2]。通過聚乙二醇的修飾還可以掩蓋蛋白質或多肽的免疫原性，還可以封閉蛋白質或多肽藥物的蛋白酶作用位點，使蛋白質或多肽藥物不被蛋白酶降解[3]。聚乙二醇還能增加其修飾的蛋白質或多肽藥物的水溶性。

由于聚乙二醇重組人促紅素中的甲硫氨酸殘基容易被氧化，為了減少這種氧化，在成品制劑中加入游離的甲硫氨酸[4]。為控制產(chǎn)品質量，成品制劑需要檢測控制甲硫氨酸的含量，本文通過反相高效液相色譜法對甲硫氨酸和聚乙二醇重組人促紅素進行分離，從而測定甲硫氨酸的含量。

1.儀器與試劑

1.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀，色譜柱選取Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5μm）。

1.2 試劑 L-甲硫氨酸對照品（廠家：中檢院；批號：140684-201102；規(guī)格100mg）。聚乙二醇重組人促紅素成品（本單位）。乙腈（色譜純，廠家：Dikma）。

2.方法與結果

2.1 色譜條件 流動相A：注射用水；流動相B：乙腈；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：210nm；流速：1.0mL/min；注溫：30±5℃；進樣量10μl；梯度洗脫。比例如表1.

表1 洗脫梯度

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 將L-甲硫氨酸對照品按照說明書要求減壓干燥后，精密稱取14.86mg置于10ml容量瓶中，用注射用水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液 聚乙二醇重組人促紅素成品直接進樣。

2.2.3 甲硫氨酸的陰性樣品 不含有甲硫氨酸的聚乙二醇重組人促紅素。

2.3 專屬性 將對照品溶液、供試品溶液及甲硫氨酸的陰性樣品分別注入液相色譜儀，并記錄色譜圖。在甲硫氨酸的陰性樣品色譜圖中，無甲硫氨酸峰，供試品溶液色譜圖中，甲硫氨酸峰和聚乙二醇重組人促紅素峰分離度大于1.5，兩個峰的塔板數(shù)均大于5000.對照品溶液與供試品溶液色譜圖中，甲硫氨酸峰的保留時間一致。

2.4 線性 精密稱取處理后的甲硫氨酸對照品 148.3mg置于10ml容量瓶中，用注射用水溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5ml，分別置于10ml容量瓶中，用注射用水稀釋至刻度，搖勻。分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別將甲硫氨酸的濃度和峰面積作為橫、縱坐標，繪制標準曲線。甲硫氨酸濃度在11.25-33.36μg之間成線性，r=0.9993。

2.5 重復性 供試品溶液精密注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)六次進樣，分別記錄峰面積，甲硫氨酸峰面積的 RSD為0.47%，重復性符合要求。

2.6 回收率 精密量取已知甲硫氨酸含量的樣品溶液適量，分別加入 70%、100%、130%的甲硫氨酸對照品。各個濃度分別注入高效液相色譜儀，每個濃度平行測定3次，分別記錄色譜圖。計算各個濃度的回收率，其中70%濃度的回收率為99.93%、100%濃度的回收率為100.12%、130%濃度的回收率為100.35%。

2.7 樣品含量 將本公司生產(chǎn)的聚乙二醇重組人促紅素成品連續(xù) 3批用本方法檢測甲硫氨酸的含量，計算結果分別為100.92%、100.31%、101.22%。

3.討論

甲硫氨酸是聚乙二醇重組人促紅素成品制劑為保證樣品穩(wěn)定而加入的雜質，含量較小，常規(guī)的檢測方法存在較大誤差，不適用本品的檢測。

本項實驗顯示，專屬性實驗中，甲硫氨酸峰和聚乙二醇重組人促紅素峰分離度大于 1.5，兩個峰的塔板數(shù)均大于 5000。本色譜條件可以達到有效分離的目的。線性實驗中，甲硫氨酸濃度在11.25-33.36μg之間成線性，r=0.9993，線性關系良好。重復實驗中，甲硫氨酸峰面積的RSD為0.47%，本方法的檢測很穩(wěn)定?；厥章实膶嶒炛校厥章史謩e為99.93%、100.12%、100.35%，平均回收率為100.13%，RSD為0.2%。樣品測試環(huán)節(jié)，結果準確，可靠。

通過本次研究表明，采用反相高效液相色譜法能夠達到準確、快速、便于操作等檢測甲硫氨酸含量的目的，可以作為聚乙二醇重組人促紅素成品中的甲硫氨酸含量的檢測方法。

[1] 楊凱睿, 高向東, 徐晨,等.聚乙二醇定點修飾蛋白質藥物的技術和臨床研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2015,15(32):6381-6385.

[2] 譚旭坤, 余倩, 柯永樂,等.聚乙二醇修飾的原花青素脂質體的制備及穩(wěn)定性研究[J].現(xiàn)代化工, 2016(7):64-67.

[3] 李德山, 姜興昊, 徐鵬飛,等.不同維持劑量聚乙二醇修飾的FGF-21在Ⅰ型糖尿病小鼠中降糖作用的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2017, 48(2):69-75.

[4] 白宇, 王維, 東寰睿,等.重組人促紅素異構體分析及其生物學活性檢測[J].黑龍江科技信息, 2016(27):183-183.

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1672-5018（2017）05-207-01