牛林軍，徐 浩，馬高磊，顧玉明

1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科，江蘇 徐州 221002

過氧化物還原酶Ⅱ在胃癌中的表達(dá)及臨床病理意義

牛林軍1，徐 浩1，馬高磊1，顧玉明2

1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科，江蘇 徐州 221002

背景與目的：過氧化物還原酶Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ，PrxⅡ)是具有過氧化物酶活性的蛋白，相關(guān)研究提示其參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。該實(shí)驗(yàn)通過研究人類胃癌組織及細(xì)胞中的PrxⅡ的表達(dá)情況，分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fl uorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)45例胃癌患者的癌組織及相應(yīng)的癌旁組織、胃正常細(xì)胞(GES-1)及胃腺癌細(xì)胞(MGC-803、MKN-45和MKN-28)的PrxⅡ mRNA及蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)胃癌組織芯片中116例胃癌患者癌組織及癌旁組織的Prx Ⅱ的表達(dá)量，分析Prx Ⅱ表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系并做生存分析。結(jié)果：RTFQ-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌組織中PrxⅡ mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織(P<0.05)。胃癌細(xì)胞中PrxⅡ mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于胃正常細(xì)胞(P<0.01)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，胃癌組織中PrxⅡ蛋白的表達(dá)陽性率(76.7%)同樣明顯高于相應(yīng)癌旁組織(30.1%，P<0.01)。PrxⅡ蛋白表達(dá)與胃癌的腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、腫瘤部位及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。PrxⅡ蛋白高表達(dá)者的生存時(shí)間要顯著低于低表達(dá)者(P<0.01)，Prx Ⅱ是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論：PrxⅡ促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，是胃癌的不良預(yù)后因素，其研究可能為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

過氧化物還原酶Ⅱ；胃癌；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；組織芯片

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，世界及中國范圍內(nèi)胃癌死亡率在惡性腫瘤中都位居第三位［1-2］。盡管近年來胃癌的治療方法(如手術(shù)、放療、化療及靶向治療)取得了明顯的進(jìn)步，但其5年生存率仍只有20%~30%，其原因與胃癌高度惡性及生物學(xué)的復(fù)雜性密切相關(guān)［3-5］。有研究表明，許多腫瘤抑制物的下調(diào)或致癌基因參與了胃癌的發(fā)展［6］，但對(duì)其分子發(fā)病機(jī)制仍然知之甚少。因此，加強(qiáng)對(duì)胃癌的病理機(jī)制的研究是當(dāng)前胃癌研究的迫切任務(wù)。過氧化物還原酶Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ，PrxⅡ)屬于抗氧化蛋白超家族，它們廣泛存在于原核和真核生物中并維持體內(nèi)氧化還原態(tài)的穩(wěn)定［7］。據(jù)報(bào)道，PrxⅡ在人類肝癌［8］、腎癌［9］、肺癌［10］及乳腺癌［11］等惡性腫瘤中高表達(dá)，并證實(shí)其參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，本研究通過檢測(cè)人類胃癌組織及細(xì)胞的PrxⅡ的表達(dá)情況，探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

選取徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科及肝膽外科2015年9月—2016年1月的45例胃癌手術(shù)標(biāo)本，45例胃癌患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療且均為腺癌，術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)。所有組織標(biāo)本均于樣本離體后立即取材，每份標(biāo)本分別取癌組織和癌旁組織，癌旁組織取自距癌組織邊緣5 cm以上的胃組織。標(biāo)本用液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存用于提取組織總蛋白及總RNA。選取2009年1月—2010年12月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科及肝膽外科行根治性手術(shù)的116例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本蠟塊制成胃癌組織芯片。116例胃癌患者臨床病理資料完整。手術(shù)病理診斷明確為胃癌，可以隨訪到。其中男性78例，女性38例，年齡25~85歲，中位年齡59歲。

1.2 主要試劑

GES-1、MGC-803、MKN-45和MKN-28細(xì)胞株購買自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，PrxⅡ兔抗人多克隆抗體購自美國Bioworld公司，RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR)試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，免疫組織化學(xué)試劑盒、濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 RNA提取及RTFQ-PCR檢測(cè)

按照TRIzol試劑說明書操作提取組織及細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及D260nm/D280nm比值。取總RNA 3 μg，按照PrimeScriptTMRT Master Mix［寶生物工程(大連)有限公司］反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，然后通過美國ABI公司的7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行RTFQ-PCR檢測(cè)，PrxⅡ基因上游引物序列為5’-GTGTCCTTCGCCAGATCACT-3’，下游引物序列為5’-AAACTTCCCCATGCTCGTCT-3’；GAPDH基因作為內(nèi)參對(duì)照，上游引物序列為5’-GCAAATTCCATGGCACCGT-3’，下游引物序列為5’-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3’。RTFQ-PCR反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用相對(duì)定量的方法，取2-△△CT值進(jìn)行比較。

1.4 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測(cè)

一定量的細(xì)胞及組織加裂解液，冰浴制勻漿后提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取適量蛋白質(zhì)樣品后電泳、轉(zhuǎn)膜。硝酸纖維素(NC)膜在5%的脫脂牛奶中封閉1.5 h，然后加入Prx Ⅱ一抗溫育，4 ℃過夜后二抗室溫溫育2 h，TBST洗膜后避光拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用Image J灰度分析軟件分析相應(yīng)灰度值判斷目的蛋白的表達(dá)水平。

1.5 免疫組織化學(xué)S-P法及結(jié)果判定

具體實(shí)驗(yàn)操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行；以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性切片作為陽性對(duì)照。免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷：Prx Ⅱ免疫組織化學(xué)以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；蜃睾稚w粒為陽性結(jié)果。根據(jù)染色細(xì)胞百分比及著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)判及分析，著色強(qiáng)度計(jì)分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺棕黃色為1分，無著色為0分。陽性染色細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)分：大于75%為4分，51%~75%為3分，26%~50%為2分，6%~25%為1分，小于5%為0分。兩項(xiàng)結(jié)果乘積為最后評(píng)價(jià)結(jié)果。在統(tǒng)計(jì)分析中將小于等于4分定為陰性表達(dá)，將大于4分定為陽性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用以表示，差異性采用ANVOA檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的差異性采用Pearsonχ2檢驗(yàn)法。對(duì)生存數(shù)據(jù)采用 Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行分析；兩曲線之間的差異采用 Log-rank檢驗(yàn)；獨(dú)立預(yù)后因素采用單多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PrxⅡ mRNA在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

RTFQ-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，定義癌旁組織及胃正常細(xì)胞PrxⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)量為1，胃癌組織中PrxⅡ mRNA表達(dá)量約為癌旁組織的(1.38±0.22)倍，明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；MGC-803、MKN-45和MKN-28細(xì)胞中PrxⅡ mRNA表達(dá)量分別約為GES-1細(xì)胞的(1.45±0.06)、(1.64±0.15)和(1.26±0.09)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

2.2 Western blot檢測(cè)PrxⅡ蛋白在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

圖 1 PrxⅡ mRNA在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)情況Fig. 1 The relative expression of PrxⅡmRNA in gastric cancer tissues

Western blot結(jié)果顯示，PrxⅡ蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.827±0.168和0.460±0.211，PrxⅡ蛋白在胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在GES-1、MGC-803、MKN-45和MKN-28細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.406±0.022、0.677±0.073、0.895±0.041和0.643±0.036，PrxⅡ蛋白在MGC-803、MKN-45和MKN-28細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于GES-1細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃癌及其癌旁組織中PrxⅡ蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在癌旁組織中PrxⅡ蛋白多呈現(xiàn)出低表達(dá)或陰性表達(dá)，而癌組織多為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均勻分布的棕褐色顆粒(圖3)。癌組織陽性表達(dá)率為76.7%(89/116)，癌旁組織陽性表達(dá)率為30.1%(27/116)，癌組織中PrxⅡ蛋白陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=50.516，P<0.01)。

2.4 PrxⅡ蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系

PrxⅡ蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系：胃癌組織中，PrxⅡ蛋白表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， 而與患者的性別、年齡、腫瘤部位及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

圖 2 PrxⅡ蛋白在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)情況Fig. 2 The relative expression of PrxⅡprotein in gastric cancer tissues

圖 3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PrxⅡ蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Fig. 3 Detection of PrxⅡprotein expression in non-cancerous gastric tissues or gastric cancer tissues by immunohistochemistry

表 1 胃癌組織中PrxⅡ蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系Tab. 1 The correlation between the protein expression of PrxⅡand clinical pathological parameters in gastric cancertissues [n(%)]

2.5 PrxⅡ蛋白表達(dá)情況與總生存期(overall survival，OS)、無病生存期 (disease-free survival，DFS)之間的生存分析

PrxⅡ蛋白表達(dá)情況與OS、DFS之間的關(guān)系采用Kaplan-Meier法生存分析，兩曲線之間的差異采用log-rank檢驗(yàn)。分析結(jié)果顯示，PrxⅡ蛋白陽性患者的術(shù)后OS、DFS顯著低于PrxⅡ蛋白陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

2.6 PrxⅡ蛋白表達(dá)及各臨床病理參數(shù)與胃癌患者OS的關(guān)系

通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型來分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示，PrxⅡ蛋白表達(dá)、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表2)。在研究與DFS的關(guān)系時(shí)得到了相同的結(jié)論。

圖 4 PrxⅡ蛋白表達(dá)水平與患者OS、DFS之間的生存關(guān)系Fig. 4 The relationship between PrxⅡprotein expression and OS, DFS of the patients

表 2 單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析Tab. 2 Univariable and multivariable analysis of predictors of overall survival in gastric cancer patients.

3 討 論

哺乳動(dòng)物的Prxs家族包括PrxⅠ~Ⅵ共6個(gè)成員，根據(jù)半胱氨基酸殘基(cysteine，Cys)的數(shù)目及其保守性將Prxs家族成員分為1-Cys Prx和2-Cys Prx，PrxⅡ?qū)儆?-Cys Prx［12］。PrxⅡ廣泛參與細(xì)胞的增殖與凋亡、遷移、分化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能活動(dòng)。據(jù)報(bào)道，PrxⅡ的高表達(dá)可減輕由甲狀腺激素誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡［13］；PrxⅡ基因下降可導(dǎo)致體內(nèi)H2O2增多，導(dǎo)致由PDFG介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)［14］；Kang等［15］發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的PrxⅡ可通過抑制核因子NF-κB的活化來參與細(xì)胞的分化和凋亡。

本研究前期結(jié)果顯示，通過RTFQ-PCR、Western blot及免疫組織化學(xué)S-P實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞及組織中PrxⅡ mRNA及蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其明顯高于正常胃細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的癌旁組織。相關(guān)報(bào)道表明，PrxⅡ在人類多種惡性腫瘤中高表達(dá)［8-11］，將細(xì)胞快速置于亞致死的氧化狀態(tài)下不能引起PrxⅡ的明顯增加或降低，但若置于嚴(yán)重的氧化狀態(tài)下則可導(dǎo)致PrxⅡ增加、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀和過氧化作用加?。?6］，表明其高表達(dá)可能與惡性腫瘤組織內(nèi)的持久氧化狀態(tài)有關(guān)。

通過進(jìn)一步分析表明，PrxⅡ蛋白表達(dá)與胃癌的分化過程、侵襲、遷移及預(yù)后密切相關(guān)。此外，通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析數(shù)據(jù)表明，PrxⅡ蛋白表達(dá)、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。PrxⅡ促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚不明確，可能與活性氧(reactive oxygen species，ROS)密切相關(guān)。ROS及其引發(fā)的氧化應(yīng)激在胃癌發(fā)生中的作用受到越來越多的關(guān)注，其在體內(nèi)的致癌作用已為越來越多的研究所證實(shí)［17］，高表達(dá)的PrxⅡ可能通過減少ROS，增強(qiáng)腫瘤的抗氧化能力，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。此外， Park等［8］發(fā)現(xiàn) PrxⅡ可以通過Ras/FoxM1信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖；Leak等［18］利用過表達(dá)PrxⅡ的轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明，PrxⅡ可以通過多聚ADP核糖多聚酶1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和p53基因介導(dǎo)的細(xì)胞來發(fā)揮作用。這些都說明PrxⅡ促進(jìn)胃癌的發(fā)展可能有多種途徑存在。本實(shí)驗(yàn)表明了PrxⅡ基因可能是一個(gè)潛在的基因治療靶點(diǎn)，但本實(shí)驗(yàn)僅是初步探討了PrxⅡ與胃癌的關(guān)系，今后尚須在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證。而且，PrxⅡ通過何種機(jī)制促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展也需要進(jìn)一步的深入研究。

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Expression and clinicopathologic signi fi cance of peroxiredoxin Ⅱ in gastric cancer

NIU Linjun1, XU Hao1, MA Gaolei1, GU Yuming2
(1. Graduate School, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; 2. Department of Interventional Radiology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China)

Background and purpose:Peroxiredoxin Ⅱ (PrxⅡ) has the activity of peroxidase. The relevant studies found it played an important role in gastric cancer. This study aimed to investigate the expression of PrxⅡ in human gastric cancer tissues and cells, analyze its relationship with clinicopathological characteristics, and explore the relationship between PrxⅡ and the prognosis and the development of gastric cancer.Methods:The expression of PrxⅡmRNA and protein in gastric cancer tissues and the paired adjacent normal tissues from 45 patients was detected by real-time fl uorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) and Western blot. The same methods were used to detect the expression of PrxⅡ mRNA and protein in GES-1, MGC-803, MKN-45 and MKN-28. Tissue microarray and immunohistochemistry were used to detect the expression of PrxⅡ protein in gastric cancer tissues and the paired adjacent normal tissues from 116 patients. The relationship between the results and clinicopathological characteristics was analyzed. The prognosis was analyzed.Results:According to results of RTFQ-PCR and Western blot, we found that PrxⅡ mRNA and protein in gastric cancer tissues were signi fi cantly higher than that in adjacent normal tissues (P<0.05). PrxⅡ mRNA and protein in gastric cancer cells were higher than that in normal gastric cells (P<0.01).Immunohistochemistry revealed that the expression of PrxⅡ protein in gastric cancer tissues (76.7%) was also significantly higher (P＜0.01) than that in adjacent normal tissues (30.1%). The expression of PrxⅡ protein is signi fi cantly related to tumor size, histological di ff erentiation, depth of invasion, TNM stage and lymph node metastasis (P＜0.05), but had no signi fi cant relationship with the gender, age, tumor location and distant metastasis. Survival in patients with higher PrxⅡ expression signi fi cantly shorter than in those with lower expression (P<0.01). PrxⅡ is an independent prognostic factor of gastric cancer (P<0.05).Conclusion:PrxⅡ promotes the development of gastric cancer. It is one of the adverse prognostic factors of gastric cancer and may serve as a new therapeutic target for gastric cancer.

Peroxiredoxin Ⅱ; Gastric cancer; Real-time fl uorescent quantitative polymerase chain reaction; Tissue microarray

GU Yuming E-mail: guyuming_2006@163.com

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.08.007

R735.2

A

1007-3639(2017)08-0641-07

2017-02-10

2017-04-25）

顧玉明 E-mail: guyuming_2006@163.com