張華奧， 逯久幸， 李 靜， 李永華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

菊花去飽和酶CmSAD基因的克隆與表達分析

張華奧， 逯久幸， 李 靜， 李永華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

以秋菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)抗寒品種‘星光燦爛’為材料，利用RT-PCR和RACE方法從葉片中克隆△9硬脂酰-ACP去飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)基因，命名為CmSAD，GenBank登錄號為KC529335。該基因cDNA全長1 203 bp，編碼401個氨基酸，相對分子質(zhì)量為45.57 kD，等電點為6.48，編碼的氨基酸序列與新疆雪蓮?fù)葱宰罡?80.29%)。通過對該蛋白進行生物信息學(xué)分析得出其沒有跨膜結(jié)構(gòu)，主要存在于葉綠體基質(zhì)中，N端含有一段包含60個氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)運肽。通過實時熒光定量PCR研究低溫脅迫下葉片和根系中CmSAD基因的表達量變化，該基因在葉片和根系中均有表達。根系中CmSAD基因的表達量隨著溫度的降低而降低，16 ℃時表達量最高；葉片中CmSAD表達量隨著溫度的降低先升高再降低，5 ℃時最高。隨著溫度的降低，菊花葉片和根系中CmSAD基因的表達情況表現(xiàn)出一定的差異。CmSAD基因的表達變化與溫度有關(guān)，為低溫脅迫下菊花脂肪酸代謝的分子機理研究提供了基礎(chǔ)。

菊花；低溫；CmSAD基因；克??；表達分析

△9硬脂酰-ACP去飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)是影響植物細胞膜脂肪酸不飽和程度的最直接因素，細胞膜相變溫度的高低取決于膜脂不飽和度，SAD 是催化不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶[1-2]。研究人員已從紅花、銀杏等70余種植物中克隆出了SAD基因[3]。KACHROO等[4]研究表明，SAD參與到擬南芥的防御和生長調(diào)節(jié)過程中，羅秀芹等[5]對SAD的結(jié)構(gòu)和功能進行了預(yù)測。對白蠟樹的研究表明，SAD基因在白蠟莖中表達量較高[6]。菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)是多年生宿根草本花卉，對其栽培技術(shù)、低溫抗性生理、引種與園林應(yīng)用等方面已有較多研究[7-8]。但有關(guān)脂肪酸代謝的分子機理研究報道較少。此前已有學(xué)者研究了低溫下4種秋菊葉片根系中膜脂脂肪酸的組分變化[8]和9個秋菊品種葉片脂肪酸組分與抗寒性[9]；并通過對低溫下菊花葉綠體ω-3脂肪酸去飽和酶(CmFAD7)基因的研究發(fā)現(xiàn)，其表達量的高低與溫度、品種及器官有關(guān)[10]，ω-3脂肪酸去飽和酶作為影響質(zhì)膜脂肪酸組成的另一重要因素，對CmSAD的研究提供了重要參考依據(jù)。本試驗以秋菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)抗寒品種‘星光燦爛’為試材，從葉片中克隆CmSAD基因全長cDNA，測定低溫脅迫下CmSAD基因在葉片和根系中的表達量變化，分析低溫與CmSAD基因表達的關(guān)系，為進一步探討菊花抗寒的生理與分子機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗材料與處理

以秋菊抗寒品種‘星光燦爛’為試材(由開封市園林菊花研究所提供)，盆栽基質(zhì)為V(草炭)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=1∶1∶1。選取生長健壯的菊花幼苗，待株高為(20±2)cm，葉片數(shù)為13±1時進行處理。

試驗設(shè)4種溫度處理：16、5、-4和-8 ℃(菊花半致死溫度為-8 ℃左右，最適生長溫度約為16 ℃)。將供試菊花植株沖洗干凈，放入塑料瓶中，置于高精度低溫恒溫槽中(GDH-1006，Scientz，寧波)進行不同溫度處理，3次重復(fù)。勻速降溫2 ℃·h-1，當達到所要求的溫度后維持12 h，取樣。在每個處理溫度下，取植株根系和頂端下第4～5片葉，蒸餾水反復(fù)沖洗后用定性濾紙吸干，錫箔紙包好后于液氮中速凍，-80 ℃保存，用于基因克隆和實時熒光定量PCR(RT-qPCR)。

1.2試驗方法

1.2.1CmSAD基因的克隆 采用改良CTAB法提取RNA，以菊花葉片總RNA為模板，利用5′RACE試劑盒(SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit)反轉(zhuǎn)錄cDNA，具體步驟參考趙桂紅等[11]的方法。

依據(jù)蓖麻、木薯、麻瘋樹、烏桕和油桐等物種在GenBank中已有的SAD同源基因的保守區(qū)域，合成簡并引物SAD-F1和SAD-R2(表1)，以cDNA為模板對菊花SAD的中間片段進行擴增, 擴增中間片段的PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)， 72 ℃后延伸5 min；根據(jù)中間片段核苷酸序列，設(shè)計合成3′RACE正向特異性引物SAD3′-F(表1)，以cDNA作為模板，進行PCR擴增，獲得3′端序列, 3′RACE擴增反應(yīng)程序與擴增中間片段相同，但退火溫度為54 ℃；根據(jù)中間片段核苷酸序列，設(shè)計合成5′RACE兩個下游的特異性引物：SAD5′-R1(外側(cè)引物)，SAD5′-R2(內(nèi)側(cè)引物)(表1)，采用巢式PCR克隆5′端序列，5′RACE擴增反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，5個循環(huán)；95 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，10個循環(huán)；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，2 ℃延伸90 s，23個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。將克隆得到的菊花SAD基因的3′端、5′端及中間片段進行拼接獲得全長，設(shè)計SAD基因cDNA全長特異性引物SAD-S和SAD-A(表1)，進行cDNA全序列擴增。其擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃后延伸5 min。

表1 PCR擴增所需引物Table 1 Primers used in PCR amplification

1.2.2CmSAD基因序列分析 利用DNAMAN6.0對已經(jīng)完成測序的核苷酸序列進行氨基酸序列的推測與比對；利用NCBI網(wǎng)站[12]上的BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行蛋白預(yù)測，用specialized BLAST(CDD search)完成保守區(qū)域分析；用在線ProtParam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析；利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)進行蛋白質(zhì)疏水性的分析；用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)軟件進行二級結(jié)構(gòu)分析；利用Tmpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析蛋白的跨膜區(qū)和跨膜方向；采用Sosuisignal(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosuisignal/ sosuisignal_submit.html)軟件進行信號肽預(yù)測；用PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)和TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進行亞細胞定位預(yù)測；運用 Swiss-Model Workspace(http://swissmodel.expasy.org/)在線進行3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.3CmSAD基因在低溫脅迫下的表達分析 提取4種溫度處理下菊花根系和葉片總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，用引物SAD1-F和SAD1-R(表1)進行實時熒光定量PCR，以18s-rRNA(18s-rRNA F1、18s-rRNA R2)(表1)作為內(nèi)參基因，每個樣品3次重復(fù)。用18s-rRNA作為比對進行溶解曲線分析，并以β-微管蛋白(β-tubulin)基因作為對比基因與各基因表達量進行相對定量分析。按照2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1CmSAD基因的克隆

提取菊花葉片總RNA用于RT-PCR反應(yīng)，獲得保守區(qū)片段，得到長度大約為690 bp(圖1，S1)DNA片段的條帶。通過菌液PCR驗證，基因測序，經(jīng)Blast分析，其核苷酸的序列與已知物種中的CmSAD基因有較高的同源性，表明該片段就是所需目的基因的中間片段。

M:DNA分子量標記DL 2 000。 M: DNA marker DL 2 000.圖1 CmSAD基因中間片段(S1)和基因cDNA全長(S7)Fig.1 CmSAD gene middle fragment(S1)and complete sequence of CmSAD cDNA(S7)

依據(jù)所得的CmSAD基因的中間片段，分別進行3′和5′RACE，獲得基因序列的3′端和5′端。將從菊花中克隆出來的SAD基因的3′端、5′端及中間片段進行拼接獲得全長序列。以SAD-S和SAD-A為引物，以cDNA為模板，獲得大小約為1 250 bp的條帶，進行酶切驗證并測序。該基因編碼區(qū)全長1 203 bp，編碼 401 個氨基酸(圖1，S7)， GenBank注冊號為KC529335。

2.2CmSAD基因序列同源性分析及分子進化樹構(gòu)建

使用 Blast 軟件對氨基酸同源序列搜索，菊花SAD基因編碼的氨基酸序列與同科的新疆雪蓮和向日葵SAD基因的同源性最高，分別為 80.29%、79.81%。與菊花SAD的氨基酸序列具有較高同源性的物種有麻瘋樹(77.62%)、百脈根(75.91%)、馬鈴薯(77.86%)、水黃皮(77.62%)、花生(77.13%)、烏桕(76.89%)、木薯(76.89%)等(圖2)。因此，將該基因命名為CmSAD。通過與SAD基因的比較，CmSAD基因在上游23、24位置中多出2個絲氨酸(S)。

利用MEGA4.0軟件對其氨基酸序列進化樹分析(圖3)，CmSAD基因與同科的新疆雪蓮和向日葵SAD基因最先聚合，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，其次是花生、大豆、菜豆，而與木油桐、油桐、烏桕、麻瘋樹、木薯的親緣關(guān)系較遠。由此可知，菊花CmSAD基因與同科植物有較近的親緣關(guān)系，與木本植物的親緣關(guān)系較遠。

2.3CmSAD基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

CmSAD基因編碼蛋白包含401個氨基酸，其分子式為C2030H3167N557O597S20，相對分子質(zhì)量為45.57 kD，等電點(pI)為6.48。該蛋白具有穩(wěn)定性(穩(wěn)定系數(shù)為36.24)，其脂肪系數(shù)為75.44，具親水性，平均親水系數(shù)為-0.412。由20種氨基酸構(gòu)成菊花：KC529335；新疆雪蓮：ABF66638；向日葵：AAB65145.1；麻瘋樹：AAY86086.1；百脈根：AAY78547.1；馬鈴薯：XP_006350702.1； 水黃皮：AGS43806.1； 花生：ADB79570.1；烏桕：ABN13874.1；木薯：AFT92043.1。

黑色背景表示序列一致性為100%；深灰色表示序列一致性≥75%；淺灰色表示序列一致性≥50%。Chrysanthemummorifolium：KC529335；Saussureainvolucrata：ABF66638；Helianthusannuus：AAB65145.1；Jatrophacurcas：AAY86086.1；Lotusjaponicus：AAY78547.1；Solanumtuberosum：XP_006350702.1；Millettiapinnata：AGS43806.1；Arachishypogaea：ADB79570.1；Triadicasebifera：ABN13874.1；Manihotesculenta：AFT92043.1.

Black background indicates 100% sequence homology, dark gray background indicates amino acid with≥75%, and light gray background indicates amino acid with≥50%.

圖2菊花與其他物種△9硬脂酰-ACP去飽和酶氨基酸序列的多重比對
Fig.2Alignmentofaminoacidof△9Stearoyl-ACPdesaturasefromchrysanthemumandotherplants

此蛋白，Leu的含量最豐富(大約占8.2%)，有52個帶負電氨基酸(Asp+Glu)和49個帶正電氨基酸(Arg+Lys)。在CmSAD中包含1個由297個氨基酸殘基構(gòu)成的保守區(qū)，屬?；?ACP去飽和酶家族(Acyl-ACP-Desaturase)。對其二級結(jié)構(gòu)分析，SAD蛋白含有α-螺旋213個，占53.12%；β-折疊27個，占6.73%；β-轉(zhuǎn)角42個，占10.47%；自由卷曲119個，占29.68%。該蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)；對該蛋白亞細胞定位進行分析，主要存在于葉綠體基質(zhì)中。N-端含有一段包含60個氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，位于第1-60位。沒有明顯的信號肽，是一個可溶性蛋白?；钚晕稽c分析表明，C-端有1個SAD的保守區(qū)，5個蛋白激酶C磷酸化位點，4個酪蛋白激酶II磷酸化位點，3個N-端?；稽c，1個酪氨酸激酶磷酸化位點，1個cAMP和cGMP調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化位點，1個酰胺化位點。通過SWISS MODEL進行3D結(jié)構(gòu)預(yù)測，該基因編碼蛋白具有與硬脂酰去飽和酶相似的理化性質(zhì)。

2.4不同溫度下CmSAD基因在葉片和根系中的表達

CmSAD基因在植物不同器官中的表達受溫度影響(圖4)。根系中CmSAD基因的表達量隨著溫度的降低而降低，16 ℃時表達量最高，5 ℃、-4 ℃和-8 ℃分別是16 ℃的0.87、0.11和0.03倍。隨著溫度的下降，葉片中CmSAD基因的表達量先升高再降低，5 ℃時表達量達到最高，16 ℃、-4 ℃和-8 ℃分別是5 ℃的0.77、0.18和0.07倍。在不同低溫環(huán)境中，CmSAD基因在植物各器官內(nèi)的表達量也不相同。在16 ℃和5 ℃時，CmSAD基因在葉片與根系中表達量差異顯著，根系中的表達量高于葉片，當溫度下降到-4 ℃和-8 ℃時，葉片中CmSAD的表達量高于根系，各處理之間差異顯著。

比例尺代表0.05個氨基酸差別；節(jié)點上數(shù)字表示bootstrape的校驗結(jié)果。 The scale bar represents 0.05 amino acid substitutes per site；Numbers at nodes indicate phylogeny test and options.圖3 不同植物△9硬脂酰-ACP去飽和酶基因進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of △9 Stearoyl-ACP desaturase gene from different plants

圖4 低溫下CmSAD基因在菊花葉片和根系中的表達Fig.4 CmSAD gene expression level in leaves and roots of Chrysanthemum under low temperature

3 討論

△9硬脂酰-ACP去飽和酶是目前研究較為廣泛的Acyl-ACP去飽和酶，已經(jīng)從70余種植物中克隆出了SAD基因。本試驗從菊花葉片中克隆得到CmSAD基因，cDNA全長1 203 bp，編碼401個氨基酸，相對分子量為45.57 kD。通過氨基酸序列同源性分析，CmSAD具有較高的保守性，與新疆雪蓮和向日葵 SAD 基因的同源性最高，CmSAD基因在上游 23、24位置中多出 2 個絲氨酸(S)，L-絲氨酸羥基經(jīng)磷酸化作用后能衍生出的磷絲氨酸，是磷脂的主要成分之一[13]，它可能與細胞膜穩(wěn)定性有關(guān)。從蓖麻和麻瘋樹等植株中克隆獲取的SAD氨基酸序列的N-端均包含轉(zhuǎn)運肽，為葉綠體轉(zhuǎn)運肽；利用Psort分析該蛋白定位在葉綠體基質(zhì)中，在C-端發(fā)現(xiàn)1個SAD的保守區(qū)域序列：SAVAQRL GVYTAKDYADILE，由此推測出CmSAD基因編碼蛋白是一個定位于葉綠體內(nèi)的硬脂酰-ACP脫去飽和酶，催化硬脂酰-ACP(18:0-ACP)在其中介入第1個雙鍵而生成油酰基-ACP(18:1-ACP)[14]。

自1991年THOMPSON等[15]從紅花中首次克隆出CmSAD基因，目前在GenBank上登記的SAD基因序列或序列片段達70多個，并對SAD基因的結(jié)構(gòu)和功能進行了研究。SLOCOMBE等[16]研究發(fā)現(xiàn)SAD在發(fā)育的植物組織中(如幼嫩葉，正發(fā)育的果實)表達非常旺盛，具有時間和組織特異性。通過對擬南芥fab2突變株(SAD基因突變)進行研究，高溫有利于fab2的生長[17]。白銀豆中的PlSAD基因在根和莖中表達量極低，而在葉片中較高。低溫條件下PlSAD的表達量下降，但在遮光處理后其表達量增加。本試驗中，根系中CmSAD的表達量隨著溫度降低而降低，16 ℃時表達量最高；隨著溫度降低，葉片中CmSAD的表達量呈先升高再降低的趨勢，5 ℃時最高。陳罡等[6]對美國白蠟的研究結(jié)果表明， SAD 基因在白蠟莖中表達量最高，葉片中最低。本試驗中，在16 ℃和5 ℃時，CmSAD基因在根系中的表達量高于葉片，而溫度降至-4 ℃和-8 ℃時，葉片中CmSAD的表達量高于根系，CmSAD基因的表達受低溫調(diào)控?！?硬脂酰-ACP去飽和酶基因是去飽和酶基因家族中的一部分，調(diào)控機制相當復(fù)雜，膜脂脂肪酸組成及相關(guān)基因表達作為菊花低溫脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵機制，CmSAD基因及其家族的功能和調(diào)控機理的研究還需進一步深入。

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(責(zé)任編輯：李瑩)

CloningandexpressanalysisoffattyaciddesaturasegeneCmSADinchrysanthemum

ZHANG Huaao， LU Jiuxing， LI Jing， LI Yonghua

(College of Forestry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002， China)

Chrysanthemum (ChrysanthemummorifoliumRamat.) variety of cold resistance ‘Xingguangcanlan’ was selected as experimental materials. △9 Stearoyl-ACP desaturase (SAD) gene were separated and cloned from the leaf by RT-PCR and RACE, namedCmSAD, accession number is KC529335 in GenBank. The full length cDNA ofCmSADis 1203 bp， encoding a protein of 401 amino acids. Its molecular mass is 45.57 kD， pI is 6.48, and the homology of coding sequence of amino acids is the highest withSaussureainvolucrata(80.29%). This protein has no transmembrane structure, and mainly exists in the chloroplast stroma, and a chloroplast transit peptide at N-terminal, which contains 60 amino acids. Quantitative PCR research by real-time fluorescent was conducted on quantity alteration in leaves and root under low temperature stressCmSADgene expression. The expression quantity ofCmSADgene decreased in root system with temperature decreasing. When the temperature was 16 ℃, the expression quantity ofCmSADgene was the highest. With the decrease of temperature, the expression quantity ofCmSADgene in leaves increased first and achieved the highest at 5 ℃, then decreased. Different temperatures made diffident expression quantity ofCmSADgene. With the decrease of temperature, the expression quantity ofCmSADgene decreased. Therefore, the expression quantity ofCmSADgene was related to temperature and it also had a close relationship with cold resistance.

chrysanthemum； low temperature；CmSAD； cloning； expression analysis

S682.11

：A

2016-10-24

河南省科技攻關(guān)項目(142102110136)

張華奧(1992-)，女，河南南陽人，碩士研究生，從事園林植物與觀賞園藝研究。

李永華(1974-)，男，河南西華人，教授，博士。

1000-2340(2017)03-0324-06