郭 凱， 宋寧垣， 孫紅正， 趙全志

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

河南沿黃稻區(qū)粳稻種質(zhì)資源香味基因篩選

郭 凱， 宋寧垣， 孫紅正， 趙全志

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

利用水稻香味基因Badh2第2外顯子和第7外顯子特異的分子標(biāo)記篩選了河南沿黃稻區(qū)208份粳稻種質(zhì)資源，從中篩選出15份含有香味基因的種質(zhì)材料，其中Badh2基因第2外顯子突變類型12份，第7外顯子突變類型3份。在河南沿黃稻區(qū)光周期條件下，這15份種質(zhì)材料的開花日期從7月下旬至9月上旬不等，全生育期115 ～170 d。

水稻；香味基因；種質(zhì)資源；分子標(biāo)記

隨著水稻產(chǎn)量的增加，提高稻米品質(zhì)成為水稻育種工作的另一重大課題。香味是評價稻米食味品質(zhì)的重要指標(biāo)，優(yōu)質(zhì)香味稻米在國內(nèi)外市場普遍受消費者青睞，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和市場前景，因此，香味水稻品種的選育一直受到育種者的重視。目前水稻中鑒定出來的可揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)超過114種，其中與水稻香味直接相關(guān)的主要化學(xué)物質(zhì)已經(jīng)確定為2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)[1]。2AP是一種揮發(fā)性化合物，BRADBURY等[2-3]最先發(fā)現(xiàn)位于第8染色體的甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2第7外顯子8 bp堿基缺失和3個堿基突變導(dǎo)致該基因功能缺失，進(jìn)而導(dǎo)致2AP的積累。隨后SHI等[4]在“蘇玉糯”中發(fā)現(xiàn)第2個水稻香味等位基因，該香味基因是Badh2基因第2外顯子發(fā)生了7 bp堿基缺失導(dǎo)致該基因功能缺失。GAO等[5]在“妙香糯”中發(fā)現(xiàn)了第3個香味等位基因，該等位基因是Badh2在第4和第5外顯子之間發(fā)生了803 bp的堿基缺失。Badh2基因的產(chǎn)物BADH2催化γ-氨基丁酸醛的氧化，Badh2基因的功能缺失導(dǎo)致γ-氨基丁酸醛的積累，而γ-氨基丁酸醛是2AP合成的前體物質(zhì)，因此,香稻中2AP的增加是由于其合成前體物質(zhì)增加的結(jié)果[6]。在香味水稻品種育種中，對稻米香味的準(zhǔn)確鑒定在育種選擇過程中是十分關(guān)鍵的問題。傳統(tǒng)的稻米香味鑒定方法包括咀嚼法和氫氧化鉀浸泡法[7]。咀嚼法即在水稻收獲以后咀嚼水稻谷粒判斷是否有香味，氫氧化鉀浸泡法是將新鮮葉片剪碎后用1.7%氫氧化鉀溶液浸泡10 min后靠嗅覺判別是否有香味。傳統(tǒng)評價香味方法簡單易行，不需要特殊設(shè)備，但是對香味的判斷主觀性較強(qiáng)，不同的測試者可能得到不同的結(jié)果。分子標(biāo)記技術(shù)是基于基因序列的標(biāo)記技術(shù)，不受外界環(huán)境和主管評價等因素的影響，利用分子標(biāo)記技術(shù)對香味基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種有利于提高選擇的效率和準(zhǔn)確性，目前已在水稻產(chǎn)量、品質(zhì)、病蟲害抗性等領(lǐng)域育種中得到應(yīng)用并取得較好的效果[8]。河南沿黃稻區(qū)是聞名全國的優(yōu)質(zhì)粳米生產(chǎn)基地之一，得天獨厚的黃河水灌溉條件，加上光照充足，灌漿期間晝夜溫差大，非常有利于優(yōu)質(zhì)稻米的生產(chǎn)[9]。但是,目前推廣的水稻主栽品種中，含有香味基因的水稻品種并不多。香味基因的導(dǎo)入需要含有香味基因的種質(zhì)資源，利用雜交的方法導(dǎo)入到主栽品種中，從后代中選擇含香味基因的單株。遺傳研究表明，香味基因為單隱性質(zhì)量性狀，純合香型單株在雜交分離后代中只占25%左右，傳統(tǒng)選擇鑒定的效率及準(zhǔn)確性不高，借助分子標(biāo)記輔助選擇育種已在香稻育種中開始應(yīng)用[10-12]。另外，在水稻雜交時父母本花期不遇也是香味基因?qū)胫髟云贩N的主要障礙。水稻是短日照作物，不同緯度地區(qū)間引種栽培會引起生育期較大變化，能否將香味基因?qū)胙攸S稻區(qū)主栽品種，取決于已知含有香味基因的水稻品種在當(dāng)?shù)貤l件下是否能夠與主栽品種花期匹配。Badh2基因第2外顯子和第7外顯子缺失是比較常見的香味基因類型[12]。利用香味基因Badh2第2外顯子和第7外顯子特異的InDel標(biāo)記對208份粳稻資源進(jìn)行篩選，以期篩選出各個不同開花時期的含有香味基因的粳稻種質(zhì)資源，以指導(dǎo)河南沿黃稻區(qū)香稻品種的分子標(biāo)記輔助選育工作。

1 材料與方法

1.1材料

本研究中208份粳稻種質(zhì)資源見表1。 所有水稻材料種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)內(nèi)(113.42 E 34.44 N)，于2015-05-01播種育秧，2015-06-15插秧，生育期內(nèi)進(jìn)行常規(guī)大田管理，對所有材料于開花日期進(jìn)行記錄。

1.2香味基因檢測方法

采用SDS(十二烷基硫酸鈉)方法提取水稻葉片全基因組DNA，并稀釋至50 mg·L-1。根據(jù)Badh2基因序列分別擴(kuò)增包含第2外顯子和第7外顯子片段，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法檢測水稻Badh2基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度，根據(jù)PCR產(chǎn)物長度判斷該位點是否存在InDel缺失，進(jìn)而判斷該基因是否是香味基因以及是哪一種香味基因突變類型。其中，檢測第2外顯子突變類型的引物為E2-F(GGGAGGCGCTGAAGAGGA)，E2-R(GGGTAGTCACCACCCTACCTTG)[13]，檢測第7外顯子突變類型的引物為E7-F(TTAGGTTCTGAAGCCGGTGC)，E7-R(TCCACAGAAATTTGGAAACAAACCT)。PCR反應(yīng)為20 μL，其中DNA模板為1.0 μL，2×PCR mix為10.0 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL、水為7.0 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用6%聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳后銀染觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1不同水稻種質(zhì)資源的開花期

本研究中共收集粳稻材料208份種質(zhì)資源。這些種質(zhì)資源在河南沿黃稻區(qū)生態(tài)條件下的開花日期從7月中旬至9月上旬不等。根據(jù)其開花時期將208份粳稻材料分為5大類：7月中旬開花的材料11份，其中安農(nóng)晚粳B、生態(tài)稻、衛(wèi)國3份材料開花最早，7月12日前后進(jìn)入開花期；7月下旬開花的材料14份；8月上旬開花的材料30份；8月中旬開花材料46份，8月下旬開花材料90份；9月上旬開花材料17份(表1)。同種材料不同緯度種植其生育期會發(fā)生一定變化，不同地方引種時應(yīng)考慮其生育期長短。在雜交育種中，父母本花期能否相遇是育種工作的重要前提。

2.2香味基因分子標(biāo)記的特異性

本研究所用2個分子標(biāo)記E2, E7分別檢測Badh2香味基因第2外顯子和第7外顯子堿基缺失，其中分子標(biāo)記E2在香味基因與非香味基因上分別能擴(kuò)出100和107 bp的片段，分子標(biāo)記E7在香味基因與非香味基因上分別能擴(kuò)出215 和223 bp片段(表2)。PCR片段經(jīng)過6%PAGE膠電泳、顯色，膠圖上顯示相應(yīng)的DNA片段，香稻與非香稻之間條帶差異明顯、易分辨，而且標(biāo)記呈共顯性，能分辨出純合香味基因、純合非香味基因以及香與非香雜合基因位點(圖1B)。

表1 208個水稻材料在河南沿黃稻區(qū)光照周期條件下的開花時期Table 1 The flowering time of 208 rice materials under photoperiod condition alongside Huanghe River in Henan

表2 2個香味類型分子標(biāo)記信息Table 2 Information of two types of fragrance gene markers

2.3種質(zhì)資源的香味基因檢測結(jié)果

分別以208份粳稻材料的DNA為模板，以分子標(biāo)記E2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明，208份材料中有武香粳9號、寧粳2號、白香粳、寧粳3號、武育粳21、南粳5055、武香粳14、銀香1號、南粳46、南粳9108、新稻568、小香共12份材料可擴(kuò)增出100 bp大小片段，說明武香粳9號等12份材料屬于同E2外顯子突變類型香稻材料，在Badh2基因第2外顯子存在7 bp缺失。日本晴等其他材料擴(kuò)增出107 bp大小片段，表明這些材料的Badh2等位基因不存在7 bp缺失，屬于非香類型。

以分子標(biāo)記E7進(jìn)行的檢測表明，208份材料中云氮3號、高株稻、南粳52共3份材料可擴(kuò)增出215 bp片段，日本晴等其他材料擴(kuò)增出223 bp大小片段，表明云氮3號和高株稻屬于第7外顯子存在8 bp,缺失3 bp突變類型，其中南粳52可擴(kuò)增出215 和223 bp兩個片段，顯示南粳52在Badh2基因位點是香與非香等位基因的雜合體。

3 結(jié)論與討論

香味是評價稻米食味品質(zhì)的重要指標(biāo)，優(yōu)質(zhì)香稻品種選育也越來越受到水稻育種者重視，水稻雜交育種過程中花期不遇是雜交的主要障礙之一。在香稻品種選育過程中，選擇花期合適的香味基因供體親本是選擇香稻品種的前體和基礎(chǔ)。本研究中篩選了208份水稻粳稻資源，在河南沿黃稻區(qū)生態(tài)條件下開花期從7月中旬到9月上旬不等，從中篩選出含有香味基因的水稻品種/品系15份，其中第2外顯子突變類型12份，第7外顯子突變類型3份，這些含有香味基因的水稻材料開花期從7月旬至9月上旬不等。不同花期的水稻品種如果要雜交導(dǎo)入香味基因均可找到可匹配的香稻材料，這為沿黃稻區(qū)香稻雜交選育提供了可供選擇的基因來源。另外，在雜交后代選擇過程中，香味的鑒定易受生態(tài)環(huán)境、栽培措施、主觀因素等條件的影響，而且香味基因又是隱性等位基因，所以傳統(tǒng)選擇容易造成香味基因的丟失，而分子標(biāo)記輔助選擇不受環(huán)境和人為因素影響，能準(zhǔn)確地判斷香味基因的有無[8, 14]?？梢罁?jù)第2外顯子突變類型和第7外顯子突變類型特異的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇以提高選擇效率，為河南沿黃稻區(qū)優(yōu)質(zhì)稻米品種選育提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

A.分子標(biāo)記E2檢測的Badh2基因位點帶型。1～12分別代表武香粳9號、日本晴、寧粳2號、方欣4號、白香粳、黃金晴、新豐2號、小香、方欣1號、南粳9108、新稻568、鎮(zhèn)稻10號；B. 分子標(biāo)記E7檢測的Badh2基因位點帶型。1～7分別代表云氮3號、日本晴、黃金晴、高株稻、方欣4號、新豐2號、南粳52。

A. Band genotype of E2 molecular marker. 1～12 indicates Wu-xiangjing 9, Nipponbare, Ningjing 2, Fangxin 4, Baixiangjing, Huangjinqing, Xinfeng 2, Xiaoxiang, Fangxin1, Nanjing 9108, Xindao 568, Zhendao 10. B. Band genotype of E7 molecular marker. 1～7 indicates Yundan 3, Nipponbare, Huangjinqing, Gaozhudao, Fangxin 4, Xinfeng 2, Nanjing 52.

圖12個分子標(biāo)記對部分材料電泳檢測圖
Fig.1Electrophoresispatternof2molecularmarkersondetectedmaterials

[1] CHEN S, YANG Y, SHI W, et al.Badh2, encoding betaine aldehyde dehydrogenase, inhibits the biosynthesis of 2-acetyl-1-pyrroline, a major component in rice

fragrance[J]. Plant Cell, 2008, 20(7):1850-1861.

[2] BRADBURY L M, FITZGERALD T L, HENRY R J, et al. The gene for fragrance in rice[J]. Plant Biotechnology Journal, 2005, 3: 363-370.

[3] BRADBURY L M T, GILLIES S A, BRUSHETT D J, et al. Inactivation of an aminoaldehyde dehydrogenase is responsible for fragrance in rice[J].Plant Molecular Biology, 2008, 68(4):439-449.

[4] SHI W, YANG Y, CHEN S, et al. Discovery of a new fragrance allele and the development of functional markers for the breeding of fragrant rice varieties[J]. Molecular Breeding, 2008,22(2):185-192.

[5] SHAO G N, TANG A, TANG S Q, et al. A new deletion mutation of fragrant gene and the development of three molecular markers for fragrance in rice[J]. Plant Breeding, 2008, 130(2):172-176.

[6] KOVACH M J, CALINGACION M N, FITZGERALD M A, et al. The origin and evolution of fragrance in rice (OryzasativaL.)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009 ,106(34):14444-14449.

[7] 楊揚(yáng)，謝震澤，王軻，等. 水稻香味的遺傳研究進(jìn)展[J].首都師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010, 31(3)：24-29:.

[8] 朱義旺，林雅容，陳亮. 我國水稻分子育種研究進(jìn)展[J].廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2016, 55 (5):661-671.

[9] 王留梅.河南沿黃稻區(qū)優(yōu)質(zhì)稻米產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展對策[J]. 中國稻米, 2006, 12(5):56-57.

[10] 許言福，黃菊，王英存，等. 兩種篩選水稻badh2-E2類型香味基因分子標(biāo)記的建立[J].分子植物育種, 2015(11):2441-2445.

[11] 張江麗，李蘇潔，李娟，等. 不同來源水稻種質(zhì)資源香味基因badh2位點的鑒定[J].分子植物育種, 2015, 13(4):727-733.

[12] 閆影，諸光明，張麗霞，等. 水稻香味基因分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用[J].西北植物學(xué)報, 2015, 35(2):269-274.

[13] 王軍，楊杰，陳志德，等. 水稻香米基因標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用[J]. 分子植物育種, 2008, 6(6):1209-1212.

[14] 魏文嵩，胡純仰，鄉(xiāng)少芹，等. 特種稻紅米與香味分子標(biāo)記多重PCR體系的構(gòu)建與應(yīng)用[J].分子植物育種, 2015, 13(5):977-981.

(責(zé)任編輯：常思敏)

ScreenofricegermplasmwithfragrancegeneinregionsalongsideHuangheRiveofHenan

GUO Kai, SONG Ningyuan, SUN Hongzheng, ZHAO Quanzhi

(College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Two hundred and eight rice germplasms from regions alongside the Huanghe River in Henan province were screened and 15 were found containing the fragrance geneBadh2. Of the 15 fragrance rice germplasms, 12 were exon 2 mutant type and 3 were exon 7 mutant type. Under photo-period condition alongside Huanghe River in Henan, the flowering time of the 15 fragrance rice germplasms va-ried from late in July to early in September.

rice; fragrance gene; germplasm; molecular marker

S 511.1

：A

2016-12-20

河南省重大科技專項(141100110600)

郭 凱(1991-)，男，河南安陽人，碩士研究生，從事稻米品質(zhì)研究。

趙全志(1968-)，男，河南駐馬店人，教授，博士。

1000-2340(2017)03-0308-04