高培元

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院）

益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性研究

高培元

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院）

目的：對(duì)益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性研究，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。方法：PDA培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中菌液和菌絲分離，乙酸乙酯萃?。粸V紙片法進(jìn)行抗菌活性篩選。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)對(duì)14株益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，可知益母草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)各指示菌均有抑菌作用。結(jié)論：益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抑菌作用。

益母草；內(nèi)生真菌；抑菌活性

益母草(Leonurus japonicus Houtt.)為唇形科植物，一年或兩年生草本，含有生物堿和黃酮等活性物質(zhì)，其干燥地上部分為常用中藥， 味辛苦、涼、活血、祛淤、調(diào)經(jīng)、消水，治療婦女月經(jīng)不調(diào)、胎漏難產(chǎn)、胞衣不下、產(chǎn)后血暈、瘀血腹痛、崩中漏下、尿血、瀉血、癰腫瘡瘍。

一、材料與方法

1、材料

菌種 實(shí)驗(yàn)室前期保存的益母草內(nèi)生真菌。

培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：蒸餾水，葡萄糖，馬鈴薯，瓊脂；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，NaCl。

試劑 75%醫(yī)用酒精（山東利爾康消毒科技有限公司），青霉素（160萬單位哈藥集團(tuán)制藥總廠），鏈霉素（100萬單位華北制藥股份有限公司），BR Kermel瓊脂粉（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠），乙酸乙酯（工業(yè)級(jí)），蒸餾水。

儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：HH-B11.500BS）(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、電子天平（ES-2002H）(長沙湘平科技發(fā)展有限公司)，滅菌鍋（YS280B）(上海市三申醫(yī)療器械有限公司)，冰箱（BCD-217CFA）(澳柯瑪股份公司)，超凈臺(tái)，恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），恒溫振蕩器（SHZ-82）（國華儀器有限公司），JJ-CJ-ID 型超凈工作臺(tái)（杭州凈化設(shè)備廠），AB104-N 電子天平(Mettle-Toledo)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52CS）(上海榮生化儀器廠)，循環(huán)水式多用真空泵（SHBIIIA）(鄭州長城科貿(mào)有限公司)、紗布、錐形瓶、漏斗等。

2、實(shí)驗(yàn)（設(shè) 計(jì)）方案

2.1 菌種的復(fù)蘇

2.1.1 PDA固體培養(yǎng)基的制備

（1）將20個(gè)培養(yǎng)皿滅菌后，放入超凈臺(tái)，紫外滅菌；

（2）將馬鈴薯洗凈，削皮后稱重100g，切成小丁，并用蒸餾水洗2～3次；

（3）將馬鈴薯放入鍋中，加入蒸餾水沒過馬鈴薯，并用玻璃棒攪拌蒸煮大約30min；

（4）稍微冷卻后，用八層紗布過濾，棄濾渣；

（5）將濾液稀釋到500m，加入100g葡萄糖，6.5g瓊脂并混合均勻；

（6）將混合均勻的液體裝入錐形瓶中，用報(bào)紙及紗布封口，高壓滅菌30min后，取出放入超凈臺(tái)；

（7）待稍微冷卻后加入青霉素和鏈霉素；

（8）倒平板，每個(gè)培養(yǎng)皿約20～30mL，水平放好，待其凝固。

2.1.2 菌種的接種

將冷藏菌種放于室溫2h，然后在滅菌30min后的超凈臺(tái)上,以無菌操作法接到2.1.1項(xiàng)下制備的平板上,放于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5-7天。

2.2 菌種的發(fā)酵

2.2.1 種子罐培養(yǎng)

將平板上長好的菌種于滅菌30min后的超凈臺(tái)上，接到裝有300mL PD培養(yǎng)基的錐形瓶中，放入搖床(28℃，120r/min)中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)7-15天。

2.3 發(fā)酵液的處理

將發(fā)酵好的菌液用八層紗布過濾，將液體與菌絲分離，把得到的菌液和菌絲分別用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位的浸膏。將所得浸膏放入烘箱使之完全干燥，待干燥后制成10mg/ml的樣品溶液，裝入小玻璃瓶中待用。

2.4 粗品及單體化合物的抑菌

2.4.1 益母草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物濾紙片制備及處理

用打孔器將濾紙制成直徑為6mm的小圓片，121℃高溫滅菌30min備用。待測樣品發(fā)酵液用無菌水稀釋為10mg/ml，以備后用。

2.4.2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備

（1）將20個(gè)培養(yǎng)皿高溫滅菌后，放入超凈臺(tái)，紫外滅菌；

（2）于500ml錐形瓶中稱取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，瓊脂15-20g；

（3）加1000ml蒸餾水使完全溶解；

（4）調(diào)節(jié)PH 7.5左右，制成培養(yǎng)基溶液，進(jìn)行高溫滅菌；

（5）滅菌結(jié)束將錐形瓶置于超凈臺(tái)中，稍作冷卻后及時(shí)倒平板；

（6）倒平板，每個(gè)培養(yǎng)皿約20～30mL，水平放好，待其凝固。

2.4.3 抑菌試驗(yàn)

將大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，地衣芽孢桿菌，肺炎雙球菌，綠膿芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃懸搖24h，制備所需菌懸液，再用無菌水稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4濃度梯度，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上涂布，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，確定最適生長濃度。在倒好的培養(yǎng)基中加入最適濃度的菌懸液150ml，用涂布棒將菌液涂布均勻，制成含菌平板，然后用濾紙片蘸取10mg/ml的鏈霉素緩沖液放在平板中央做陽性對(duì)照，再將濾紙片蘸取樣品貼在平板上，每皿貼一片，每個(gè)菌種做兩個(gè)平行。完成以后，將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，采用求平均值法測定濾紙片的抑菌圈直徑大小，并比較它們抑菌效果。

二、結(jié)果與分析

2.1 益母草 內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)5種指示菌均有不同的抑制作用， 其中對(duì)大腸桿菌的抑制作用較為明顯，占樣品總數(shù)的70.1%；對(duì)地衣芽孢桿菌有抑制作用的占樣品總數(shù)的55.2%；對(duì)大腸桿菌有抑制作用比較少，僅有4種樣品，僅占樣品總數(shù)的28.6%；對(duì)肺炎鏈球菌有抑制作用的占樣品總數(shù)的42.9%；對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用的占樣品總數(shù)的35.7%。其中有5個(gè)樣品，對(duì)2種以上指示菌有抑制作用。經(jīng)由梯度稀釋實(shí)驗(yàn)得出樣品對(duì)指示菌抑制作用的最小抑制濃度，通過對(duì)5種不同的濃度的指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)比較，可得益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有一定的抑菌作用。

表1 益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性測定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)圖例

2.2 結(jié)論

抑菌實(shí)驗(yàn)表明，具有抑菌作用的樣品占樣品總數(shù)的64.3%，其中具有2種及以上抑菌作用的樣品占樣品總數(shù)的35.7%。但由于提取實(shí)驗(yàn)樣品均為粗品，所以抑菌作用未能完全發(fā)掘出來，表明益母草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物含有較多的抑菌資源，有待進(jìn)一步探索。另外實(shí)驗(yàn)所采取的濾紙片抑菌法效果稍差，未能得出準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

三、主要參考文獻(xiàn)

[1]郭良棟 . 內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].菌 物 系 統(tǒng)，2012,，2 0(5):572 -580

[2]王靖，章華偉. 益母草內(nèi)生真菌分離與初步鑒定[J].氨基酸和生物資源，2012，34(3):16-18

[3]阮金蘭，杜俊蓉，曾慶忠，等. 益母草的化學(xué)、藥理和臨床研究進(jìn)展[J] .中草藥，2003，34(11):15-18

[4]王建鋒，呂華鷹，蘇文金.植物內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2000,27(1):58-60.

[5]Yin J,Zhang ZW,Yu WJ,et al.The Chinese herb Leonurus heterophyllus Sweet[J].The American journal of Chinese medicine,2010, 38(1):750-765

[6]Miller K l，Qing C, Szc DMY，et al. Culturablc cndophytes of medicinal plants and the genetic basis fortheir bioactivity[J]. Microbial Ecology, 2012，64(2):431-449

[7]徐玲玲，單慶紅，郭斌.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及展望[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013,41(13):5641-5643

[8]張杰,何勁,康翼川,等.植物內(nèi)生真菌及活性代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展[J].菌物研究,2005,3(4):30-36

[9]龐雷,嚴(yán)鑄云,梁俊玉,等.內(nèi)生真菌在中藥中的應(yīng)用前景[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2005,16(3):242-243

[10]王建鋒,呂華鷹,蘇文金.植物內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2000,27(1):58-60