徐江紅 梁瓊 劉向 李雯 戴文佳

·基礎(chǔ)研究·

白細(xì)胞介素17A在肺炎鏈球菌急性中耳炎黏膜免疫中的作用△

徐江紅 梁瓊 劉向 李雯 戴文佳

目的探討白細(xì)胞介素17A(IL-17A)在肺炎鏈球菌急性中耳炎(AOM)黏膜免疫中的作用。方法6～8周無特定病原體(SPF)級BALB/c小鼠，在感染前24 h腹腔注射200 μg IL-17A抗體中和體內(nèi)的IL-17A,注射相同劑量的Ig2a抗體作為對照組(Ig2a)，經(jīng)鼓膜途徑注射肺炎鏈球菌，感染后第5天取中耳灌洗液，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測IL-17A、CXCL2和CXCL5的水平。取中耳聽泡，乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，評估中耳炎的嚴(yán)重程度。新型肺炎鏈球菌PsaA蛋白疫苗經(jīng)鼻腔途徑免疫小鼠，末次免疫后2周取小鼠的脾臟，制成細(xì)胞懸液，PsaA抗原刺激72 h，ELISA檢測培養(yǎng)上清液IL-17A的水平；末次免疫后2周經(jīng)鼓膜途徑注射肺炎鏈球菌，攻毒后5 d取中耳灌洗液，ELISA檢測IL-17A、CXCL2和CXCL5的水平。中耳攻毒后5 d取中耳黏膜，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA,熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測IL-6、防御素β2和CXCL2 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果在固有免疫中，中和體內(nèi)的IL-17A，感染肺炎鏈球菌后，中耳有更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，且中耳IL-17A、CXCL2和CXCL5分泌減少；在適應(yīng)性免疫中，新型肺炎鏈球菌PsaA蛋白疫苗在CTB黏膜佐劑作用下經(jīng)鼻腔途徑免疫后，脾上清液分泌了較高水平的IL-17A，中耳攻毒后中耳黏膜灌洗液中檢測到較高水平IL-17A，相關(guān)細(xì)胞因子CXCL2、CXCL5水平增高，中耳黏膜IL-6、防御素β2、CXCL2 mRNA表達(dá)量明顯增高。結(jié)論IL-17A在肺炎鏈球菌AOM黏膜免疫中起重要的保護(hù)作用，為AOM的治療和新一代疫苗的設(shè)計及免疫策略的選擇提供了實驗依據(jù)。(中國眼耳鼻喉科雜志，2017，17：318-322,332)

白細(xì)胞介素17A；黏膜免疫；急性中耳炎；肺炎鏈球菌

急性中耳炎(acute otitis media，AOM)是兒童最常見的感染性疾病之一，發(fā)病率僅次于上呼吸道感染。國內(nèi)沒有確切的AOM發(fā)病率報道。據(jù)歐洲和美國等報道，80%的兒童在3歲之前至少發(fā)作過1次AOM。肺炎鏈球菌是AOM最常見的病原菌，30%～60%的AOM由肺炎鏈球菌引起[1-2]。肺炎鏈球菌主要通過咽鼓管黏膜途徑感染中耳引起AOM，黏膜的固有免疫反應(yīng)是防御的第一道防線，對于細(xì)菌的清除起重要作用，但是具體的清除機(jī)制目前仍不清楚。已有多項研究顯示，在多種細(xì)菌的急性感染中，白細(xì)胞介素17A(interleukin-17A, IL-17A)發(fā)揮重要的防御作用，IL-17A具有強(qiáng)大的募集中性粒細(xì)胞到局部黏膜的能力，從而促進(jìn)病原體的清除。IL-17A在肺炎鏈球菌AOM的固有免疫中是否也發(fā)揮重要作用，相關(guān)研究較少。疫苗也是預(yù)防AOM的有效手段，抗體一直被認(rèn)為是肺炎鏈球菌感染性疾病的主要防御機(jī)制。但是近年有研究證實，疫苗誘發(fā)的抗體非依賴的、CD4+T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)加速了鼻咽部肺炎鏈球菌的清除，主要通過CD4+T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)分泌的IL-17A發(fā)揮作用。IL-17A在肺炎鏈球菌AOM的適應(yīng)性黏膜免疫保護(hù)中是否也發(fā)揮重要作用，尚無研究報道。前期我們已采用新型肺炎鏈球菌蛋白疫苗，以殼聚糖為黏膜佐劑，經(jīng)鼻腔途徑免疫小鼠，每周2次，連續(xù)3周；末次免疫后2周檢測血清特異性免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)和黏膜特異性IgA抗體水平，發(fā)現(xiàn)均明顯增高并且在末次免疫后2周中耳注射肺炎鏈球菌，小鼠中耳的炎癥反應(yīng)明顯減弱[3]，證實新型蛋白疫苗在黏膜佐劑作用下可以對AOM產(chǎn)生保護(hù)作用，但I(xiàn)L-17A在免疫保護(hù)中的作用并不明確。本研究的目的是探討IL-17A 在肺炎鏈球菌AOM固有黏膜免疫和適應(yīng)性黏膜免疫中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級雌性BALB/c小鼠，6～8周，體重16～18 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。肺炎鏈球菌感染前飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部SPF級實驗室，肺炎鏈球菌感染后飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部生物安全2級實驗室(ABSL-2級實驗室)。所有實驗小鼠在中耳感染前均在顯微鏡下確認(rèn)無自發(fā)性中耳炎發(fā)生。所有動物實驗均經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院倫理委員會認(rèn)可和批準(zhǔn)。

1.2 菌珠、培養(yǎng)基及細(xì)菌培養(yǎng) 14型肺炎鏈球菌購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(產(chǎn)品編號：31226)；肺炎鏈球菌液體培養(yǎng)基Todd-Hewitt Broth為Sigma公司產(chǎn)品，固體培養(yǎng)基哥倫比亞血瓊脂平板為上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品。從-80 ℃冰箱中取出保存的菌種，挑取適量肺炎鏈球菌14型標(biāo)準(zhǔn)株菌液，接種于含0.5%酵母提取物的Todd-Hewitt Broth培養(yǎng)基中，置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。然后按1∶200體積比轉(zhuǎn)接繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，以無菌生理鹽水洗滌2次，倍比稀釋法菌落計數(shù)，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)重懸至濃度為每毫升8×108菌落形成單位(colony-forming units，CFU)備用。

1.3 主要試劑 IL-17A中和抗體為R&D公司產(chǎn)品；Ig2a同型對照抗體為Biolegend公司產(chǎn)品； CXCL2、CXCL5 ELISA試劑盒為Abcam公司產(chǎn)品；IL-17A ELISA試劑盒為Biolegend公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒(RNeasy Micro Kit)為Qiagen公司產(chǎn)品；PrimeScriptTM RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRTMPremix Ex TaqTMRT-PCR試劑盒均購自Takara公司。

1.4 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)引物 在 Genebank 上查詢以下基因的序列，并根據(jù)此序列設(shè)計用 Primer 3.0 進(jìn)行引物設(shè)計，由深圳華大基因股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 qPCR檢測的基因及相應(yīng)的引物序列

1.5 小鼠中耳感染 據(jù)文獻(xiàn)[4]報道方法，6～8周SPF級BALB/c小鼠在肺炎鏈球菌感染前24 h腹腔注射200 μg IL-17A抗體中和體內(nèi)的IL-17A,注射相同劑量的Ig2a抗體作為對照組(Ig2a)。小鼠予氯胺酮(80 mg/kg)/甲苯噻嗪(6 mg/kg)腹腔注射輕度麻醉，在顯微鏡下用微量注射器經(jīng)鼓膜前下方注射14型肺炎鏈球菌，每只耳5 μL(2×107CFU)，對照組注射相同劑量PBS。實驗共分6組：野生型BALB/c小鼠+肺炎鏈球菌感染組、野生型BALB/c小鼠+PBS組、Ig2a抗體BALB/c小鼠+肺炎鏈球菌感染組、Ig2a抗體BALB/c小鼠+PBS組、IL-17A抗體BALB/c小鼠+肺炎鏈球菌感染組、IL-17A抗體BALB/c小鼠+PBS組，每組12只。

1.6 中耳灌洗液收集及檢測 在中耳感染后第5天取中耳灌洗液。具體方法：10 μL微量注射器吸取5 μL預(yù)冷的PBS，穿破鼓膜，注入中耳，回收灌洗液，反復(fù)灌洗20次；每只耳收集約100 μL灌洗液，按照試劑盒操作說明采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測中耳灌洗液中IL-17A、CXCL2、CXCL5水平。

1.7 中耳組織切片蘇木素-伊紅染色 中耳感染后第5天處死IL-17A抗體中和組和Ig2a抗體對照組小鼠。將動物斷頭后，去除皮膚，剪斷雙側(cè)顳頜關(guān)節(jié)，去除下頜骨，暴露上腭，保留鼻咽部軟組織。沿枕骨大孔剪開頂骨，去除腦組織以充分暴露顱底。剪除附著肌肉等軟組織，完整取下包含雙側(cè)聽泡的顱底，置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h；然后置于10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液中脫鈣1個月左右；常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，評估中耳炎嚴(yán)重程度。以Image-Pro Plus 6.0軟件分析單位面積(10 000 μm2)內(nèi)中耳炎癥細(xì)胞的數(shù)目。每組6只動物，每只動物觀察5張切片，每張切片隨機(jī)選擇5個視野，取均數(shù)作為該動物的代表值。

1.8 小鼠黏膜免疫 6～8周BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別接受肺炎鏈球菌表面黏附素A (pneumococcal surface adhesion A, PsaA)蛋白免疫(PsaA組，15 μg PsaA蛋白)，PsaA蛋白及CTB免疫 (PsaA/CTB組，15 μg PsaA/4 μgCTB), CTB免疫(CTB組，4 μg CTB)；經(jīng)鼻腔途徑免疫，相同劑量和方法，每周免疫2次，連續(xù)3周。

1.9 標(biāo)本收集及檢測 末次免疫后2周取小鼠的脾臟，制成細(xì)胞懸液，PsaA抗原刺激72 h，方法同以前的實驗[3]報道，按試劑盒說明ELISA檢測培養(yǎng)上清液IL-17A水平。末次免疫后2周，經(jīng)鼓膜途徑(方法同前)注射肺炎鏈球菌，每只耳5 μL( 2×106CFU),攻毒后5 d取中耳灌洗液(方法同前)，ELISA檢測IL-17A、CXCL2和CXCL5水平。中耳攻毒后5 d，處死小鼠。打開聽泡，取下整個聽泡外側(cè)壁，在顯微鏡下用顯微鑷剝離中耳黏膜，利用RNA提取試劑盒抽提總RNA,用超微量分光光度儀(NanoDrop2000,Thermo scientific)檢測總RNA的純度和含量。按照PrimeScriptTM RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，配置反轉(zhuǎn)錄體系，于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。所用條件為37 ℃ 15 min反轉(zhuǎn)錄，85 ℃ 5 s滅活。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA按照熒光定量PCR試劑盒說明配置反應(yīng)體系，于熒光定量PCR儀(FTC3000HT，F(xiàn)unglyn Biotech Incorporated)進(jìn)行反應(yīng)，以內(nèi)參 GAPDH表達(dá)量為參照，采用2- △ △ Ct法進(jìn)行相對定量分析IL-6、防御素β2、CXCL2 mRNA水平。

2 結(jié)果

2.1 IL-17A、CXCL2、CXCL5在肺炎鏈球菌感染后水平 中耳灌洗液中IL-17A的水平與Ig2a組或無抗體中和組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1A)。趨化因子CXCL2、CXCL5水平在所有肺炎鏈球菌感染組均比PBS組水平高，表明感染促進(jìn)了趨化因子的分泌；但在IL-17A抗體中和組，感染后CXCL2、CXCL5的分泌水平明顯低于Ig2a組或無抗體中和組感染后的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1B、1C)，與IL-17A的變化一致，提示CXCL2、CXCL5的分泌與IL-17A有關(guān)。

2.2 中耳炎癥反應(yīng) 病理組織學(xué)結(jié)果表明：IL-17A抗體中和組與Ig2a抗體組比較，在感染肺炎鏈球菌后有更嚴(yán)重的中耳炎反應(yīng)，中耳炎癥細(xì)胞數(shù)明顯高于Ig2a抗體組(P<0.05,圖2)。

2.3 黏膜免疫后脾上清液IL-17A水平 黏膜免疫后取小鼠的脾臟培養(yǎng)，抗原刺激后，PsaA、PsaA/CTB組均有較高水平的IL-17A產(chǎn)生，與CTB組相比差異顯著，且PsaA/CTB組分泌的IL-17A水平明顯高于PsaA組(圖3)，提示該免疫策略誘導(dǎo)了全身Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答，IL-17A可能在黏膜免疫中發(fā)揮作用。

圖1. 中耳灌洗液中IL-17A、CXCL2、CXCL5水平 *示與另外2組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

圖3. 脾上清液IL-17A水平 *示與PsaA組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

2.4 中耳IL-17A、CXCL2和CXCL5表達(dá)水平及相關(guān)因子表達(dá)分析 PsaA、PsaA/CTB組灌洗液中IL-17A、CXCL2和CXCL5水平均較對照組高，且PsaA/CTB組均高于PsaA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)；熒光定量PCR檢測中耳黏膜IL-6、防御素β2、CXCL2 mRNA表達(dá)水平，與CTB組比較，PsaA、PsaA/CTB組IL-6、防御素β2、CXCL2 mRNA表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但PsaA與PsaA/CTB組之間無明顯差異(P>0.05)(圖5)。

圖4. 黏膜免疫并中耳攻毒后的中耳灌洗液中IL-17A、CXCL2、CXCL5水平 *示與PsaA組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

圖5. 中耳黏膜IL-6、防御素β2、CXCL2 mRNA 相對表達(dá)量 *示與CTB組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

3 討論

IL-17A 是Th17細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)因子，具有強(qiáng)烈的促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞、中性粒細(xì)胞募集的功能和促進(jìn)上皮細(xì)胞增生、分化，保持上皮細(xì)胞完整性，維持上皮屏障作用的功能，其調(diào)節(jié)呼吸道抗感染固有免疫和免疫炎癥反應(yīng)的作用備受關(guān)注，被視為固有免疫和獲得性免疫的橋梁[5]。有研究[6]表明，IL-17A已經(jīng)至少對12種黏膜感染的病原體在黏膜表面的清除起重要作用，而且由于基因突變，缺乏Th17細(xì)胞的人群對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及流感嗜血桿菌更易感。肺炎鏈球菌是鼻咽部寄殖菌，在機(jī)體免疫力低下時可通過咽鼓管途徑引起中耳感染，導(dǎo)致AOM。有研究[7]表明，對于鼻咽部黏膜表面肺炎鏈球菌的清除，IL-17A起關(guān)鍵作用。在AOM動物模型中，也有研究[8]證實IL-17A通過募集中性粒細(xì)胞以及誘發(fā)凋亡，促進(jìn)肺炎鏈球菌的清除。在固有免疫研究中，我們也觀察到小鼠在中耳感染肺炎鏈球菌后中耳灌洗液中伴隨著IL-17A表達(dá)增高以及趨化因子CXCL2、CXCL5分泌的增多，但是在IL-17A中和組，IL-17A以及CXCL2、CXCL5分泌明顯減少，并且IL-17A中和組中耳有更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，表明在體內(nèi)IL-17A缺乏時更易感染AOM。

疫苗是預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病的有效手段，目前在臨床上應(yīng)用的有2類肺炎鏈球菌疫苗，一類是多糖疫苗，另一類是多糖蛋白結(jié)合疫苗。由于其免疫效果受血清型限制，僅對部分血清型肺炎鏈球菌感染性疾病有效，而且出現(xiàn)血清型替代現(xiàn)象[9]；另外，2類疫苗在臨床上均采用肌內(nèi)注射方式，對于通過黏膜途徑感染的AOM保護(hù)能力有限。因此，近年來，以肺炎鏈球菌表面保守蛋白為基礎(chǔ)的無血清型限制的新型肺炎鏈球菌疫苗成為研究熱點，而且黏膜途徑可能成為免疫新途徑[10-11]。PsaA是一種相對分子質(zhì)量為37 kD的肺炎鏈球菌表面錨定蛋白，是金屬黏附脂蛋白家族中的一員，作為ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的一部分參與Mn2+及Zn2+向肺炎鏈球菌的傳輸,介導(dǎo)肺炎鏈球菌對上呼吸道上皮細(xì)胞的黏附[12]。PsaA存在于所有臨床分離的肺炎鏈球菌菌株中，且具有高度保守性[13]。多項動物實驗研究均證實PsaA免疫對降低肺炎鏈球菌鼻咽部的寄居最為有效[14]。我們的前期研究也已證實PsaA蛋白疫苗經(jīng)鼻腔途徑免疫可以對AOM產(chǎn)生保護(hù)作用[3]，因此PsaA可以作為一種無血清型限制的新型肺炎鏈球菌疫苗候選抗原。

目前有研究[15-16]認(rèn)為肺炎鏈球菌疫苗獲得性免疫保護(hù)作用機(jī)制主要有2種，對肺炎鏈球菌引起的敗血癥等侵襲性疾病主要通過抗體的產(chǎn)生發(fā)揮保護(hù)作用，對于肺炎鏈球菌黏膜定植的減少主要是通過抗體非依賴性的分泌IL-17A的Th17細(xì)胞發(fā)揮作用。而且有研究[17]表明，黏膜免疫中IL-17A對于黏膜分泌的特異性IgA抗體的產(chǎn)生也起重要作用。AOM是鼻咽部定植的肺炎鏈球菌通過咽鼓管途徑引起，推測IL-17A在黏膜免疫疫苗預(yù)防AOM的保護(hù)中很可能也發(fā)揮主要作用。因此在獲得性免疫研究中，我們采用PsaA蛋白疫苗，以霍亂毒素B(CTB)作為黏膜佐劑，經(jīng)鼻腔黏膜免疫途徑免疫小鼠。

黏膜免疫系統(tǒng)由2部分組成，即黏膜誘發(fā)部位和黏膜效應(yīng)部位。鼻相關(guān)淋巴組織是上呼吸道黏膜誘發(fā)部位，而中耳黏膜是效應(yīng)部位。黏膜免疫后，誘發(fā)部位完成抗原的攝取、呈遞及免疫細(xì)胞的活化，活化的T、B細(xì)胞經(jīng)過循環(huán)到達(dá)效應(yīng)部位產(chǎn)生抗體或細(xì)胞因子發(fā)揮作用[18]。在本研究中，PsaA蛋白疫苗免疫后中耳灌洗液檢測到IL-17A水平，且在CTB佐劑作用下IL-17A的水平更高，表明黏膜免疫后中耳有活化的Th17細(xì)胞產(chǎn)生，在感染后分泌IL-17A，從而清除中耳細(xì)菌。有研究[19]顯示 IL-6與 IL-17A 的產(chǎn)生和維持相關(guān)，與上述報道相符。我們也發(fā)現(xiàn)在中耳黏膜中有 IL-6基因表達(dá)水平的上調(diào)。IL-17A發(fā)揮抗感染作用的機(jī)制之一就是促進(jìn)固有免疫因子和趨化因子的產(chǎn)生。防御素β2是呼吸道固有免疫必不可少的因子，具有強(qiáng)烈的抗微生物活性以及趨化巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞作用。有研究[20]顯示IL-17A是防御素β2最強(qiáng)烈的刺激因子。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)免疫后中耳黏膜防御素β2基因表達(dá)水平增高。CXCL2和CXCL5屬于CXC類趨化因子，具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集與活化功能。多項研究表明IL-17A可促進(jìn)黏膜CXCL2和CXCL5的分泌。本研究中，也觀察到在免疫的小鼠感染肺炎鏈球菌后中耳灌洗液中CXCL2和CXCL5升高，與IL-17A的分泌水平一致，而且中耳黏膜CXCL2表達(dá)水平增高。

黏膜免疫系統(tǒng)是不同于全身免疫系統(tǒng)的高度獨立、具有獨特功能的免疫系統(tǒng)，黏膜免疫在誘導(dǎo)局部黏膜免疫反應(yīng)的同時也可誘發(fā)全身免疫應(yīng)答。我們在免疫后也檢測了小鼠脾細(xì)胞分泌的IL-17A水平，在PsaA/CTB組，IL-17A的水平明顯高于PsaA組及CTB組，表明黏膜免疫活化了CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)了全身細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。

總之，目前的研究證實IL-17A不僅在小鼠肺炎鏈球菌AOM的自然防御中起重要作用，在疫苗的適應(yīng)性黏膜免疫保護(hù)中也發(fā)揮著重要作用，促進(jìn)了肺炎鏈球菌從中耳的清除，因此IL-17A很可能成為AOM潛在的治療手段。本研究也為新一代肺炎鏈球菌疫苗的設(shè)計及免疫策略的選擇提供了實驗依據(jù)。

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Roleofinterleukin17Ainmucosalimmunityagainstpneumococcalacuteotitismedia

XUJiang-hong,LIANGQiong,LIUXiang,LIWen,DAIWen-jia.

DepartmentofOtolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

DAI Wen-jia, Email: daiwenjia@126.com

ObjectiveTo explore the role of interleukin-17A (IL-17A) in mucosal immunity against pneumococcal acute otitis media (AOM).MethodsTwenty-four hours before infection withStreptococcuspneumoniae(SP) 200 μg anti-murine IL-17A was administered intraperitoneally in BALB/c mice. As a control, 200 μg isotype matched rat IgG2a was used. Then, AOM in BALB/c mice was induced by the tympanic route. The degree of the inflammation in the middle ear was evaluated by hematoxylin-eosin (HE) staining. The levels of CXCL5, CXCL2 and IL-17A in the SP-infected mice middle ear lavages (MEL) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). PsaA protein was prepared as a new generation pneumococcal vaccine. BALB/c mice were immunized intranasally with PsaA/CTB, PsaA and CTB twice a week for 3 consecutive weeks. IL-17A level in splenocytes two weeks following the last immunization was determined by ELISA. The levels of IL-17A and related cytokine CXCL2, CXCL5 in MEL were also detected after challenge with type 14 SP following immunization. The exprssions of IL-6, defensin β2, CXCL2 mRNA in middle ear mucosa were detected by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsAfter infection, the anti-IL-17-treated mice demonstrated a more severe otitis media compared with the IgG2a-treated mice. Compared with the IgG2a-treated SP-infected mice, the levels of CXCL5, CXCL2 and IL-17A in the anti-IL-17-treated SP-infected mice were significantly lower. IL-17A level in spleen lymphocytes of mice immunized with PsaA/CTB was higher than that with PsaA alone. The higher level of IL-17A and related cytokine CXCL2, CXCL5 in MEL were also detected after challenge with type 14 SP following PsaA/CTB immunization. The IL-6, defensin β2, CXCL2 mRNA expression was also significantly higher in the middle ear mucosa.ConclusionsIL-17A plays an important protective role in mucosal immunity of pneumococcal AOM and provides the experimental basis for the treatment of AOM and the design of a new generation of vaccine and choice of immune strategy. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:318-322,332)

Interleukin-17A; Mucosal immunity; Acute otitis media;Streptococcuspneumoniae

2016-12-27)

(本文編輯 楊美琴)

國家自然科學(xué)基金(81000406，81200736)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 衛(wèi)生部聽覺醫(yī)學(xué)重點實驗室 上海 200031

戴文佳(Email: daiwenjia@126.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.05.003