余婧，鄒頡，付強(qiáng)，郭玉雙，林世鋒，趙杰宏

貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省貴陽市龍灘壩路29號(hào) 550081

多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)

余婧，鄒頡，付強(qiáng)，郭玉雙，林世鋒，趙杰宏

貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省貴陽市龍灘壩路29號(hào) 550081

【目的】采用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在一個(gè)反應(yīng)內(nèi)同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中插入外源基因35S、NOS、NPT II的拷貝數(shù)。【方法】將轉(zhuǎn)基因陽性參照煙草基因組DNA經(jīng)梯度稀釋，通過多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)同時(shí)獲得煙草內(nèi)源參照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT II的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將待測(cè)株系外源基因的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程后估算其拷貝數(shù)?！窘Y(jié)果】獲得了上述4個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其R2均接近于1，相關(guān)性較高。在檢測(cè)的六個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中初篩到3株3個(gè)外源基因均為單拷貝的株系?！窘Y(jié)論】可使用該方法對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草外源基因插入拷貝數(shù)進(jìn)行估算，為獲得穩(wěn)定遺傳材料提供初篩依據(jù)。

轉(zhuǎn)基因煙草；多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR；外源基因；拷貝數(shù)

1983年，第一株轉(zhuǎn)基因煙草問世[1]，煙草作為植物分子生物學(xué)研究的模式植物，30多年來，人們對(duì)煙草的轉(zhuǎn)基因研究從未停歇，包括將煙草自身基因進(jìn)行超量表達(dá)以驗(yàn)證其基因功能[2-4]，外源基因在煙草中表達(dá)后的功能驗(yàn)證[5-7]等，這些研究均需使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)。然而，無論是內(nèi)源基因的過表達(dá)或外源基因的轉(zhuǎn)入和表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物中插入基因的拷貝數(shù)是影響其表達(dá)水平及遺傳穩(wěn)定性的主要因素，外源基因的拷貝數(shù)過多會(huì)導(dǎo)致基因沉默或不能穩(wěn)定表達(dá)。因此，通常應(yīng)篩選出含有拷貝數(shù)為1～2個(gè)，最好是單拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因植株[8-9]。

檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)主要采用Southern blot技術(shù)，該方法穩(wěn)定、可靠，但其價(jià)格昂貴、程序復(fù)雜、耗時(shí)較長、需要大量高純度DNA，靈敏度相對(duì)較低，且對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)條件要求較高[10]。近年來，研究人員開始利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)，該方法經(jīng)PCR反應(yīng)獲得樣品Ct值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)起始模板數(shù)的相關(guān)性方程，將樣品的Ct 值代入該方程便可計(jì)算目的基因的起始模板數(shù)，將其與內(nèi)源參照基因起始模板數(shù)作比較，便可估算出基因組中外源基因的拷貝數(shù)[11]。目前，已有多篇關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因拷貝數(shù)的報(bào)道，但均為單重?zé)晒舛縋CR[12-15]，即內(nèi)源基因及外源基因需分別做二次標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣品內(nèi)、外源靶標(biāo)的檢測(cè)也在不同PCR管內(nèi)進(jìn)行，這對(duì)于定量要求較高的定量PCR而言，易受加樣誤差的影響。多重PCR技術(shù)是在同一PCR管中同時(shí)加入多對(duì)引物，只需1次反應(yīng)便能同時(shí)檢測(cè)2種以上靶標(biāo)序列[16]，該方法已用于動(dòng)物源成分檢測(cè)[17]、轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)[18]、食品中細(xì)菌的檢測(cè)[19]等，而用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)的相關(guān)文獻(xiàn)未見報(bào)道。

本研究建立了一種使用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)的方法，該體系在一次PCR反應(yīng)內(nèi)便完成了以煙草內(nèi)源硝酸還原酶基因NR[20]為內(nèi)參基因、外源基因35S啟動(dòng)子、終止子NOS及卡那霉素抗性標(biāo)記基因NPT II標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及待測(cè)樣品Ct值的檢測(cè)工作，并根據(jù)Ct值及公式測(cè)算了外源基因拷貝數(shù)。由于本研究在1個(gè)反應(yīng)內(nèi)便能獲得上述4個(gè)基因的Ct值，這可消減內(nèi)參基因與目的基因在不同PCR反應(yīng)間產(chǎn)生的加樣誤差。另外，對(duì)3個(gè)外源基因拷貝數(shù)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可排除部分可能發(fā)生基因重排而未穩(wěn)定遺傳的株系。因此，該方法可用于估算轉(zhuǎn)基因煙草外源基因插入拷貝數(shù)，為初篩并獲得穩(wěn)定遺傳材料提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因煙草株系T31為陽性參照株系，其遺傳轉(zhuǎn)化載體由pBI121改造，該載體含有外源基因35S、NOS、NPT II，T31種子經(jīng)卡那霉素抗性測(cè)試已穩(wěn)定遺傳至T6代；A1-A6待測(cè)單株為T5代轉(zhuǎn)基因材料；陰性對(duì)照為貴煙1號(hào)。上述材料于貴州省煙草科學(xué)研究院人工氣候室種植，T31取群體葉片，A1-A6取單株葉片用于DNA提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，用于熒光定量PCR的Premix Ex Taq?（Probe qPCR）購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

ViiA 7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher公司）；離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；C1000 Touch PCR儀（ 美 國BIO-RAD公 司）；ChemiDocXRS凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 定性PCR檢測(cè)

引物序列、反應(yīng)體系及條件參照余婧等[16]，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4.2 煙草基因組DNA提取

采用試劑盒提取煙草基因組DNA用于熒光定量PCR測(cè)試，提取方法參照試劑盒使用說明書。待測(cè)樣品DNA經(jīng)NanoDrop 2000測(cè)定濃度及純度后統(tǒng)一用ddH2O稀釋至100 ng/μL，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的T31 DNA測(cè)定濃度后備用。本研究中所提取DNA的OD260/OD280比值均在1.80～1.90之間。

1.4.3 Southern印跡雜交

陽性參照株系T31外源基因35S啟動(dòng)子Southern印跡雜交參照J(rèn).薩姆布魯克等[21]，基因組DNA經(jīng)EcoRI、HindIII、NdeI、TaqI四組酶酶切。待測(cè)株系基因組DNA經(jīng)HindIII酶切，對(duì)外源基因NPT II進(jìn)行Southern印跡雜交。

1.4.4 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

用ddH2O按2倍濃度梯度稀釋T31的基因組DNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置5個(gè)點(diǎn)，3次重復(fù)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 多重定量 PCR反應(yīng)體系及條件

20μL PCR反應(yīng)體系（4個(gè)靶標(biāo)的引物及探針均加入同一PCR管中）：Premix Ex Taq 10μL，探針10 μM，上下游引物各 10 μM，50×ROX Dye II 0.4 μL，DNA 2 μL；PCR反 應(yīng)條 件：95℃ 30s；95℃5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)。引物及探針見表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 多重定量PCR引物、探針序列Tab.1 Multiplex real-time PCR primer and probe sequence

1.4.6 轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)估算

定量PCR結(jié)束后，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品Ct值，根據(jù)NR及35S、NOS、NPT II的Ct值并依據(jù)公式X0/R0=10[(Ct,X-IX)/SX]-[(Ct,R-IR)/SR]（其中Ct,X為外源基因的 Ct 值，IX 為外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，SX為外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；Ct,R為內(nèi)參基因的Ct值，IR為內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，SR為內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率），拷貝數(shù)即根據(jù)X0/R0的平均值進(jìn)行估算[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因陽性植株定性PCR檢測(cè)

為確保參試樣品為轉(zhuǎn)基因陽性，提取待測(cè)植株葉片DNA為模板進(jìn)行多重定性PCR擴(kuò)增目的基因35S、NOS、NPT II。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（圖1），A1-A6號(hào)樣品均帶有目的基因35S（345bp）、NOS（199bp）、NPT II（490bp）特異性擴(kuò)增片段，初步確定6個(gè)單株均為轉(zhuǎn)基因陽性單株，另外，內(nèi)源參照基因NR（137bp）擴(kuò)增條帶單一，特異性好，表明DNA提取質(zhì)量附合PCR檢測(cè)要求。

圖1 多重PCR定性檢測(cè)電泳結(jié)果Fig.1 Results of multiplex qualitative PCR detection

2.2 陽性參照株系35S Southern印跡拷貝數(shù)檢測(cè)

為避免2個(gè)拷貝所在片段大小相同的巧合，分別采用EcoR I、HindIII、NdeI、TaqI四組酶對(duì)陽性參照株系T31基因組DNA進(jìn)行酶切。插入基因35S經(jīng)四組酶切的Southern結(jié)果均有雜交目的條帶（圖2），這表明35S已被整合到T31陽性參照株系基因組中，且為單拷貝插入。

圖2 陽性參照株系T31 35S啟動(dòng)子插入拷貝數(shù)Southern檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Southern detection results for 35S promoter insertion copy number of the positive reference plants T31

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及待測(cè)樣品Ct值

T31基因組DNA測(cè)定濃度后直接用ddH2O 2倍稀釋后制作3組重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（本研究T31 DNA初始濃度為170 ng/μL），以模板起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)為X軸，以Ct值為Y軸，在一次PCR反應(yīng)中同時(shí)獲得到了內(nèi)源參照基因NR及外源基因35S、NOS、NPT II的擴(kuò)增曲線（圖3）及標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），四條標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率在99.565%～102.748之間，相關(guān)系數(shù)R2在0.997～0.999之間，相關(guān)性較好，可用于目的基因拷貝數(shù)的檢測(cè)。在待測(cè)樣品Ct值的測(cè)試中，4個(gè)基因Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.02～0.17之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.10%～0.84%之間，說明Ct值重復(fù)性良好，陽性參照株系、對(duì)照株系及各待測(cè)單株Ct值見表2。

圖3 多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增曲線Fig.3 Multiplex real-time PCR amplification curve

圖4 多重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Multiplex real-time PCR standard curve

表2 各株系擴(kuò)增靶標(biāo)Ct值Tab.2 Ct value of target gene

2.4 待測(cè)株系外源基因插入拷貝數(shù)的估算

以陽性株系T31外源基因35S的Southern檢測(cè)結(jié)果及符合高世代穩(wěn)定遺傳的標(biāo)準(zhǔn)為參照，以T31的35S、NOS、NPT II插入拷貝數(shù)均為1來比較、估算待測(cè)基因拷貝數(shù)。按1.4.6中公式X0/R0=10[(Ct,X-IX)/SX]-[(Ct,R-IR)/SR]估算外源基因拷貝數(shù)，實(shí)驗(yàn)中，以A3樣品為例，跟據(jù)內(nèi)源基因NR及外源基因35S、NOS、NPT II的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），將A3樣品Ct值（表2）代入公式計(jì)算三個(gè)外源基因 的 拷 貝 數(shù)：35S0=10[(21.11-28.72)/-3.332]-[(20.42-26.954)/-3.258]，NOS0=10[(19.14-27.226)/-3.283]-[(20.42-26.954)/-3.258]，NPT II0=10[(21.45-29.106)/-3.315]-[(20.42-26.954)/-3.258]計(jì)算出35S0=1.9，NOS0=2.9，NPT II0=2.0，即A3樣品35S、NOS、NPT II插入拷貝數(shù)的估算值分別為1.9、2.9、2.0。在對(duì)待測(cè)樣品A1-A6各外源基因拷貝數(shù)的估算中（表3），A1、A3二個(gè)單株部分外源基因插入拷貝數(shù)為2～3個(gè)拷貝，這表明A1、A3為外源基因多拷貝插入，而A4拷貝數(shù)估算值不到1，這可能由于外源基因發(fā)生了重排、丟失，為不穩(wěn)定遺傳[25]。A2、A5、A6三個(gè)單株三個(gè)外源基因插入拷貝數(shù)估算值均1，為單拷貝。

表3 外源基因插入拷貝數(shù)估算Tab.3 Estimation of exogenous gene insertion copy number

2.5 待測(cè)株系NPT II Southern印跡雜交拷貝數(shù)檢測(cè)

為了驗(yàn)證經(jīng)多重?zé)晒舛縋CR所估算的外源基因插入拷貝數(shù)與Southern雜交的結(jié)果是否一致，對(duì)各株系的外源基因NPI II進(jìn)行了Southern印跡檢測(cè)，結(jié)果表明（圖5），株系A(chǔ)2、A4、A5、A6中NPT II基因的Southern印跡檢測(cè)拷貝數(shù)為1個(gè)，其中A4在定量PCR中估算值不足1個(gè)拷貝，A4可能為雜合株，并未穩(wěn)定遺傳。而株系A(chǔ)1、A3中NPT II基因的Southern印跡檢測(cè)拷貝數(shù)為2個(gè)，這與定量PCR中所估算的NPT II基因的插入拷貝數(shù)一致。

圖5 待測(cè)株系NPT II插入拷貝數(shù)Southern檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Southern detection of NPT II insertion copy number

3 討論

本研究建立了一種多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該方法通過一次PCR反應(yīng)便可同時(shí)獲得煙草內(nèi)源參照基因NR，外源基因35S、NOS、NPT II的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品Ct值計(jì)算出待測(cè)樣品外源基因拷貝數(shù)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[26]，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)，其陽性參照植株必須是純度為100%的轉(zhuǎn)基因植物樣品，本研究選取了本實(shí)驗(yàn)室高世代穩(wěn)定遺傳材料T31作為轉(zhuǎn)基因陽性參照株系，在Southern測(cè)試中，T31外源基因35S的插入拷貝數(shù)為1，因此，實(shí)驗(yàn)以T31的35S、NOS、NPT II插入拷貝數(shù)均為1來比較、估算出待測(cè)樣品3個(gè)外源基因的拷貝數(shù)。蘇慧慧等[12]指出轉(zhuǎn)基因植物中同一單株不同外源基因拷貝數(shù)不一致，這可能是發(fā)生了基因重排或缺失，因此，我們的多重?zé)晒舛縋CR特意對(duì)3種外源基因的拷貝數(shù)同時(shí)進(jìn)行估算，能有效排除因外源基因的重排或缺失而造成植株遺傳不穩(wěn)定的可能性。值得提出的是，我們后期特意對(duì)A1-A6后代種子萌發(fā)進(jìn)行卡那霉素抗性測(cè)試，單拷貝單株A2、A5、A6萌發(fā)率為100%，而A1、A3、A4均為80%左右，這表明該3個(gè)株系可能由于外源基因多拷貝插入或重排、缺失，并未穩(wěn)定遺傳，這與我們估算的外源基因是否為單拷貝結(jié)果一致。因此，本方法可用于轉(zhuǎn)基因煙草外源基因插入拷貝數(shù)的估算，為初篩并獲得穩(wěn)定遺傳材料提供技術(shù)支撐。

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Detecting copy number of exogenous genes in transgenic tobacco by multiplex RT-PCR

YU Jing, ZOU Jie, FU Qiang, GUO Yushuang, LIN Shifeng, ZHAO Jiehong*
Guizhou Academy of Tobacco Science, Key Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation,Guiyang 550081, China

This paper utilized a multiplex real-time PCR assay to simultaneously detect copy number of inserted exogenous gene 35S,NOS and NPT II in transgenic tobacco within one reaction.Gradient dilution was applied to positive reference tobacco genome DNA,and multiplex real-time PCR assay was used to obtain standard curve equation of tobacco endogenuous reference gene NR and exogenous gene 35S, NOS, as well as NPT II.Copy number of exogenous genes was estimated after substituting the Ct values of both endogenuous and exogenous genes of the strains to be tested into the standard curve equation.Results showed that standard curves of the 4 genes were obtained, and all R2 values were close to 1 with relatively high correlation.In the tested 6 transgenic strains, preliminarily screened 3 strains with their 3 exogenous genes were all single copy.This method can be used for the estimation of copy number of inserted exogenous genes in transgenic tobacco, so as to provide preliminary screen basis for obtaining stable genetic materials.

transgenic tobacco; multiplex RT-PCR; exogenous genes; copy number

余婧，鄒頡，付強(qiáng)，等.多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù)[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2017, 23（4）

中國煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目（201604）；貴州省科技支撐計(jì)劃農(nóng)業(yè)攻關(guān)科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合NY[2013]3020號(hào)）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合J字[2014]2117號(hào)）

余 婧（1983—），碩士，助理研究員，主要從事煙草分子生物學(xué)研究工作， Email：yujingbio@126.com

趙杰宏（1978—），博士，研究員，主要從事煙草分子生物學(xué)研究工作，Email： zhaojiehong@126.com

2017-03-02；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-06-02

：YU Jing, ZOU Jie, FU Qiang, et al.Detecting copy number of exogenous genes in transgenic tobacco by multiplex RT-PCR [J].Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(4)

*Corresponding author.Email：zhaojiehong@126.com