孟蘭，丁西平，胡群力，殷實(shí)，沈干,2，胡世蓮

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所；3.腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

·基礎(chǔ)研究·

5-氮雜-2-脫氧胞苷通過上調(diào)MGMT表達(dá)增加5-氟尿嘧啶聯(lián)合紫杉醇的化療敏感性

孟蘭1,2,3，丁西平1，胡群力1，殷實(shí)1，沈干1,2，胡世蓮1,2,3

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所；3.腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的研究5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-dC)與傳統(tǒng)化療藥物5-氟尿嘧啶聯(lián)合紫杉醇(5-FU+PTX)對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，探討5-Aza-dC抗腫瘤的機(jī)制。方法培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株MKN-45，分為對(duì)照組、5-Aza-dC組、5-FU+PTX組和5-Aza-dC+5-FU+PTX組，利用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖和凋亡情況，利用RT-PCR和Western blot方法分別檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞的MGMT基因mRNA與蛋白表達(dá)，及凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)。結(jié)果5-Aza-dC及5-FU聯(lián)合紫杉醇均可抑制MKN-45細(xì)胞的生長(zhǎng)，48 h細(xì)胞存活率分別為(71.60±5.77,57.00±6.09)%，與5-FU+PTX組比較，三藥聯(lián)合使用后效果更明顯(42.85±2.29)%,P=0.02；5-Aza-dC及5-FU聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞凋亡率[(7.33±0.34)%,(13.06±1.67)%]及凋亡蛋白cleaved caspase-3水平[(43.00±4.00)%,(45.67±4.50)%]均增加，三藥聯(lián)合用藥組凋亡率[(17.31±1.05)%]和cleaved caspase-3水平[(174.67±6.50)%]的表達(dá)更高。與對(duì)照組抑癌基因MGMT mRNA和蛋白表達(dá)量[(23.10±2.15)%、(10.47±1.39)%]比較，5-Aza-dC單獨(dú)處理的MKN-45細(xì)胞MGMT基因mRNA(56±5.57)%及蛋白表達(dá)水平(20.33±5.50)%均升高，三藥聯(lián)合用藥組MGMT升高程度更加明顯[(75.67±6.50)%,(174.67±6.50)%],P<0.001，而5-FU聯(lián)合紫杉醇組未發(fā)現(xiàn)明顯變化。結(jié)論5-Aza-dC可以有效抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，它與化療藥物5-FU和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用時(shí)抗腫瘤效應(yīng)更加明顯。

胃腫瘤；氟尿嘧啶；紫杉烷類；脫氧胞苷核苷酸類；藥物相互作用

胃癌死亡率占全世界癌癥死亡常見原因的第2位[1]。我國是胃癌高發(fā)國家，每年死于胃癌者約占全部腫瘤死亡者的1/5，盡管在過去的幾年中，胃癌的治療效果有了改善，但隨著腫瘤多重耐藥的發(fā)生(MDR)，胃癌患者對(duì)常規(guī)的化療藥物不再敏感，5年生存率低于20%，尋求更多新型并且行之有效的治療手段已成為亟需解決的問題。表觀遺傳學(xué)研究表明，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTS)可調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默，喪失其抗腫瘤的作用[2]，5-Aza-dC作為研究最多的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，已有多個(gè)研究證實(shí)5-Aza-dC可通過去甲基化干預(yù)從分子水平抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3]，其機(jī)制與恢復(fù)某些抑癌基因如MMR、RUNX3、CHFR等的表達(dá)密切相關(guān)[4-6]。隨著基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究的不斷深入，5-Aza-dC (DAC)已經(jīng)通過了食品和藥品管理局(FDA)的認(rèn)證，用于治療造血系統(tǒng)的惡性疾病，但5-Aza-dC對(duì)實(shí)體腫瘤及其與傳統(tǒng)化療藥物之間的關(guān)系，目前尚處于初級(jí)探索階段。因此，本研究期望檢測(cè)5-Aza-dC與傳統(tǒng)化療方案5-氟尿嘧啶(5-Fu)和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，藥物之間的相互作用，為未來胃癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

1.1.1 細(xì)胞株、培養(yǎng)基及藥物 人胃癌細(xì)胞株MKN-45細(xì)胞購自北京腫瘤研究所，胎牛血清和培養(yǎng)液(RPMI1640)購于Gibco公司，胰蛋白酶、5-氟尿嘧啶和紫杉醇分別購自上海碧云天、上海旭東海普及北京華素藥業(yè)有限公司，5-Aza-dC購于Sigma公司。

1.1.2 細(xì)胞增殖及凋亡試劑 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒(CCK-8)購自上海同仁化學(xué)有限公司，Annexin-V、PI染料購于Sigma公司。

1.1.3 總RNA的提取、RT-PCR及核酸電泳試劑 Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，OligdT18、dNTPmix (10mM)和Taq DNA聚合酶購于上海生工生物工程有限公司。β-actin上游引物：5’-TGTGATGGTGGGTATGGGTCA-3’，下游引物：5’-TTAATGTCACGCACGATTTCC-3’；MGMT上游引物：5’-TGAATGCCTATTTCCACC-3’，下游引物：5’-CTTCCATAACACCTGTCT-3’，均由上海生工生物工程有限公司合成。瓊脂糖、6×上樣緩沖液、溴化乙錠(EB)和100 bp DNA ladder分別購自Spanish公司、大連寶生物工程有限公司、Amresco公司和Fermentas公司。

1.1.4 總蛋白的提取及蛋白質(zhì)免疫印跡電泳檢測(cè)試劑 彩色預(yù)染分子量Marker和Western-blot/PI裂解液均購于碧云天公司，山羊抗鼠、山羊抗兔二抗抗體、anti-MGMT 抗體及anti-β-actin抗體均購于Santa Cruz公司，anti-cleaved caspase-3抗體購自Cell signaling公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物的配制、細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 將5-Aza-dC用DMSO溶解成1mg/mL的貯存液，分別與5-FU聯(lián)合紫杉醇稀釋后處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組[7]：(1)對(duì)照組(1640培養(yǎng)基)；(2)5-Aza-dC組(10 μM)，培養(yǎng)72 h；(3)5-FU(15 mg/L)+PTX(0.1 μM)組，培養(yǎng)24 h；(4)5-Aza-dC(10 μM)+5-FU(15 mg/L)+PTX(0.1 μM)組，5-Aza-dC 處理48 h后給予5-FU和PTX繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別收集細(xì)胞和提取mRNA和蛋白。1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為1×104/mL，接種于96孔板，200 μL/孔，實(shí)驗(yàn)為4組：(1)對(duì)照組(1640培養(yǎng)基)；(2)5-Aza-dC組(10 μM)；(3)5-FU(15 mg/L)+PTX(0.1 μM)；(4)5-Aza-dC(10 μM)+ 5-FU(15 mg/L)+PTX(0.1 μM)，設(shè)置3個(gè)不同的濃度梯度，培養(yǎng)72 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于24 h、48 h及 72 h時(shí)間點(diǎn)各取1板，每孔加入10 μL的CCK-8反應(yīng)試劑，孵育1 h，測(cè)定OD450，計(jì)算各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)，IR(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白孔A值)/(對(duì)照組A值-空白孔A值)×100% 。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為1×104/mL，接種于6孔板，3 mL/孔，實(shí)驗(yàn)分組同前，共培養(yǎng)48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化，收集細(xì)胞，并使用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次(1500 r/min,離心5 min)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，使用200 μL的Binding buffer重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)管，每管加入5 μL的Annexin V，室溫避光孵育30 min，每管加入5μL 10 mg/mL的PI，室溫，避光，孵育10 min，使用BD FACSCantoTMⅡFlow Cytometer流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Winmdi2.8軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.4 RT-PCR反應(yīng) 使用TRIzol試劑盒提取總RNA，之后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，2 μg的總RNA，20 μL反應(yīng)體系。以cDNA作為模版，按如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃，3 min；(95 ℃,30 s;56 ℃,30 s;72℃,30 s)，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，72 ℃，延伸10 min，產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，用UVI凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照、Quantity One軟件分析圖像。

1.2.5 Western-blot MKN-45細(xì)胞分組同凋亡實(shí)驗(yàn)，共處理6 h，收集各組細(xì)胞按Western-blot/PI裂解液方法提取蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣量為4 μg，用10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗(1∶1000稀釋),4 ℃孵育，過夜，TBST漂洗PVDF 膜7 min ×5 次，加入二抗稀釋液(1∶2000) 37 ℃孵育1 h，TBST漂洗PVDF膜7 min×5次。加入辣根過氧化物酶，HRP-ECL發(fā)光法曝光，使用Image J凝膠圖像處理系統(tǒng)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-dC聯(lián)合5-FU+PTX對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖的影響 5-Aza-dC、5-FU+PTX單獨(dú)或聯(lián)合處理MKN-45細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，細(xì)胞增殖均受到抑制；與單獨(dú)用藥比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞更明顯(P<0.05)；5-Aza-dC與5-FU+PTX對(duì)MKN-45細(xì)胞的抑制作用存在時(shí)間-劑量依賴性，5-Aza-dC、5-FU和紫杉醇聯(lián)合(50 μM 5-Aza-dC +75mg/L 5-FU+0.5μM PTX)處理72 h，細(xì)胞存活率最低，為(20.95±5.86)%。處理48 h后，與對(duì)照組比較，用藥組均可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(5-Aza-dC組P=0.01，5-FU+PTX組P=0.01)，與5-FU+PTX組比較，三藥聯(lián)合用藥組細(xì)胞抑制作用更明顯(P=0.02)，稍高濃度用藥組對(duì)MKN-45細(xì)胞的抑制更明顯(P=0.03)，最高濃度用藥組細(xì)胞存活率為(20.95±5.86)%，抑制程度最明顯(P=0.04)。見表1。

2.2 5-Aza-dC聯(lián)合5-FU+PTX對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45凋亡的影響 使用5-Aza-dC及5-FU+PTX處理48 h后，MKN-45細(xì)胞凋亡率分別為 (7.33±0.34)%和(13.06±1.67)%，三藥聯(lián)合處理組MKN-45細(xì)胞凋亡率(17.31±1.05)%，上述各組與對(duì)照組(1.43±0.16)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。Western blot 方法檢測(cè)的細(xì)胞的cleaved caspase-3的表達(dá)，以β-actin 的灰度值為參照，5-Aza-dC組為(43±4)%，5-FU+PTX組(45.67±4.50)%，5-Aza-dC +5-FU+PTX組(174.67±6.50)%，與對(duì)照組(23.33±1.53)%比較，用藥組cleaved caspase-3的表達(dá)升高，且三藥聯(lián)合處理組升高更加明顯(P<0.05，圖2)。與對(duì)照組比較，兩組藥物均可促進(jìn)胃癌MKN-45細(xì)胞的凋亡，并且三藥聯(lián)合時(shí)凋亡率遠(yuǎn)高于其他處理組，見表2。

2.3 5-Aza-dC 聯(lián)合5-FU和PTX對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45 MGMT基因表達(dá)的影響 利用5-Aza-dC、5-FU+PTX單獨(dú)或聯(lián)合處理MKN-45細(xì)胞后，檢測(cè)抑癌基因MGMT mRNA和蛋白表達(dá)，以β-actin 的灰度值為參照，各組表達(dá)水平分別為，5-Aza-dC組(56.00±5.57) %、5-FU+PTX組(25.00±2.00) %、5-Aza-dC+5-FU+PTX組(75.67±6.50) %和5-Aza-dC組(20.33±5.50) %、5-FU+PTX組(14.00±2.00) %、5-Aza-dC+5-FU+PTX組(174.67±6.50) %，與對(duì)照組(23.10±2.15) %及 (10.47±1.39) %比較，5-Aza-dC組抑癌基因MGMT mRNA和蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，而5-FU+PTX組沒有明顯變化，當(dāng)聯(lián)合5-Aza-dC之后，MGMT表達(dá)明顯升高(P<0.05，圖3，表3)。

表1 5-Aza-dC聯(lián)合5-FU+PTX對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖的影響

注：5-Aza-dC及5-FU+ PTX分別設(shè)置三個(gè)濃度梯度為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,分別是2、10、50 μmol/L，3、15、75 mg/L和0.02、0.1、0.5 μmol/L，時(shí)間依賴性分別選擇中間濃度即10 μmol/L、15 mg/L和0.1 μmol/L

圖1 5-Aza-dC 單獨(dú)或聯(lián)合5-FU和PTX對(duì)胃癌MKN-45凋亡的流式細(xì)胞圖

1：空白對(duì)照組；2：5-Aza-dC組；3：5-FU+PTX組；4：5-Aza-dC+5FU+PTX組;Apoptosis=early apoptotic +late apoptotic

圖2 5-Aza-dC 單獨(dú)或聯(lián)合5-FU和PTX增加胃癌MKN-45細(xì)胞調(diào)亡蛋白cleaved caspase-3的蛋白質(zhì)印跡圖

注：用藥組細(xì)胞的凋亡情況與對(duì)照組比較明顯升高，均為P<0.001;與5-FU+PTX組比較，三藥聯(lián)合時(shí)MKN-45細(xì)胞的凋亡及cleaved caspase-3的表達(dá)最高(P<0.001，P=0.030)

3 討論

5-Fu聯(lián)合紫杉醇是近年來治療胃癌較為有效的化療方案。5-FU抗腫瘤主要通過三重酶活化反應(yīng)完成，其中起重要作用的TP酶因在實(shí)體瘤中表達(dá)高于正常組織，尤其是對(duì)于化療不敏感的乏氧區(qū)活性更高，所以5-FU具有獨(dú)特的抗腫瘤作用以及對(duì)正常組織毒性較小的高選擇性[8]；紫杉醇是一種抗微管藥物，通過促使細(xì)胞中微管穩(wěn)定和聚合，致使細(xì)胞有絲分裂受阻，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，由于兩種藥物作用機(jī)制不同，故毒性互不交叉[9]，并且Sasagawa等[10]在動(dòng)物模型中證實(shí)，5-FU的前體卡培他濱和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤作用高于兩藥單獨(dú)使用。然而在臨床應(yīng)用中，5-氟尿嘧啶和紫杉醇也常常治療失敗，其中化療后DNA損傷(DNA damage)導(dǎo)致的腫瘤耐藥為主要原因[11]。MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)是人類目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種DNA修復(fù)酶，能夠修復(fù)烷化劑造成的烷化損傷，廣泛存在于機(jī)體各種正常組織細(xì)胞中，防止細(xì)胞癌變和死亡，其表達(dá)缺失或突變與許多惡性腫瘤有關(guān)[12]，并且與腫瘤耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)[13]。5-氮雜-2-脫氧胞苷作為甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可以通過去甲基化作用使多種沉默的抑癌基因再表達(dá)，如RUNX3、CHFR等[14]，發(fā)揮其抗腫瘤作用，而5-Aza-dC聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物的臨床療效及作用機(jī)制還有待評(píng)估[15]。基于化療耐藥的產(chǎn)生主要由DNA損傷反應(yīng)引起，本研究選擇5-Aza-dC 聯(lián)合傳統(tǒng)化療方案5-FU和紫杉醇干預(yù)胃癌細(xì)胞MKN-45，檢測(cè)MGMT基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC單獨(dú)應(yīng)用能提高M(jìn)GMT mRNA和蛋白的表達(dá)，聯(lián)合5-FU及PTX后MGMT mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高更加明顯；CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了5-Aza-dC聯(lián)合5-FU和紫杉醇均可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，三藥聯(lián)合后效果更明顯，而cleaved caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的效應(yīng)蛋白，Western blot結(jié)果也提示5-Aza-dC可以提高化療方案5-FU聯(lián)合紫杉醇促胃癌細(xì)胞凋亡的作用。

1：空白對(duì)照組；2：5-Aza-dC組；3：5-FU+PTX組；4：5-Aza-dC+5-FU+PTX組

圖3 5-Aza-dC 單獨(dú)或聯(lián)合5-FU和PTX對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞MGMT表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡圖

注：與對(duì)照組比較，5-Aza-dC組MKN-45細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)較高(P=0.010，P=0.040);與5-FU+PTX用藥比較，三藥聯(lián)合時(shí)MKN-45細(xì)胞的mRNA和蛋白的表達(dá)最高 (P<0.001，P<0.001)

綜上所述，一方面，5-Aza-dC可以通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用；另一方面，在5-Aza-dC聯(lián)合5-FU和紫杉醇應(yīng)用時(shí)，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，為胃癌臨床治療新方案的開辟提供了新思路。

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5-Aza-2′-deoxycitydineenhancestheanti-tumoreffectof5-FUcombinedpaclitaxelagainstgastriccancerthroughup-regulation

MGMTMengLan*,DingXiping,HuQunli,YinShi,ShenGan,HuShilian

(*AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)Correspondingauthor:HuShilian,Email:hushilian@126.com

ObjectiveTo explore the potential effects of 5-Aza-2′-deoxycitydine (5-Aza-dC),5-FU combined Paclitaxel (PTX) for the treatment of patients with gastric cancer and its mechanism.MethodsThe inhibitory effects of 5-Aza-dC and/or 5-FU combined PTX on MKN-45 cell proliferation were assayed by using CCK-8 kit.The apoptosis of MKN-45 cell was determined by Annexin V-FITC/PI staining method.MGMT mRNA invitrowas determined by RT-PCR,and the cleaved caspase-3 and MGMT protein expression were detected by western blotting.ResultsThe cell growth of human gastric carcinoma cell line MKN-45 was significantly inhibited by 5-Aza-dC(71.60±5.77 )% or 5-FU combined PTX (57.00±6.09)%,the combination of 5-Aza-dC and 5-FU+PTX(42.85±2.29)% resulted in a better inhibition.Compared with the control group,5-Aza-dC and 5-FU combined PTX group induced the apoptosis of MKN-45 cells[(7.33±0.34)%,(13.06±1.67)%],with the apoptotic rate significantly higher in the combination group than that in single drug treatment group(17.31±1.05)%，as well as indicated in cleaved caspase-3 protein expression.Exposure of MKN-45cell to 5-Aza-dC alone resulted in a significant increase in the expression levels of MGMT mRNA and protein[(56.00±5.57)%,(20.33±5.50)%],and the effects were consequently more pronounced in the combined group[(75.67±6.50)%,(174.67±6.50)%],P<0.001.Conclusion5-Aza-dC can inhibit cell proliferation and induce apoptosis in human gastric carcinoma.Moreover,5-Aza-dC combined with 5-FU and PTX is more efficient than either 5-Aza-dC or 5-FU combined PTX alone.

Stomach neoplasms；Fluorouracil；Taxoids;Deoxycytosine nucleotides；Drug interactions

R735.2

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.05.028

2017-07-01)

國家自然科學(xué)基金(8107180)；腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室績(jī)效項(xiàng)目(1606c08236)；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(1501041142)

孟蘭,醫(yī)師，Email:menglan871121@126.com

胡世蓮，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email:hushilian@126.com