熊 博，嚴巧巧，孫國超，邱 霞，葉 霜，廖 玲，羅近予，代 琳，汪志輝，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.四川工程職業(yè)技術(shù)學院，四川 德陽 618000)

不同黃化程度對雜柑幼苗生長及光合作用的影響

熊 博1，嚴巧巧2，孫國超1，邱 霞1，葉 霜1，廖 玲1，羅近予1，代 琳1，汪志輝1，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.四川工程職業(yè)技術(shù)學院，四川 德陽 618000)

為了研究不同黃化程度對柑橘幼苗生長及光合作用的影響，以黃果柑、不知火幼苗為材料，分析黃化苗、花葉苗和綠葉苗的生長量、葉綠素含量、光合及葉綠素熒光參數(shù)的變化。結(jié)果表明，葉片黃化抑制了幼苗的正常生長，黃化苗的生長量顯著低于綠葉苗；黃化苗葉片中游離脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白質(zhì)(SP)含量均顯著增加；葉片黃化顯著降低了葉片葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、類胡蘿卜素(Car)含量和光合作用氣體交換參數(shù)(氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率)，改變了葉綠素的組成比例。黃化苗的PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、光化學猝滅系數(shù)(qP)和非光化學猝滅系數(shù)(NPQ)顯著低于綠葉苗，導致凈光合速率(Pn)顯著降低，但花葉苗Fv/Fm下降程度較小。研究表明，葉片黃化抑制了黃果柑、不知火幼苗的正常生長，降低了光合能力。

黃果柑；不知火；黃化；幼苗；光合作用

黃化(etiolation)是指多數(shù)植物在黑暗中生長時呈現(xiàn)黃色的現(xiàn)象，在被子植物中廣泛存在。植物形態(tài)、生長量的變化是黃化對植物傷害的最終反映，葉片黃化導致葉面積減小，從而造成植株矮化[1]、生長勢減弱，甚至死亡[2]。

目前，國內(nèi)外學者的研究重點大多集中在黃化與植物營養(yǎng)關(guān)系上。鐵營養(yǎng)缺乏易誘發(fā)葉片失綠癥，導致芒果葉片黃化[3]。羅維鋼等[4]研究表明，宿根蔗黃化苗根系活力微弱、礦質(zhì)元素含量不足、營養(yǎng)貧乏，不能從土壤吸收礦質(zhì)元素。唐仕云等[5]發(fā)現(xiàn)，葉片噴施硫酸亞鐵能使蔗株黃白苗轉(zhuǎn)綠。龍光霞等[6]研究發(fā)現(xiàn)，強酸性土壤中鋁和錳過多，是誘發(fā)甘蔗幼苗失綠的主要原因，而陳桂芬等[7]對黃化蔗地土壤和植株的礦質(zhì)元素進行分析，認為植株體內(nèi)鐵、錳營養(yǎng)不平衡可能是導致宿根甘蔗幼苗黃化的主要原因。同時，水稻[8]、小麥[9]、玉米[10]、甘藍[11-12]等作物葉片黃化對光合作用影響的研究相對較多。然而，不同黃化程度對柑橘幼苗生長和光合作用影響的報道還較少。

針對相同條件下黃果柑、不知火種子萌芽后存在葉片完全黃化(黃化苗)、不完全黃化(花葉苗)和正常(綠葉苗)植株，且發(fā)芽后20 d葉片仍不轉(zhuǎn)綠、30 d后黃化苗和花葉苗逐漸萎蔫的現(xiàn)象，通過對比分析黃化苗、花葉苗和綠葉苗生長及葉片光合作用等相關(guān)指標，探討不同黃化程度對柑橘幼苗生長及光合作用的影響，為柑橘實生苗的正常生長和幼苗黃化現(xiàn)象的分子機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將黃果柑、不知火種子置于石英砂中進行發(fā)芽(29 ℃)，發(fā)芽后幼苗放入人工氣候箱中，培養(yǎng)條件為光照強度800 μmol·m-2·s-1，光周期12 h∶12 h(L/D)，光照時溫度(25±1)℃，夜間溫度(20±1)℃，空氣相對濕度50%～60%。

于萌芽后20 d，選取黃果柑和不知火黃化苗、花葉苗和綠葉苗為試驗材料，對幼苗生長指標及光合作用參數(shù)進行測定，并對葉片進行采樣，立即用液氮處理，保存于超低溫冰箱中(-80 ℃)備用。

1.2 生長量及葉綠素含量的測定

生物量測定：分別把待測新鮮植株地上部和地下部置于105 ℃的烘箱中殺青30 min，然后80 ℃烘干，精確稱取質(zhì)量；根長和株高用游標卡尺進行測量；葉綠素含量的測定采用Moran等[13]的方法。重復3次，取平均值。

1.3游離脯氨酸、丙二醛、可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)含量測定

脯氨酸(Pro)的測定采用Delauney等[14]的方法；丙二醛(MDA)含量的測定采用Hodges等[15]的方法；可溶性糖(SS)、可溶性蛋白質(zhì)(SP)含量分別采用硫酸-蒽酮比色法、考馬斯亮藍G-250染色法[16]。

1.4 光合參數(shù)及葉綠素熒光特性的測定

于晴天9:30—13:00，選取自植株基部算起第3片完全展開葉片并避開主脈，用便攜式光合儀(Li-6400)測定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)、胞間 CO2濃度(Ci)等指標及光合有效輻射(PAR)等光合參數(shù)。設定參數(shù)為：光照強度800 μmol·m-2·s-1，CO2濃度400 μmol·mol-1，溫度25 ℃。

葉綠素熒光特性測定：于9:30—13:00，選取自植株基部算起第3片完全展開功能葉并避開主脈，采用便攜式光合儀(Li-6400)，CO2濃度400 μmol·mol-1，測定葉片葉綠素熒光參數(shù)[17]。先測定光下最大熒光(Fm’)和最小熒光(Fo’)，然后將葉片暗適應 30 min，測定初始熒光(Fo)、穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)和最大熒光(Fm)。通過以上測定的葉綠素熒光參數(shù)計算出光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光化學效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm、光化學猝滅系數(shù)(qP)=(Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’)和非光化學猝滅系數(shù)(NPQ)=(Fm-Fm’)/Fm’[18]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 20 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃化對黃果柑和不知火生長的影響

由表1可見，葉片黃化導致黃果柑與不知火幼苗單株干質(zhì)量、地上和地下部干質(zhì)量、根長及株高均顯著低于綠葉苗，B-E、B-M、H-E、H-M幼苗干質(zhì)量分別降低了21.8%、15.8%、32.1%和23.9%，說明葉片黃化在一定程度上阻礙了黃果柑、不知火幼苗的正常生長。葉片黃化對不知火、黃果柑幼苗根長和株高的影響存在較大差異，不同黃化程度的不知火幼苗株高均大于黃果柑，但幼苗根長小于黃果柑。

2.2黃化對黃果柑和不知火葉片游離脯氨酸、丙二醛、可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由表2可知，隨著黃化程度的加深，黃果柑、不知火葉片中游離脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白質(zhì)(SP)含量均顯著增加。不知火黃化苗和花葉苗中MDA含量分別為綠葉苗的1.87、1.52倍，而黃果柑黃化苗、花葉苗中MDA含量分別為綠葉苗的1.79、1.40倍，表明黃化導致葉片脂質(zhì)過氧化作用。

2.3黃化對黃果柑和不知火光合色素含量的影響

由表3可見，黃果柑、不知火葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、類胡蘿卜素(Car)含量及光系統(tǒng)反應中心色素的組成比例均隨葉片黃化而顯著降低(P<0.05)；表現(xiàn)黃化苗和花葉苗Chl a、Chl b和Car含量差異不顯著，均顯著低于綠葉苗(P<0.05)。表明葉片黃化導致葉綠體受到一定程度損傷，影響了光合色素的合成或?qū)е鹿夂仙亟到狻?/p>

表1黃化對黃果柑和不知火生長的影響

Table1Effect of etiolation on growth ofCitruscultivars of Huangguogan and Shiranuhi

幼苗Seedlings單株干質(zhì)量Dryweight/g地上部干質(zhì)量Dryweightofaboveground/g地下部干質(zhì)量Dryweightofunderground/g根長Rootlength/cm株高Plantheight/cm根冠比RootshootratioB-E0.79±0.006c0.25±0.011b0.54±0.005c17.15±0.58c5.25±0.06b0.46±0.06aB-M0.85±0.017b0.26±0.011b0.59±0.005b17.65±0.58bc5.23±0.07b0.44±0.05aB-G1.01±0.017a0.32±0.014a0.69±0.011a19.50±0.63ab6.20±0.09a0.46±0.06aH-E0.74±0.005c0.25±0.009b0.49±0.006c19.01±0.63c3.64±0.04b0.51±0.06bH-M0.83±0.009b0.27±0.014b0.56±0.008b21.00±0.68bc4.61±0.07a0.48±0.05cH-G1.09±0.013a0.42±0.018a0.67±0.010a21.35±0.71ab4.59±0.06a0.63±0.08a

B-E，不知火-黃化苗；B-M，不知火-花葉苗；B-G，不知火-綠葉苗；H-E，黃果柑-黃化苗；H-M，黃果柑-花葉苗；H-G，黃果柑-綠葉苗。表格內(nèi)同列中不同字母表示在5%水平上差異顯著，所有數(shù)據(jù)均為平均值及其標準誤。下同。

B-E， Shiranuhi-etiolated seedlings; B-M， Shiranuhi-multicoloured seedlings; B-G， Shiranuhi-green seedlings; H-E， Huangguogan-etiolated seedlings; H-M， Huangguogan-multicolored seedlings; H-G， Huangguogan-green seedlings. Values in each column with different letters are significantly different atP=0.05 level. The same as below.

表2黃化對黃果柑和不知火葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及丙二醛含量的影響

Table2Effect of etiolation on osmotic adjustment substance and MDA contents in leaves ofCitruscultivars of Huangguogan and Shiranuhi

幼苗Seedlings脯氨酸濃度Pro/(μg·g-1)丙二醛含量MDA/(nmol·g-1)可溶性糖含量SS/%可溶性蛋白含SP/(mg·g-1)B-E790.17±12.57a26.96±0.57a6.72±0.34a2.15±0.11aB-M782.45±11.51a21.84±0.19b5.94±0.37a1.82±0.09aB-G570.87±10.73b14.38±0.08c3.21±0.17b0.92±0.06bH-E701.61±8.06a26.47±0.57a6.37±0.36a2.08±0.11aH-M621.53±6.88b20.64±0.49b5.51±0.30b1.77±0.10aH-G527.79±5.33c14.78±0.41c3.14±0.19c0.84±0.07b

表3黃化對黃果柑和不知火光合色素含量的影響

Table3Effect of etiolation on the photosynthetic pigment contents ofCitruscultivars of Huangguogan and Shiranuhi

幼苗Seedlings葉綠素aChla/(mg·g-1)葉綠素bChlb/(mg·g-1)類胡蘿卜Car/(mg·g-1)葉綠素a+bChl(a+b)/(mg·g-1)葉綠a/bChla/b葉綠素(a+b)/類胡蘿卜素Chl(a+b)/CarB-E0.50±0.04b0.39±0.04b0.26±0.02b0.89±0.03c1.28±0.03c3.42±0.04cB-M0.56±0.07b0.41±0.05b0.27±0.02b0.97±0.03b1.37±0.03b3.59±0.04bB-G1.86±0.11a0.73±0.09a0.43±0.03a2.59±0.09a2.55±0.05a6.02±0.08aH-E0.58±0.04b0.42±0.04b0.29±0.03b1.00±0.02c1.38±0.02c3.45±0.03cH-M0.71±0.06b0.45±0.04b0.32±0.02b1.16±0.05b1.58±0.05b3.63±0.06bH-G2.22±0.09a0.84±0.09a0.52±0.03a3.06±0.10a2.64±0.05a5.88±0.07a

2.4不同黃化程度對黃果柑和不知火光合作用的影響

由表4可知，不同黃化程度的黃果柑、不知火葉片光合參數(shù)存在一定的差異，葉片黃化對凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)的影響較大，呈現(xiàn)綠葉苗(G)>花葉苗(M)>黃化苗(E)；B-E、H-E、H-M的凈光合速率均為負值，分別為-1.296、-1.048和-1.044 μmol·m-2·s-1，顯著低于B-G和H-G；不知火、黃果柑綠葉苗暗呼吸速率分別為-1.90、-1.45 μmol·m-2·s-1(表5)，均低于黃化葉片的凈光合速率，表明黃化葉片具有一定的光合能力，但光合能力較弱。

2.5凈光合速率與光合色素的相關(guān)性

Pn與光合色素的相關(guān)性見圖1，相關(guān)系數(shù)在0.589 9～0.794 7，Pn與不同色素含量及組成相關(guān)系數(shù)大小不同，Pn與Chl (a+b)/Car相關(guān)系數(shù)最大(0.794 7)，Pn與Car相關(guān)系數(shù)最小(0.589 9)，表明凈光合速率不僅與葉綠素含量有關(guān)，還與光合色素的組成有關(guān)。

2.6黃化對黃果柑和不知火葉綠素熒光特性的影響

由圖2可知，黃化苗葉綠素初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)、光化學猝滅系數(shù)(qP)和非光化學猝滅系數(shù)(NPQ)都顯著下降，黃化苗<花葉苗<綠葉苗，PSⅡ潛在活性(Fo/Fv)則與之相反，黃化苗>花葉苗>綠葉苗；不知火和黃果柑幼苗葉片F(xiàn)o、Fm、Fv、qP、NPQ均呈現(xiàn)黃化苗<花葉苗<綠葉苗，且差異顯著(P<0.05)；黃化苗和花葉苗的Fv/Fm均下降，黃化苗顯著低于綠葉苗，但花葉苗Fv/Fm下降程度較小。結(jié)果表明，黃果柑、不知火的光化學活性均受到葉片黃化的不同程度的抑制。

表4黃化對黃果柑和不知火光合作用氣體交換參數(shù)的影響

Table4Effect of etiolation on photosynthetic gas exchange parameters ofCitruscultivars of Huangguogan and Shiranuhi

幼苗Seedlings凈光合速率Pn/(μmol·m-2·s-1)氣孔導度Gs/(mol·m-2·s-1)胞間CO2濃度Ci/(μmol·mol-1)蒸騰速率Tr/(mmol·m-2·s-1)B-E-1.296±0.061c0.158±0.010b315.050±5.04c3.237±0.033bB-M3.716±0.059b0.177±0.090b347.050±6.31b3.298±0.041bB-G7.441±0.063a0.231±0.012a399.481±6.35a3.675±0.047aH-E-1.048±0.028b0.042±0.001c294.371±3.08b2.493±0.047cH-M-1.044±0.024b0.057±0.001b414.642±5.42a2.715±0.033bH-G6.243±0.059a0.112±0.002a429.178±5.04a3.418±0.047a

表5黃果柑和不知火綠葉苗的光響應參數(shù)

Table5Light response parameters of green seedlings ofCitruscultivars of Huangguogan and Shiranuhi

幼苗Seedlings表觀量子率AQY/(mol·mol-1)最大凈光合速率Pnmax/(μmol·m-2·s-1)光飽和點LSP/(μmol·m-2·s-1)光補償點LCP/(μmol·m-2·s-1)暗呼吸速率Rd/(μmol·m-2·s-1)R2B-G0.0557.64250846-1.900.9938H-G0.0358.45765232-1.450.9988

圖1 凈光合速率與葉綠素含量的相關(guān)性Fig.1 Correlation coefficients between net photosynthetic rate (Pn) and pigment contents

3 討論

綠色植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成主要依賴于光合作用固定CO2合成有機物，光合作用的強弱直接決定了生物產(chǎn)量和經(jīng)濟產(chǎn)量的高低[19]。本試驗表明，葉片黃化抑制了黃果柑、不知火幼苗的正常生長，黃化苗的生長量顯著低于綠葉苗，雖然不知火黃化苗、花葉苗和綠葉苗株高分別大于黃果柑，但幼苗根長均小于黃果柑，說明葉片黃化對不同柑橘品種的根長、株高的影響存在一定的差異。

Campos等[20]研究發(fā)現(xiàn)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Pro和SS的積累增加，有助于清除植株體內(nèi)的活性氧，避免細胞膜質(zhì)過氧化。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累是清除活性氧、維持生物膜結(jié)構(gòu)和功能正常而采取的一種有效防御措施[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃化對黃果柑、不知火葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響存在差異，從增長幅度看，SP>SS>Pro。黃化苗MDA含量均顯著升高，表明葉片黃化導致活性氧物質(zhì)的積累，黃化幼苗可能存在細胞膜質(zhì)過氧化作用。同時，不知火、黃果柑自身也可能存在一種對葉片黃化的應答調(diào)控機制，但不同品種存在一定的差異，這有待進一步研究。

光合作用是植物有機物質(zhì)積累、生長發(fā)育的基礎(chǔ)，葉片光合效率與自身因素如葉綠素含量、葉片厚度、葉片成熟程度密切相關(guān)[22]，又受光照強度[23]、氣溫、空氣相對濕度、土壤含水量[24-25]等外界因子影響。本研究發(fā)現(xiàn)，黃化苗葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量顯著降低，可能是因為葉片黃化導致脂質(zhì)過氧化作用，造成葉綠體結(jié)構(gòu)和葉綠素合成前體遭到了破壞，進而影響了光合色素的合成或?qū)е鹿夂仙亟到狻Ｔ谌~綠素含量基本一致的情況下，不同柑橘品種黃化苗凈光合速率存在較大差異，這也說明光合色素含量并不是影響光合效率的唯一因素[26]。相關(guān)性分析表明，Pn與Chl (a+b)/Car相關(guān)系數(shù)最大，所以Pn不僅與葉綠素含量有關(guān)，還與光合色素的組成有關(guān)。

同一品種不同類型間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)The bars with differnt lowercase letters showed significant difference (P<0.05)圖2 黃化對黃果柑和不知火葉綠素熒光特性的影響Fig.2 Effect of etiolation on chlorophyll fluorescence characteristics of Citrus cultivars of Huangguogan and Shiranuhi

研究還發(fā)現(xiàn)，黃果柑、不知火黃化苗的Pn均為負值，但都分別高于綠葉苗的暗呼吸速率，黃化顯著降低了葉片的Gs、Ci和Tr。另有研究發(fā)現(xiàn)，Tr的大小在一定程度上反映了植物調(diào)節(jié)水分損失的能力及適應逆境的能力[27]，表明葉片黃化抑制了黃果柑、不知火的光合作用，雖然黃化苗具有一定的光合能力，但凈光合速率為負值，光合作用所產(chǎn)生的能量遠不能滿足正常生長發(fā)育所需。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著葉綠素含量的下降，黃化苗、花葉苗Fo、Fm、Fv、qP和NPQ都顯著下降，說明黃化苗、花葉苗葉片將更多的光能用于光化學電子傳遞，但光合電子傳遞速率較低，大部分光能則要通過熱耗散途徑進行消耗，導致黃化苗光能利用效率和Pn顯著降低。Fv/Fm反映的是最大光化學效率，是判定光抑制的重要指標[28-29]，而黃化苗和花葉苗的Fv/Fm均出現(xiàn)下降，黃化苗顯著低于綠葉苗，但花葉苗Fv/Fm下降程度較小，說明葉片黃化對黃果柑、不知火幼苗造成明顯的光抑制，但Fv/Fm對葉片不完全黃化反應不靈敏，這與前人的研究結(jié)果一致[30-32]。

綜上所述，葉片黃化導致幼苗生物量、葉綠素含量及光合能力下降，葉片積累大量脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)參與滲透調(diào)節(jié)。雖然黃化苗具有一定的光合能力，但黃化苗的細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性遭到破壞，光合作用所產(chǎn)生的能量遠不能滿足正常生長所需，是黃化苗不能正常生長的重要原因。

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(責任編輯張 韻)

Effectofdifferentdegreesofetiolationongrowthandphotosynthesisofhybridcitrus

XIONG Bo1， YAN Qiaoqiao2， SUN Guochao1， QIU Xia1， YE Shuang1， LIAO Ling1， LUO Jinyu1， DAI Lin1， WANG Zhihui1，*

(1.CollegeofHorticulture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.SichuanEngineeringTechnicalCollege，Deyang618000，China)

In order to study the effect of different etiolation degrees onCitrusseedling growth and photosynthesis，Citruscultivars Huangguogan and Shiranuhi seedlings were used as the materials， to analyze the changes of seedling biomass， chlorophyll content， photosynthetic parameters and chlorophyll fluorescence characteristics of etiolated， multicoloured and green seedlings. The results showed that the normal growth ofCitruscultivars Huangguogan and Shiranuhi seedlings was inhibited by etiolation， and the growth of etiolated seedlings was significantly lower than that of green seedlings. The contents of free proline (Pro)， malondialdehyde (MDA)， soluble sugar (SS) and soluble protein (SP) were significantly increased in the leaves of etiolated seedlings. Seedling etiolation could significantly reduce the content of chlorophyll a， chlorophyll b， carotenoid and photosynthetic gas exchange parameters (stomatal conductance， intercellular CO2concentration， transpiration rate)， and change the composition ratio of the chlorophyll. Maximal photochemical efficiency (Fv/Fm)， photochemical quenching (qP)， and non-photochemical quenching (NPQ) of etiolated seedlings were significantly lower than those of green seedlings， but theFv/Fmof multicoloured seedlings was decreased slightly. This study indicated that seedling etiolation inhibited the normal growth and photosynthetic capacity ofCitrusseedlings.

Huangguogan; Shiranuhi; etiolation; seedlings; photosynthesis

S666.9

：A

：1004-1524(2017)09-1506-09

熊博，嚴巧巧，孫國超，等.不同黃化程度對雜柑幼苗生長及光合作用的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(9)： 1506-1514.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.12

2017-03-20

四川省科技廳項目(2016NZ0056)；四川省教育廳項目(14CZ0002)

熊博(1988—)，男，四川達州人，碩士研究生，主要從事果樹栽培理論與技術(shù)研究。E-mail: xiongbo200977@163.com

*通信作者，汪志輝，E-mail: wangzhihui318@126.com